CC BY
22
ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
УДК 582.477.082.26-053.13
Хвойные бореальной зоны. 2019. Т. XXXVII, № 5. С. 367-371
ВЛИЯНИЕ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ ЗИГОТИЧЕСКИХ ЗАРОДЫШЕЙ НА СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА СИБИРСКОГО В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
Е. Н. Аёшина, Н. А. Величко, М. Н. Кузьмичева
Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, 660037, г. Красноярск, просп. им. газ. «Красноярский рабочий», 31
Е-mail: enaesh@mail.ru
Объектам исследования были зиготические зародыши можжевельника сибирского - Juniperus sibirica Burgsd., произрастающего на территории дендрария Сибирского государственного технологического университета, стационара Института леса СО РАН «Погорельский бор», Богучанском районе, в Якутии пойма р. Витим. Целью работы являлось изучение закономерностей влияния стадий развития зиготических зародышей на формирование эмбриогенного каллуса. Были использованы пять групп семян с различными стадиями развития зародышей. Для индукции эбриогенного каллусса необходим был подбор оптимальной питательной среды и соотношения гормонов. Изолированные зиготические зародыши можжевельника сибирского в стерильных условиях вводили на агаризованные среды с минеральным составом по Мурасиге-Скугу, Шенке-Хильдебрандту, Уайту, DCR1 и разными концентрациями гормонов. Культивирование проводили при температуре 25±1 °С как на умеренном свету, так и в темновых условиях. Пролиферация каллусной массы происходила на агаризованной питательной среде DCR1 с добавлением гормонов ауксиновой природы: 2,4-Д и 6-БАП в различных концентрациях и соотношениях.
На соматический эмбриогенез значительное влияние оказывает генетическая предрасположенность материнских растений формировать эмбриогенный каллус. На питательной среде культивировали экспланты: первая группа, полученная от растений, произрастающих на территории дендрария, вторая группа из Погорельского бора, третья группа из Якутии. На 25-30 сутки культивирования каллусагенез составлял 30 % для третей группы, 45 % для второй группы и 90 % для первой группы. Цитологическое исследование каллусной ткани, полученных образцов, показало наличие единичных образцов каллуса эмбриогенного типа у первой группы.
Ключевые слова: Juniperus sibirica В., можжевельник сибирский, соматические, зиготические зародыши, стратификация, эмбриогенез, культивирование in vitro.
Conifers of the boreal area. 2019, Vol. XXXVII, No. 5, P. 367-371
INFLUENCE OF THE STAGES OF THE DEVELOPMENT OF ZYGOTIC BERDS ON SOMATIC EMBRIOGENESIS OF JUNIUM JINIVER OF SIBERIAN IN CULTURE IN VITRO
E. N. Aeshina, N. A. Velichko, M. N. Kuzmicheva
Reshetnev Siberian State University of Science and Technology 31, Krasnoyarsky Rabochy Av., Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation E-mail: enaesh@mail.ru
The objects of the study were zygotic embryos of juniper Siberian - Juniperus sibirica Burgsd., growing on the territory of the arboretum of the Siberian state technological University, the hospital of the Institute of forest SB RAS "Pogorelsky Bor", Boguchansky district, in Yakutia floodplain R. Vitim. The aim of the work was to study the regularities of the influence of the stages of development of zygotic embryos on the formation of embryogenic callus. Five groups of seeds with different stages of embryo development were used. For the induction brigandage calluses necessary was the selection of the optimal nutrient medium and the ratio of hormones. Isolated zygotic embryos of Siberian juniper in sterile conditions were imposed on agar media with mineral composition in the medium-Skoog, Shenk-Hildebrandt, white, DCR1 and different concentrations of hormones. Cultivation was carried out at a temperature of 25±1 °C both in moderate light and in dark conditions. Proliferation of callus mass occurred on agar nutrient medium DCR1 with the addition of hormones auxin nature: 2,4-D and 6-BAP in different concentrations and ratios.
