Влияние структурных и физико-химических особенностей n,n′-тиокарбонил- и n,n′-сульфурилдиазолов на их антибактериальные свойства Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 579.26+547.541.52.77

ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРНЫХ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ N^'-ТИОКАРБОНИЛ-И N^'-СУЛЬФУРИЛДИАЗОЛОВ НА ИХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА1

© 2007 З.П. Белоусова2, Е.С. Селезнева3

Сравнение антибактериальной активности К,№-тиокарбонил- и К,№-сульфурилдиазолов в тестах на на Staphylococcus aureus показало, что К,№-тиокарбонилдиазолы достоверно сильнее ингибировали рост Staphylococcus aureus, чем их сульфурильные аналоги. Выявлена высокая корреляция между величинами дипольного момента, молекулярной массы, молекулярного объема и их антибактериальными свойствами. Обсуждается связь между способностью веществ контактировать с рецепторами на поверхности бактериальных клеток и их пространственной структурой и антибактериальной активностью.

Введение

Биологическая активность соединений зависит от стереохимических и некоторых физико-химических свойств, которые, как правило, определяют механизм их проникновения через мембраны в клетки. Не смотря на большое количество исследований в этой области, до сих пор нет однозначного ответа на вопрос, какие параметры являются наиболее важными в развитии биологического ответа [1-3, 5, 7]. Для проявления одних типов биологической активности необходимым требованием является объемность и трехмерная структура для других - планарность.

И планарные и трехмерные молекулы могут обладать избирательной токсичностью, что используется для получения высокоэффективных фармакологических препаратов и пестицидов. Особый интерес представляют собой гетероциклические азолы, которые являются основным структурным фрагментом многих биологически активных соединений, используемых в медицине и сельском хозяйстве.

1 Представлена доктором биологических наук О.Н. Макуриной.

2 Белоусова Зоя Петровна ([email protected]), кафедра органической химии Самарского государственного университета.

3 Селезнева Екатерина Сергеевна, кафедра зоологии, генетики и общей экологии Самарского государственного университета.

Антибактериальные свойства химических соединений складываются из способности контактировать с мембраной бактериальной клетки и преодолевать мембранный барьер, скорости связывания с мишенью и нарушать клеточный метаболизм, что и вызывает, в конечном счете, гибель бактериальной клетки. Несмотря на многочисленные синтезированные препараты, которые с успехом используются в фармакологической практике общие закономерности, определяющие эффективность антибактериальных свойств не изучены, что заставляет проводить синтез новых препаратов по принципу подобия, направляя усилия на снижение общей токсичности и усиления избирательного действия.

Между тем знание корреляций типа «структура-функция» не только бы облегчил поиск новых эффективных лекарственных средств, но позволил разобраться в механизмах возникновения резистентности прокариот ко многим известным антибактериальным препаратам при длительном их использовании

Целью нашего исследования является изучение влияния на антибактериальные свойства структуры и ряда физико-химических свойств некоторых производных азотсодержащих гетероциклов.

Материал и методы

Исследовали тиокарбонильные и сульфурильные производные имидазола, 1,2,4-триазола, бензимидазола и бензотриазола синтезированные согласно следующей схеме:

(СН3)з81М81(СНз)

Э'Э

АгН

а-а

С8СЦ

Аг81(СН3)3 1а^

802С12

АгС8Аг

11а^

Аг802Аг

Ша-с1

<?

N—г\

О

N

N

N

Ь

а

с

а

Синтез К,№-тиокарбонилдиимидазола (1т)2С8 (11а), К,№-

тиокарбонилдитридазола (Тг)2С8 (11Ь), К,№-тиокарбонилдибензимидазола

(BzIm)2CS (11с) и К,№-тиокарбонилдибензотриазола (BzTr)2CS (Ш) осуществляли через соответствующие силильные производные азолов реакцией с тиофосге-

ном. ^№-сульфурилдиимидазол (Im)2SO2 (IIIa), N,N'-сульфурилдитриазол

(Tr)2SO2 (IIIb), N,N'-сульфурилдибензмидазол (BzIm)2SO2 (IIIc), N,N'-

сульфурилдибензотриазол (BzTr)2SO2 (IIId) получали также через силильные производные азолов реакцией с хлористым сульфурилом.

Все синтезированные соединения (IIa-d) и (IIIa-d) были очищены и высушены, их физико-химические характеристики совпали с описанными в литературе данными.

