CC BY
19
References
1. Andrews T. Ketosis and fatty liver in cattle, In Practice, 1998, No. 20 (9), pp. 509-513.
2. Bell J. M. Nutrients and toxicants in rapeseed meal: A review, J. Anim, 2004, Sc. 58 (4), pp. 996-1010.
3. Deacon M. A. et al. Influence of jetsploging and extrusion on ruminai and intestinal disaffearance of canola and soybeans, J. Dairy Sei, 2015, No. 71 (3), pp. 745-753.
4. Fenwick G. R. The assessment of a new protein source Rapeseed, Proc. Nutr, 2014, Soc. 41, pp. 277-288.
5. Jennette K.W. Chromate metabolism in liver microsome, Biol. Trace Elem. Res., 1979, No. 1, pp. 55-62.
6. Ledgard S.F. et al. Effect of calcium supplementation on milk production and hypocalcaemia, Proceedings of the New Zealand Grassland Association, 2004, No. 66, pp. 69-74.
7. Lyons T.P. and Jacques K.A. Biotechnology in the feed industry: and beyond, In: Proceedings of Alltech's 10th Annual Symposium on Biotechnology in the Feed Industry, Nottingham University Press, 1994, 50 p.
8. Qiao G.H. et al. Effect of supplemental Bacillus cultures on rumen fermentation and milk yield in Chinese Holstein cows, J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berl.), 2010, No. 94(4), 429 p.
9. Vermorel M. et al. Nutritive value of rapeseed meal, Effects of individual glucosinolate, J. Sc. Food. Agr., 2015, No. 37 (12), pp. 1197-1202.
10. Akhmetzyanova F. K. Molochnaya produktivnost' korov pri optimizatsii kormleniya vvedeniem BVMK (KGAVM) v ratsiony (Milk productive capacity of cows during feeding optimization by inclusion of BVMK (KGAVM) into diets), Uchenye zapiski Kazanskoi GAVM im. N.E. Baumana, 2017, T. 230, No. 2, pp. 16-19.
11. Berezkina G. Yu. Effektivnost' ispol'zovaniya semyan l'na v proizvodstve iogurta (Efficiency of flax seeds in yogurt production), Rol' molodykh uchenykh-innovatorov v reshenii zadach po uskorennomu importozameshcheniyu sel'skokho-zyaistvennoi produktsii, Materialy Vserossiiskoi nauchno-prakticheskoi konferentsii «Rol' molodykh uchenykh-innovatorov v reshenii zadach po uskorennomu importozameshcheniyu sel'skokhozyaistvennoi produktsii», Izhevsk, 27-29 oktyabrya 2015 g., Izhevsk, FGBOU VO IzhGSKhA, 2015, pp. 109-111.
12. Gamko L. N. Vliyanie kompleksnoi kormovoi dobavki na produktivnost' i nekotorye morfobiokhimicheskie poka-zateli krovi doinykh korov (Influence of complex fodder supplement on productive capacity and some morphological and chemical parameters of blood of milk cows), Agrarnaya nauka, 2017, No. 3, pp. 18-19.
13. Gorelik O. A. Elementnyi sostav moloka korov pri primenenii prirodnykh kormovykh dobavok (Element composition of cows' milk under natural fodder supplements), Agrarnyi vestnik Urala, 2016, No. 6 (148), p. 5.
14. Kislyakova E. M. Ispol'zovanie kormovoi dobavki na osnove prirodnogo mestnogo syr'ya v kormlenii korov (Application of fodder supplements on the basis of natural local raw materials in cows' feeding), Aktual'nye problemy inten-sivnogo razvitiya zhivotnovodstva, sbornik nauchnykh trudov, Gorki, UOBGSKhA, 2016, Vyp. 19, pp. 78-83.
15. Kislyakova E. M. Kormovaya baza - zalog effektivnogo vedeniya molochnogo skotovodstva Udmurtskoi Respu-bliki (Fodder supply - the pledge of effective management of dairy cattle breeding in the Udmurt Republic), Uchenye zapiski Kazanskoi gosudarstvennoi akademii veterinarnoi meditsiny im. N.E. Baumana, 2014, T. 218, No. 2, pp. 135-140.