Аёшина Е. Н., Величко Н. А., Кузьмичева М. Н. Влияние стадий развития зиготических зародышей ...
Somatic embryogenesis is significantly influenced by the genetic predisposition of maternal plants to form embryogenic callus. Explants were cultivated on the nutrient medium: the first group obtained from plants growing on the territory of the arboretum, the second group from the Pogorelsky forest, the third group from Yakutia. On the 2530th day of cultivation, callusogenesis was 30 % for the third group, 45 % for the second group and 90 % for the first group. Cytological study of callus tissue samples showed the presence of single samples of embryogenic type of callus in the first group.
Keywords: Juniperus sibirica B., Siberian juniper, somatic, zygotic embryos, stratification, embryogenesis, in vitro cultivation.
Соматический эмбриогенез - это процесс бесполого (или вегетативного) размножения, который приводит к формированию зародыша из соматической клетки. Соматические зародыши являются аналогами зиготических, они способны к прорастанию и формированию растений-регенерантов. Соматический эмбриогенез является одним из сложных, но перспективных направлений в биотехнологии микроклональ-ного размножения в культуре in vitro.
Первое упоминание о соматическом эмбриогенезе хвойных видов было сделано в конце 70 - начале 80 гг. прошлого века. Авторы описали «эмбриоподобные структуры» неспособные к дальнейшему развитию в культуре клеток Pinus banksiana, Picea glauca. Только спустя несколько лет, из незрелых зиготоческих зародышей Pice abies были получены зрелые соматические зародыши, способные к прорастанию. Этот первый успех привлек внимание многих исследователей [1; 2]. К настоящему моменту соматические зародыши и растения-регенеранты хвойных получены у 16 видов рода Pinus, у 11 видов рода Picea, у 4 видов и 2 гибридов рода Abies, у 4 видов и 2 гибридов рода Larix, а также у Pseudot sugamenziesii [3; 4]. Источником соматических клеток для индукции соматического эмбриогенеза у хвойных могут служить мегагаме-тофиты, зрелые и незрелые зародыши, семядоли, ги-покотили, хвоя. Несмотря на то, что некоторые исследователи считают зародыши наиболее перспективными для получения соматического эмбриогенеза у хвойных [5; 6], продолжаются эксперименты по получению соматических зародышей и растений-регенерантов из эксплантов, полученных со зрелых деревьев, например, из вегетативных побегов. Так, южноафриканскими исследователями в 2005 году была продемонстрирована возможность получения растений-регенерантов из сегментов вегетативных растений зрелых деревьев Pinus patula. Значимость получения соматического эмбриогенеза из различных частей зрелых деревьев, достигших репродуктивного возраста, заключается в возможности оценить генетический потенциал размножаемого дерева [5; 6].
Несмотря на стремительное развитие соматического эмбриогенеза у хвойных в последние годы, регенерация растений путем соматического эмбриогенеза все еще остается проблематичной для ряда видов. Критическим моментом является процесс созревания соматических зародышей, поскольку он влияет на их жизнеспособность, и особенно на способность прорастать и продуцировать нормальные растения-реге-неранты [3].
Индустриальное получение и коммерческое развертывание эмбриогенного разнообразия в культуре у хвойных находится пока еще на ранней стадии.
Однако на сегодняшний день компания лесной биотехнологии Cell For (Канада) занимает лидирующее положение в коммерческом производстве посадочного материала хвойных пород путем соматического эмбриогенеза. Компания продала 6 млн. проростков сосны, полученных путем соматического эмбриогенеза в США в 2006 г. и 27 млн в 2007 г. Имеются и другие компании и организации активные в данной области - FCBA (Франция), Gen For (Чили), Horizon2 (Новая Зеландия) [5-13].