Антибактериальная активность оценивалась по способности веществ ингибировать рост Staphylococcus aureus, для этого соединения использовали в виде спиртовых растворов в следующих концентрациях: 0,001; 1; 10 мг/мл. Растворителем служил 20% изопропиловый спирт.

Испытания антибактериальной активности проводили в соответствии с «Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков». В качестве культуральной среды использовали мясопептонный агар (на 1000 мл мясопеп-тонного бульона 15 г агар-агара, 3 г двузамещенного фосфорнокислого натрия, рН=7,4). Расплавленную среду разливали по 20 мл в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности.

Суспензию бактерий готовили из чистой 20-ти часовой культуры Staphylococcus aureus, выращенной на бульонной культуре и разведенной изотоническим раствором хлористого натрия до мутности оптического стандарта ГПСК имени Л.А. Тарасевича на 10 единиц. Затем полученную взвесь разводили в 10 раз. Таким образом, в культуре содержалось 5 • 109 микробных клеток в 1 мл взвеси. Полученную суспензию в объеме 1 мл наносили на поверхность среды, равномерно втирали микробиологическим шпателем и подсушивали в течение 10 мин.

Тест-диски, пропитанные растворами исследуемых веществ, а также контрольные тест-диски, с помощью пинцета накладывали на поверхность засеянной золотистым стафилококком питательной среды на расстоянии 2 см от края чашки.

Всего было 7 повторов. Чашки, в которых располагались тест-диски с веществами в разных концентрациях, помещали в термостат сразу после наложения дисков и инкубировали в течение 24 час.

Контролем служили тест-диски, пропитанные растворителем. Кроме того, был поставлен дополнительный (активный) контроль. Для этого тест диски пропитывали спиртовыми растворами разных концентраций исходных азолов (имидазол, триазол, бензимидазол и бензотриазол) в тех же концентрациях, что и исследуемые синтезированные диазолы.

Подсчет результатов производили на чашках, перевернутых кверху дном и помещенных на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 15о. Измеряли диаметр зоны ингибирования роста культуры при помощи штангенциркуля. Размер тест-диска был равен б мм.

С помощью полного двухфакторного дисперсионного анализа оценивали влияние строения и концентрации соединений на рост Staphylococcus aureus. С помощью корреляционного анализа оценивали связь между антибактериальной активностью соединений и их физико-химическими параметрами [4].

Физико-химические параметры: молекулярную массу, молекулярный объем, липофильность, величины дипольного момента и энергии гидратации для соединений I-III a-d, также исходных a-d рассчитали с помощью программы «HyperChem» (см. табл. 1).

Таблица 1

Физико-химические параметры II-III(a-d), рассчитанные с помощью программы «HyperChem»

Соединение Мол. масса (г/моль) Мол. объем (А3) LogP Дип.момент (дебай) Энерг. гидратации (ккал/моль)

II a 178,21 511,28 -0,59 1,30 -9,33

III a 198,2 527,98 -0,26 0,99 -9,59

II b 180,19 493,67 0,51 0,20 -10,43

III b 200,17 508,3 -0,35 1,06 -11,77

II c 278,33 751,95 -0,07 2,16 -7,93

III c 298,32 773,03 -2,05 2,84 -8,32

II d 280,31 733,24 1,39 3,62 -16,06

III d 300,29 752,32 1,23 6,71 -14,24

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования показали, что изопропиловый спирт, используемый как растворитель (тиокарбонильные соединения плохо растворимы в воде), обладает слабой антибактериальной активностью (см. табл. 2)

Таблица 2

Анализ способности ^№-тиокарбонил- и ^№-сульфурилдиазолов ингибировать рост Staphylococcus aureus

Исследуемые соединения Диаметр зоны ингибирования роста Staphylococcus aureus при воздействии спиртовых растворов соединений разной концентрации (мм)

0,001 мг/мл 1 мг/мл 10 мг/мл

изопропиловый спирт 7,1 7,2 7,1

а 6,5 7,4 8,4

IIa 6,8 8,7 10,0

IIIa 6,7 7,6 9,6

b 6,4 6,7 7,4

Продолжение таблицы 2

IIb 6,8 7,6 8,4

IIIb 6,7 6,9 7,5

c 6,5 8,3 10,1

IIc 6,7 8,2 11,8

IIIc 6,4 7,9 11,5

d 6,6 8,1 11,1

IId 6,8 9,4 12,6

IIId 6,8 8,1 11,9

Все проанализированные соединения проявили слабую антибактериальную активность, причем в концентрации 0,001 мг/мл их способность ингибировать рост Staphylococcus aureus оказалась ниже, чем у изопропилового спирта. Таким образом, в низких концентрациях соединения (а-d) и Il-III(a-d) обладали слабыми протекторными свойствами, снижая токсическое действие изопропилового спирта. Это совпадает с результатами, полученными нами ранее для нитропроизводных имидазола [6].