16. Kislyakova E. M. Molochnaya produktivnost' korov cherno-pestroi porody pri skarmlivanii energo-proteinovoi dobavki iz mestnogo prirodnogo syr'ya (Milk productive capacity of cows of black and white breed fed by energy-protein supplement from natural local raw materials), Nauchno obosnovannye tekhnologii intensifikatsii sel'skokhozyaistvennogo pro-izvodstva, Materialy mezhdunar. nauch.-prakt. konf. v 3-kh tomakh, Izhevsk, FGBOU VO IzhGSKhA, 2017, T. 3, pp. 55-58.
17. Plokhinskii N. A. Algoritmy biometrii (Biometry algorithms), pod. red. akad AN USSR B. V. Gnedenko, Moscow, Izd-vo Mosk. Gos. Un-ta, 1980, 150 p.
УДК 616-095[576.89: 579.8](57.085.2)
ВЛИЯНИЕ СОМАТИЧЕСКОГО ЭКСТРАКТА ИЗ ЛИЧИНОК АНИЗАКИД НА БАКТЕРИИ
О. И. Лазарева, аспирант; Т. Н. Сивкова, д-р биол. наук, доцент;
Т. С. Прохорова, канд. биол. наук, доцент,
ФГБОУ ВО Пермский ГАТУ,
ул. Петропавловская, 23, г. Пермь, Россия, 614990
E-mail: tatiana-sivkova@yandex.ru
Аннотация. Предыдущими исследованиями установлено, что белковые продукты, входящие в состав соматических и экскреторно-секреторных продуктов A. simplex, обладают выраженным кариопатическим действием, однако механизм такого действия исследован недостаточно полно. Его изучение необходимо для понимания патологических процессов, происходящих внутри поврежденной клетки, а также для успешных поисков борьбы с кариопатическими последствиями, что и определило актуальность проведенной нами работы. Сведений о механизмах взаимодействия соматических экстрактов гельминтов и микроорганизмов очень мало. Предполагается, что соматический экстракт из анизакид оказывает негативное влияние на мик-
роорганизмы за счет входящих в его состав белковых компонентов и метаболитов. Целью исследования являлось изучение влияния экстракта на культуры клеток разнообразных микроорганизмов как по морфологическим признакам, так и по устойчивости к факторам внешней среды. Экстракт готовили из личинок анизакид, извлеченных из замороженной путассу (Micromesistius poutassou), проверяли на стерильность и безвредность, определяли содержание белка. Для исследования использовали суточные культуры бактерий: микрококки Micrococcus sp., палочки Escherichia coli, Proteus vulgaris и Salmonella tiphimurium. При культивировании микроорганизмов с дисками, пропитанными антигенным экстрактом анизакид, в термостате при +37° С через 12 часов выявлена зона задержки роста у Micrococcus sp., E. coli и P. vulgaris. На рост бактерий палочек S.tiphimurium экстракт влияния не оказывал. Формирование выраженной зоны стерильности свидетельствует о наличии в составе белкового экстракта биологически-активных компонентов, обладающих бактериостатическим действием.
Ключевые слова: соматический экстракт, личинки анизакид, метаболиты, бактерии, бактериостатическое действие.
Введение. В отечественной и зарубежной литературе имеются сведения о бактериоста-тическом действии нематод на микрофлору кишечника. Установлено, что бактериостати-ческими и антимикробными свойствами обладают их экскреторно-секреторные и соматические продукты [6;16-18;25-27]. Также известно, что соматический экстракт Anisakis simplex L3 является многокомпонентным составом, который содержит различные устойчивые белки (антигены) и пептиды [4;12;13], вызывающие патологические изменения в эукарио-тических клетках [4]. Есть сообщение, что добавление гомогената Anisakis simplex L3 ограничивает бактериальный рост [24]. Использование культур клеток бактерий в качестве моделей для изучения влияния экстракта на про-кариотическую клетку не только доступно, недорого, но и не требует создания специальных дополнительных условий. Антимикробный эффект экстракта не изучен, поэтому полученные данные, возможно, окажутся полезными в поисках способов борьбы с патологическими последствиями воздействия гельминтов и микроорганизмов.
Целью нашего исследования являлось изучение степени активности антигенных компонентов соматического экстракта Anisakis simplex L3 в отношении культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов in vitro.
Методика. Культуры клеток Micrococcus sp., E. coli, P. vulgaris были спонтанно выделены из пищевых продуктов в лаборатории ГБУВК «Пермский ВДЦ» г. Пермь, S.tiphimurium №79 приобретен у ГИСК имени Л.А. Тарасевича, г. Москва.