В отличие от цветковых растений, соматический эмбриогенез у хвойных видов является многоступенчатым процессом. У многих хвойных видов в условиях культуры in vitro он до сих пор не обнаружен [14]. Индукция соматического эмбриогенеза происходит только из молодых тканей, таких как незрелые зиго-тические зародыши. Более того, качество полученных соматических зародышей и их конверсионный уровень, определенный как способность зародыша генерировать функциональный корень и побеги, строго зависит от генотипа растения-донора [1-5].
Процесс соматического эмбриогенеза можно разделить на несколько стадий, характерных для всех изученных видов хвойных: инициация (индукция), пролиферация, созревание соматических зародышей, прорастание соматических зародышей и получение растений-регенерантов [1].
Инициация эмбриональной массы может происходить из незрелых (у большинства хвойных) и зрелых зародышей (в основном у ели) [4], гипокотилей, семядолей, хвои, мегагаметофитов, сегментов вегетативных побегов на твердых и полутвердых средах. В качестве гормональных добавок для инициации эмбрио-генной ткани у большинства хвойных, как правило, используются ауксины в сочетании с цитокининами или только цитокинины (для пихты Abiesalba) [1].
Помимо генотипа, на формирование эмбриональ-но-суспензорной массы влияет также стадия развития экспланта, вводимого в культуру, что особенно важно при работе с зиготическими зародышами [1].
В зависимости от вида и генотипа, эмбриогенная ткань становится видимой через несколько недель в культуре in vitro в темноте. В отличие от неэмбрио-генной ткани, которая часто имеет темное окрашивание, эмбриогенная ткань характеризуется как полупрозрачная масса незрелых соматических зародышей, часто называемая эмбрионально-суспензорной массой (ЭСМ) или волокнистым зародышем. Фон Адеркас с соавторами отмечают, что эмбриональная масса представляет собой довольно организованную ткань, не похожую на каллус [13]. Внутри эмбрионально-суспензорной массы на основе морфологии различается два типа клеток: маленькие, плотные цитоплаз-
Хвойные бореальной зоны. XXXVII, № 5, 2019
матические клетки - составляют эмбриональную головку волокнистого зародыша, и удлиненные клетки с большими вакуолями - формируют суспензор [13]. До сих пор не сложилось единого взгляда на механизм формирования эмбриональной массы из экс-плантов хвойных растений и, что еще более важно, на появление в ней соматических зародышей. Разными исследователями были предложены следующие механизмы формирования соматических зародышей:
- кливажная полиэмбриония путем умножения и «отпочкования» эмбриональных клеток (у сосны и пихты) [13];
- формирование соматических зародышей в результате деления клеток, располагающихся в суспен-зоре [14];
- формирование соматических зародышей в результате асинхронного деления отдельной клетки экспланта [1; 9; 10].
Подробное описание формирования эмбриональной массы (или «проэмбриональной массы» по терминологии авторов) было сделано Арнольдом с соавторами на примере рода Picea [13]. По их данным то-типотентные клетки делятся ассиметрично на две клетки и формируют полярную структуру, включающую удлиненную клетку - эмбриональную трубку и примыкающую к ней маленькую шарообразную клетку. С этого этапа и начинается формирование проэмбриональной массы. Маленькие, сферические клетки с плотной цитоплазмой, обладающие высокой мито-тической активностью, составляют эмбриональную массу. В результате ассиметричных делений большинства базально-расположенных клеток в эмбриональной массе происходит формирование слоя удлиненных клеток эмбриональных трубок, которые дифференцируются и формируют один слой суспензор-ных клеток. Таким образом, проэмбриональная масса (ПЭМ) проходит последовательные стадии ПЭМ I, ПЭМ II и ПЭМ III, в результате чего происходит увеличение числа клеток обоих типов и потеря полярности исходной структуры [1].