В более высоких концентрациях, исследованных нами, все соединения проявили более высокую антибактериальную активность (см. таблица 2). Как видно из представленных результатов К,№-тиокарбонил- и N^N'-сульфурил-диазолы II-III (a-d) оказались токсичнее исходных азолов (a-d) (p<0,05).

Анализируя антибактериальную активность азолов в высокой концентрации (10 мг/мл) мы обнаружили, что тиокарбонильные производные: N^N'-тиокарбо-нилдиимидазол (Im)2CS (IIa), К,№-тиокарбонилдитридазол (Tr)2CS (IIb),

К,№-тиокарбонилдибензимидазола (BzIm)2CS (IIc) и К,№-тиокарбонилдибензо-триазол (BzTr)2CS (IId)), К,№-сульфурилдибензотриазол (BzTr)2SO2 (IIId) получали достоверно (p<0,05) сильнее ингибируют рост Staphylococcus aureus, чем их сульфурильные аналоги: N^N'-сульфурилдиимидазол (Im)2SO2 (IIIa), К,№-сульфурилдитриазол (Tr)2SO2 (IIIb), К,№-сульфурилдибензмидазол

(BzIm)2SO2 (IIIc), К,№-сульфурилдибензотриазол (BzTr)2SO2 (IIId).

Построив с помощью программы «HyperChem» пространственные модели анализируемых азолов мы обнаружили, что все тиокарбонильные производные представляют собой планарные структуры, как и их исходные азолы. На рис.2 в качестве примера обнаруженной зависимости представлены тиокарбонильное и сулфурильное производные бензотразола.

Н

Н

\\

О

А

В

Рис. 2. Пространственная структура А - М,№-тиокарбонилдибензотриазола,

В - М,№-сульфурилдибензотриазол.

По видимому сульфурильные производные за счет электростатических свойств группы «802», потеряли планарность, так как планарное кольцо одного азола, находятся в плоскости под углом к плоскости второго планарного кольца, создавая больший объем молекулы, чем у тиокарбонильных производных (см. рис.2)

Таким образом, видно, что химическая группа, которая формирует и определяет пространственную структуру молекулы диазола, определяет и антибактериальную активность соединения. Можно отметить еще одну особенность: все диазолы, в состав которых входило бензольное кольцо (III <1, III с, II <1, II с), обладают достоверно более высокой антибактериальной активностью, чем диазолы не имеющих это кольцо (III а ,Ш Ь, II а, II Ь)

Проведенный полный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что антибактериальная активность исследуемых соединений достоверно (р<0,05) убывает в следующих рядах:

Анализ связи между антистафилококковой активностью и физикохимическими параметрами исследованных соединений выявил высокую положительную корреляцию с рядом параметров. Так коэффициент корреляции между антибактериальной активностью и молекулярной массой составляет 0,8, а с молекулярным объемом и величиной дипольного момента - 0,9 и 0,7, соответст-

(ВеТг)2802 III а (ВеТг)2С8 II а

> (Ве!ш)2802 >

III с

> (Ве!ш)2С8 >

II с

(^^02 > (Тг)2802

III а III Ь

Ошда > (Тг)2С8

II а II Ь

венно. Мы не обнаружили корреляции между токсичностью П-Ш(а-а) и величиной энергии гидратации, а также липофильности (LogP). С нашей точки зрения обнаруженные корреляции свидетельствуют в пользу того, что исследованные соединения проникают внутрь клеток через специализированные рецепторы, наподобие имидазолин-гуанидиновых, обнаруженных у эукариот [8].

Изменение пространственного расположения отдельных фрагментов молекулы относительно ее оси приводит к изменение ее конформаций, например делая молекулу менее планарной. В природе планарность молекулы играет исключительную роль при взаимодействии его с рецепторными белками. Например, способность ацетилхолина к стимулированию одного из двух холинорецепторов определяется его нахождением в двух различных конформациях, а холинолитиче-ский эффект различных атропинподобных веществ во многом определяется кон-формационным сходством с медиатором - антагонистом [2].