Извлеченных из тушек рыбы личинок A.simplex 3-й стадии тщательно многократно промывали проточной водой, затем обрабатывали растворами антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и нистатин), стерильным физиологическим раствором и замораживали. После многократного замораживания и оттаивания личинки гомогенизировали, заливали стерильным забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:3 и экстрагировали белки при температуре +4°С в течение 18 часов. После центрифугирования гомогенной массы из гельминтов при 12000 оборотов в минуту полученный соматический экстракт хранили при температуре -18°С [3].
Далее для обнаружения контаминации бактериями, грибами и микоплазмами пробу экстракта из личинок анизакид высевали на МПА, МПБ и МППБ. Для выявления грибковой контаминации антиген высевали на агар Сабуро. На микоплазменную контаминацию пробу экстракта высевали на универсальную плотную среду для выделения микоплазм. При обнаружении хотя бы одного из контами-нантов партию экстракта считали нестерильной и в дальнейшей работе не использовали.
Для определения концентрации белка в полученном экстракте использовали биохимический полуавтоматический анализатор StatFax 1904+ (AWARENESS technology inc) и набор реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции, при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали фосфатно-солевой буферный раствор. Содержание белка составляло 3,6 г/л.
Приготовление антигенных дисков. Стерильным антигеном-экстрактом A.simplex
пропитывали диски из фильтровальной бумаги, которые затем использовали путем нанесения на чашки Петри с микробным газоном из культур Micrococcus sp. E.coli, P.vulgaris, S.tiphimurium. Микробный газон готовили из суточных культур микроорганизмов, выращенных на скошенном агаре (МПА), которые затем смывали (каждый в отдельности) стерильным физиологическим раствором с поверхности скошенного МПА. Пробирки закрывали пробкой, и слегка взбалтывая, получали смывы культуры. Приготовленные суспензии инкубировали 20-40 минут в термостате, при температуре +37°С. Определение количества микроорганизмов оценивали по степени мутности суспензии. Десять единиц соответствовало количеству микробных клеток в единице объема 5*10 . Для соблюдения бактериального стандарта мутности использовали отраслевые стандартные образцы ОСО 42-2885, разработанные Государственным институтом стандартизации и контроля имени Л. А. Тарасевича.
Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливали на строго горизонтальную поверхность. После заполнения чашки оставляли при комнатной температуре для застывания. Перед инокуляцией контролировали отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек. Приоткрытые чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Инокулюмы микроорганизмов использовали в течение 15 минут после приготовления. Их наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с пита-
С*г9
Рис.1. Зоны задержки роста культуры Micrococcus sp. вокруг диска с антигеном экстрактом A.simplex
тельной средой в объеме 1 - 2 мл, равномерно распределяли по поверхности покачиванием, выдерживали 15 минут для адаптации микроорганизмов, после чего избыток инокулюма удаляли. Не позднее, чем через 15 минут после инокуляции, на поверхность питательной среды наносили диски с антигеном-экстрактом A.simplex. Расстояние от диска до края чашки и между дисками оставляли 30-35 мм. Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре +37°С в течение 12 и 24 часов.
После окончания инкубации чашки помещали кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1 мм штангенциркулем или линейкой. При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста [1].
Результаты. В процессе культивирования культур микроорганизмов с соматическим экстрактом A.simplex L3 установили различное проявление его ингибирующей активности. При культивировании Micrococcus sp. в течение 12 часов вокруг бумажных дисков формировались зоны задержки роста диаметром 1,52-1,64 см (рис. 1). При культивировании бактерий E.coli с экстрактом в течение 12 часов вокруг бумажных дисков образовывались зоны стерильности диаметром 2,12-2,18 см (рис. 2).
Рис.2. Зоны стерильности культуры E.coli вокруг диска с антигеном-экстрактом A.simplex
После культивирования P.vulgaris в течение этого же периода времени вокруг бумажных дисков также установлены зоны временной задержки роста диаметром 1,58-1,63см. Спустя 24 часа культивирования данная зона стерильности во всех случаях исчезала.
Проведенные нами исследования позволили установить бактериостатическое действие экстракта из анизакид в течение 12 часов. Следовательно, в экстракте содержатся активные вещества, вызывающие временный бактериостаз грамотрицательной и грамполо-жительной облигатной микрофлоры, предположительно за счет нарушения обмена энергии и веществ. В нашем случае нарушения этих процессов проявились у Micrococcus sp., E.coli и P.vulgaris.