Пролиферация, или поддержание эмбриогенных культур проводится для накопления массы эмбрио-генной ткани на полутвердых или жидких средах с тем же составом, что и для индукции, но с пониженным содержанием сахарозы и уменьшенной концентрацией ауксина и цитокинина. Во время пролиферации эмбриональной массы ауксины и цитокинины стимулируют быстрое увеличение ее объема и, напротив, подавляют формирование зародыша. Культуры содержатся в темноте и регулярно пересаживаются на свежую питательную среду каждые 10-14 дней (на твердой среде) и 7 дней (на жидкой среде) [3-5].
Как индукция, так и пролиферация эмбриональной массы не требуют света, поэтому культуры выдерживаются в темноте, при температуре 24-25 °С [1].
В последние годы многими исследователями было показано, что ранние стадии соматического эмбриогенеза являются критическим моментом всего процесса [8-15].
У норвежской ели клетки внутри пролиферирую-щей эмбриогенной ткани могут проходить через три последовательные стадии развития, которые характеризуются различными клеточными агрегатами, опре-
деленными как проэмбриогенная масса (ПЭМ или PEM) I, ПЭМ II и ПЭМ III. ПЭМ I сформирована кластером маленьких вакуолизированных клеток, имеющих тенденцию к увеличению и вакуолизации. Подобные агрегаты, но с более чем одной вакуолью представляют ПЭМ II. На стадии ПЭМ III кластеры цитоплазматических клеток увеличиваются. После удаления ауксина и цитокинина формирование зародыша индуцируется от ПЭМ III и продолжается до применения абсцизовой кислоты (АБК) [8-10].
Созревание соматических зародышей - это процесс гистологической дифференциации незрелых (ранних) зародышей, в результате чего происходит формирование семядолей, зародышевого корешка и других органов и тканей, характерных для зрелого зародыша хвойных.
Одним из самых важных компонентов питательной среды в этот период является абсцизовая кислота (АБК), которая обеспечивает понижение содержания воды в пролиферирующих культурах [15]. Интересно отметить, что подобное явление наблюдается и при формировании зародыша хвойных in vivo, когда происходит резкое обезвоживание семян и теряется до 90 % воды. В этот период содержание АБК в семенах достигает максимального значения и вызывает затормаживание метаболических процессов и их переход в состояние покоя [1].
Созревание соматических зародышей проводится обычно на свету малой интенсивности.
Прорастание соматических зародышей и превращение в растение производится на базовой полутвердой среде свободной от растительных регуляторов роста, с пониженным содержанием сахарозы и, иногда, добавляется активированный уголь. Удлинение эпикотиля и появление хвои наблюдается в течение 12-16 недель и зависит от вида растения. После достижения желаемого размера, проростки переносятся в почву в теплицу для акклиматизации [8-10].
Таким образом, вся процедура соматического эмбриогенеза у хвойных растений продолжается около года. Однако, несмотря на кажущуюся сложность и длительность данного процесса, возможность получения большого количества селективного безвирусного материала может покрыть все издержки [3].
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В качестве объекта исследования использовался растительный материал - семена можжевельника сибирского, произрастающего на территории Красноярского края. Сбор материала (шишек) осуществляли с июля по октябрь 2013-2014 гг. на территориях дендрария Сибирского государственного технологического университета (пригород Красноярска, 56° с. ш., 92°40' в. д.), стационара Института леса СО РАН «Погорельский бор» (38-й км от г. Красноярска, 56°22'07.48'' с. ш. 92°57'17.95'' в. д.), в Богучанском районе Красноярского края. Манипуляции проводили с шишками (шишкоягодами) второго года созревания.