Имидазол (а), 1,2,4-триазол(Ь), бензимидазол(с) и бензотриазол(а), использованные нами в эксперименте, относятся к планарным. Тиокарбонильные производные К,№-тиокарбонилдиимидазол (!ш)2С8 (Па), К,№-тиокарбонилдитридазол (Тг)2С8 (ПЬ), К,№-тиокарбонилдибензимидазол (Ве!ш)2С8 (Пс) и К,№-тиокарбо-нилдибензотриазол (ВеТг)2С8 (Ш), сохраняют также планарность. Однако не планарные производные: К,№-сульфурилдиимидазол (Im)2S02 (Ша),

К,№-сульфурилдитриазол (Tr)2S02 (ШЬ), К,№-сульфурилдибензмидазол

(В2!т)^02 (Шс) и К,№-сульфурилдибензотриазол (BzTr)2S02 (ПИ) - также способны контактировать с имидазолиновыми рецепторами, однако контакт по-видимому более затруднен стерически. Возможно в удержании вещества рецептором играет роль и молекулярный объем, который у тиокарбонильных производных П(а-ё) меньше, чем у сульфурильных Ш(а-а). Нельзя не учитывать и особенности электронного строения тиокарбонильной группы, которая является более реакционно-способной по сравнению с сульфурильной. Облегчая контакт с рецептором, она также вносит вклад в негативное изменение метаболизма, что мы и наблюдали в нашем случае.

Список литературы

[1] Альберт, А. Избирательная токсичность / А. Альберт. - М.: Медицина, 1989. - Т.2. - 428 с.

[2] Голиков, С.Н. Стереоспецифичность действия лекарственных веществ / С.Н. Голиков, С.Г. Кузнецов, Э.П. Зацепин. - Л.: Медицина, 1975. - 185 с.

[3] Закусов, В.В. Общая характеристика действия лекарственных средств / В.В. Закусов, И.Р. Комиссаров, В.Н. Синюхин // Клиническая фармакология. - М.: Медицина, 1978. - С. 35-61.

[4] Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

[5] Оксенгендлер, Г.И. Яды и организм / Г.И. Оксенгендлер. - Санкт-Петербург: Наука, 1991. - 317 с.

[6] Селезнева, Е.С. Изучение механизмов биологической активности 2, 2'-диимидазола и его нитропроизводных / Е.С. Селезнева, З.П. Белоусова, Е.И. Теньгаев // Известия СНЦ РАН, 2003, спец. вып. «Актуальные проблемы экологии», В.2.- С. 326-333.

[7] Barratt, M.D. Prediction of toxicity from chemical structure / M.D. Barratt // Cell Biology and Toxicology. - 2000. - V.16. - P. 1-13.

[8] Visualiztion jf multiple imidazoline/guanidinium-receptiven sites / S.M. Lanier [et.al.] // J. Biol. Chem. - 1993. - V. 268 (210). - P. 16047-16051.

Статья поступила в редакцию 25/IX/2006; в окончательном варианте - 26/XII/2006.

EFFECT OF STRUCTURAL AND PHYSICO-CHEMICAL FEATURES OF N,N’-THYOCARBONYL-AND N,N-SULPHURILDIAZOLES ON THEIR ANTIBACTERIAL ACTIVITIES4

© 2006 Z.P. Belousova5, E.S. Selezneva6

Comparing of N,N’-thyocarbonyl- and N,N-sulphurildiazoles antibacterial activity on Staphylococcus aureus demonstraes that N,N’-thyocarbonyldiazoles inhibited the growth of microbe-biotest markedly stronger than sulphuril analogs. The high-level correlation among the dipole moment, molecular weight, molecular volume and their antibacterial features is shown. The possible connection of substances ability to contact the membrane receptors, antibacterial activity and their spatial structure are discussed.

Paper received 25/IX/2006. Paper accepted 26/XII/2006.

4 Communicated by Dr. Sci. (Biology) Prof. O.N. Makurina.

5 Belousova Zoya Petrovna, Dept. of Biochemistry, Samara State University, Samara, 433011, Russia.

6 Selezneva Ekaterina Sergeevna, Dept. of Zoology, Genetics and General Ecology, Samara State University, Samara, 443011, Russia.