В ранних исследованиях были изучены стадий развития зародышей можжевельника сибирского в зависимости от срока сбора шишек и места произрастания [16]. Целью данной работы было выявить закономер-
Аёшина Е. Н., Величко Н. А., Кузьмичева М. Н. Влияние стадий развития зиготических зародышей
ности влияния стадий развития зиготических зародышей на формирование эмбриогенного каллуса. В качестве материала для индукции соматического эмбриогенеза были взяты семена Juniperus sibirica B. на разных стадиях созревания шишкоягод. Всего было выделено пять групп: первая группа имела стадию развития семян глобулярную, вторая группа семян -сердечковидную, третья - торпедовидную, четвертая группа стадию инициации семядоль и последняя группа стадию зрелого зародыша. Отобранные семена, извлеченные из шишкоягод, поверхностно стерилизовались в 5 % растворе диацида в течение 5 минут. После 3-х кратной промывки в дистиллированной воде, зародыши извлекались из мегагаметофитов в стерильных условиях, помещались в чашки Петри и затем переносились на питательную среду.
Для инициации эмбриогенного каллуса можжевельника сибирского использовались среды с минеральным составом по Мурасиге-Скугу, Шенке-Хильдебрандту, Уайту, Гамборгу, DCR1 с добавлением мезоинозита 0.1 г/л, казеина 0,1 г/л, аскорбиновой кислоты 0,1-0,4 г/л, L-глутамина 0,5 г/л, сахарозы 30 г/л и агара 7 г/л. В качестве регуляторов роста использовались следующие гормоны 2,4-Д 2-5 мг/л и 6-БАП 1 мг/л. Среды автоклавировались при температуре 121 °С, давлении 110 кПа в течение 20 мин. В каждой колбе культивировалось по 10 зародышей на 25 мл питательной среды в темноте и при умеренном освещении.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Культивирование зародышей можжевельника сибирского в стадии зрелого зародыша, проводили на пяти безгормональных средах, наблюдали морфогене-тическую реакцию только на трех питательных средах. На питательной среде с минеральным составом по Гамборгу, 5 % эксплантов отреагировало формированием не нормальных проростков. На питательной среде Уайта иDCR1 наблюдалось позеленение семядолей на 25-30 сутки кудьтивирования.
В результате предварительных проведенных экспериментов по культивированию изолированных зародышей можжевельника сибирского на различных стандартных средах наиболее перспективными оказались среды Уайта и DCR1. Культивирование глобулярных зародышей на среде DCR1 и Уайта без добавления гормонов привело к 100 % гибели эксплантов. На следующем этапе зародыши культивировали на средах DCR1 и Уайта с добавлением 2,4-Д 2 мг/л, что приводило к каллусогенезу в 75 % эксплантов на среде DCR1 и полной гибели эксплантов на среде Уайта. Полученные результаты, можно было предположить, так как среда Уайта является низкосолевой, и оказывает неблагоприятное воздействие на незрелые зародыши можжевельника сибирского, которые нуждаются в более усиленном питании. Полученный каллус имел белый цвет. Цитологические исследования каллусной ткани показали, что это не эмбриогенный каллус.
В последующих экспериментах экспланты со второй по четвертую стадию развития культивировали на среде DCR1 с добавлением 2,4-Д 2 мг/л. Полученные результаты показали, что каллусогенез наблюда-
ется на всех эксплантах. Процент каллусогенеза варьируется от 55 % до 82 % в зависимости от стадии развития зародышей. Наиболее высокий процент каллусогенеза наблюдался у эксплантов, находящихся в стадии инициации семядолей (см. рисунок). Цитологические исследования каллусной ткани показали, что это не эмбриогенный каллус. В последующих экспериментах использовали зародыши можжевельника сибирского в стадии инициации семядолей и культивировали на среде БСЯ! с добавлен 2,4-Д 2 мг/л и 6-БАП мг/л при умеренном освещении.
90 -,
1 2 3 4 5
Стадии развития зародышей
Зависимость каллусогенеза от стадий развития зиготических зародышей можжевельника сибирского
Известно, что соматический эмбриогенез значительно зависит от генетической предрасположенности материнских растений формировать эмбриогенный каллус. На питательной среде культивировали экс-планты: первая группа, полученная от растений, произрастающих на территории дендрария, вторая группа из Погорельского бора, третья группа из Якутии. На 25-30 сутки культивирования каллусогенез составлял 30 % для третей группы, 45 % для второй группы и 90 % для первой группы. Цитологическое исследование каллусной ткани полученных образцов показало наличие единичных образцов каллуса эм-бриогенного типа у первой группы.
Полученные результаты согласуются с данными многих авторах утверждающих, что виды семейства Кипарисовых трудно поддаются манипуляциям с целью получения соматического эмбриогенеза. До настоящего времени отсутствуют сведения по получению растений-регенерантов из зрелых соматических зародышей.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Третьякова И. Н., Барсукова А. В. Сохранение генофонда хвойных видов Сибири при помощи соматического эмбриогенеза in vitro-современного метода биотехнологи // Хвойные бореальной зоны. 2010. Т. 27, № 1-2. С. 203-206.
2. Klimaszewska K., Smith D. R. Maturation of somatic embryos of pinusstrobus is promoted by a high concentration of gellan gum // Physiologia Plantarum. 1997. Т. 100, № 4. С. 949-957.
3. Klimaszewska K., Cyr D. R. Conifer somatic embryogenesis // Dendrobiology. 2002. Vol. 48, P. 31-39.
4. Klimaszewska K., Park Y.-S., Overton C. Optimized somatic embryogenesis in Pinusstrodus L. // Biol.-Plant. 2001. Vol. 37. P. 392-399.
Хвойные бореальной зоны. XXXVII, № 5, 2019
5. Cyr M., Wright, J., McDuff P., Perron A. Intra-familial sexual abuse: brother-sister incest does not differ from father-daughter and stepfather-stepdaughter incest // Child Abuse & Neglect. 2002. Т. 26, № 9. С. 957-973.
6. Saiepour M., Harry J. E. Characteristics of arcs during non-contact ignition from cold // Journal of Physics D: Applied Physics. 1991. Т. 24, № 3. С. 318-324.
7. Malabadi R. B., Mulgund G. S., Nataraja K. Efficient regeneration of vandacoerulea, an endangered orchid using thidiazuron // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2005. Т. 76, № 3. С. 289-293.
8. Белоруссова А. С., Третьякова И. Н. Особенности формирования соматических зародышей у лиственницы сибирской: эмбриологические аспекты // Онтогенез. 2008. Т. 39, № 2. С. 106-115.
9. Третьякова И. Н., Ижболдина М. В. Особенности роста эмбриогенного каллуса и получение соматических зародышей у кедра сибирского // Хвойные бореальной зоны. 2008. Т. 25, № 1-2. С. 71-77.
10. Третьякова И. Н., Ижболдина М. В. Индукция соматического эмбриогенеза у кедра сибирского // Лесоведение. 2009. № 5. С. 43-49.
11. Lelu M-A., Klimaszewska K., Charest P. J. Somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and needles of somatic plantlets of Larix // Can. J. For. Res. 1994. Vol. 24, № 1. P. 100-106.
12. Gutmann M., von Aderkas P., Label Ph., Lelu M. A. Effects of abscisic acid on somatic embryo maturation of hybrid larch // Journal of Experimental Botany. 1996. Т. 47, № 12. С. 1905.
13. Saly S., Joseph C., Corbineau F., Lelu M. A., Come D. Induction of secondary somatic embryogenesis in hybrid larch (larix x leptoeuropaea) as related to ethylene Plant Growth Regulation. 2002. Т. 37, № 3. С. 287-294.
14. Stasolla C., Loukanina N., Ashihara H., Yeung E. C. T. A. Ryrimidine nucleotide and nucleic acid synthesis in embryos and megagametophytes of white spruce (piceaglauca) during germination // Physiologia Planta-rum. 2002. Т. 115, № 1. С. 155-165.
15. Stasolla C. The effects of ascorbic acid on white spruce somatic embryogenesis. Canada: University of Calgary, 2002.
16. Зырянова Ю. В., Аёшина Е. Н. Изучение стадий развития зародыша можжевельника сибирского и их влияние на прорастание семян // Вестник Краснояр. гос. аграр. ун-та. 2013. № 3. С. 37-40.
REFERENCES
1. Tretyakova I. N., Barsukova A. V. Preservation of the gene pool of coniferous species of Siberia by somatic embryogenesis in vitro-modern method of biotechnology // Coniferous boreal zone. 2010, Vol. 27, No. 1-2, P. 203-206.
2. Klimaszewska K., Smith D. R. Maturation of somatic embryos of pinus strobus is promoted by a high concentration of gellan gum // Physiology Plantarum. 1997, Vol. 100, No. 4, P. 949-957.
3. Klimaszewska K., Cyr D. R. Conifer somatic embryogenesis // Dendrobiology. 2002, Vol. 48, P. 31-39.
4. Klimaszewska K., Park Y.-S., Overton C. Optimized somatic embryogenesis in Pinus strodus L. // Biol.-Plant. 2001, Vol. 37, P. 392-399.
5. Cyr M., Wright, J., McDuff P., Perron A. Intrafa-milial sexual abuse: brother-sister incest does not differ from father-daughter and stepfather-stepdaughter incest // Child Abuse & Neglect. 2002, Vol. 26, No. 9, P. 957-973.
6. Saiepour M., Harry J. E. Characteristics of arcs during non-contact ignition from cold // Journal of Physics D: Applied Physics. 1991, Vol. 24, No. 3, P. 318-324.
7. Malabadi R. B., Mulgund G. S., Nataraja K. Efficient regeneration of vanda coerulea, an endangered orchid using thidiazuron // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2005, Vol. 76, No. 3, P. 289-293.
8. Belorussova A. S., Tretyakova I. N. Features of formation of somatic embryos in Siberian larch: embryo-logical aspects // Ontogenesis. 2008, Vol. 39, No. 2, P. 106-115.
9. Tretyakova I. N., Izhboldina M. V. peculiarities of embryogenic callus growth and the obtaining somatic embryos of Siberian stone pine // Conifers of the boreal zone. 2008, Vol. 25, No. 1-2, P. 71-77.
10. Tretyakova I. N., Izhboldina M. V. Induction of somatic embryogenesis in Siberian cedar // Forestry. 2009, No. 5, P. 43-49.
11. Lelu M-A., Klimaszewska K., Charest P. J. Somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and needs of somatic plantlets of Larix // Can. J. For. Res. 1994, Vol. 24, No. 1, P. 100-106.
12. Gutmann M., von Aderkas P., Label Ph., Lelu M. A. Effects of abscisic acid on somatic embryo maturation of hybrid larch // Journal of Experimental Botany. 1996, Vol. 47, No. 12, P. 1905.
13. Saly S., Joseph C., Corbineau F., Lelu M. A., Come D. Induction of secondary somatic embryogenesis in hybrid larch (larix x leptoeuropaea) as related to ethylene Plant Growth Regulation. 2002, Vol. 37, No. 3, P. 287-294.
14. Stasolla C., Loukanina N., Ashihara H., Yeung E. C. T. A. Ryrimidine nucleotide and nuclear acid synthesis in embryos and megagametophytes of white spruce (picea glauca) during germination // Physiology Plantarum. 2002, Vol. 115, No. 1, P. 155-165.
15. Stasolla C. The effects of ascorbic acid on white spruce somatic embryogenesis. Canada: University of Calgary, 2002.
16. Zyryanova, Yu., Esina E. N. The study of the developmental stages of the embryo of Siberian juniper and their effect on seed germination // Bulletin of Krasnoyarsk State Agrarian University. 2013, No. 3, P. 37-40.
© Аёшина Е. Н., Величко Н. А., Кузьмичева М. Н., 2019
Поступила в редакцию 12.04.2019 Принята к печати 24.10.2019