Проведенные ранее эксперименты in vivo в отношении эукариотических организмов показали, что в активно делящихся клетках красного костного мозга и сперматогенного эпителия лабораторных мышей после однократного внутрибрюшинного введения соматического экстракта из анизакид нарушается процесс формирования микротрубочек веретена деления, что приводит к бесплодию [4]. По всей видимости, аналогичные процессы могут происходить и в прокариотических клетках, что негативно отражается на скорости их деления. В то же время, при микроскопии мазков изменения в морфологии клеток в эксперименте и контроле мы не зафиксировали.
Нельзя не отметить, ткани и органы гельминтов могут содержать собственную бактериальную флору, которую они переносят, способную также влиять на микроорганизмы [18]. Так, наличие в кишечнике личинок Anisakis бактерии Photobacterium phosphoreum и Shewanella sp., вызывающих порчу рыбы и рыбопродуктов, благоприятно сказывается на сроках их хранения. Ученые объясняют данный факт специфическими метаболическими свойствами гельминтов, вызывающих снижение рН, что приводит к торможению роста и снижению количества гнилостной микрофлоры [24]. Однако в случае воздействия соматического экстракта из анизакид подобное действие исключается, так как белковый экстракт оставался стерильным, следовательно, за процесс воздействия на клетки прокариот ответственность лежит непосредственно на белковых компонентах самого гельминта.
Работами, проведенными ранее зарубежными специалистами, было выявлено наличие антибактериальных факторов у различных нематод [5, 6, 10, 11, 16, 25, 26]. Известно, что антимикробные пептиды делятся на две группы: первые - низкомолекулярные катионные пептиды нарушают структуру и функции ци-топлазматической мембраны, формируя ионные каналы. Вторые - цекропины, состоящие из 30 и более аминокислот, литические ферменты и белки, связывающие питательные вещества, и белки, содержащие сайты против микробных макромолекул, приводящие к разрушению мембран, лектины, лизоцим и другие [18]. Однако, Joo Н^., Fu С.1. et а1. [15] считают, что независимо от размера молекул антимикробных пептидов, их механизмы идентичны: происходит связывание с поверхностью цитоплазматической мембраны бактериальной клетки, образование пор и уничтожение микроорганизма. Есть сведения, что процессу лизиса, вызванного низкомолекулярными катионными пептидами, обладающими антимикробной активностью, подвергаются как микробные, так и эукариотические клетки [2].
В составе экскреторно-секреторных продуктов анизакид обнаружены ферменты и ан-тиоксиданты, молекулы ингибиторов протеаз, лектины, белки теплового шока, муцины и регуляторы цитокинов [17]. Потенциально из этих веществ антимикробным действием могут обладать лектины и белки теплового шока, которые также можно принять за антимикробные пептиды [7, 12, 17].
Соматический антигенный экстракт не оказывал бактериостатического действия на патогенную грамотрицательную микрофлору, представленную tiphimurium. Вероятно, этот факт можно объяснить тем, что у бактерий существуют механизмы резистентности к антимикробным пептидам, которые основаны на изменении физико-химических свойств поверхностных молекул цитоплазматических мембран [15], что можно рассматривать и в отношении пептидов анизакид. Вообще описано несколько стратегий устойчивости бактерий. Первая - внеклеточная диссоциация: бактерии при взаимодействии с антимикробными пептидами секретируют белки-протеазы, которые обладают в отношении их протеолитической активностью. Так, грампо-
ложительные бактерии выделяют металлапро-теазы, сериновые эндопептидазы и цистеино-вые протеазы [21], а грамотрицательные, такие как E.coli, S. tiphimurium - аспартат проте-азу, Proteus mirabitis - металлопротеазу [8]. Вторая - внутриклеточная протеолитическая диссоциация, разрушение грамотрицательны-ми бактериями антимикробных пептидов, попавших в клетку с транспортными белками [23]. Третья - грамотрицательные и грампо-ложительные бактерии содержат поверхностные капсульные белки, связывающие антимикробные пептиды. У грамположительных бактерий и бацилл есть тейхоевые кислоты, увеличивающие плотность клеточной стенки, электрическую стабильность, тем самым отталкивают и снижают поверхностную проницаемость. Подобно грамположительным бактериям, у грамотрицательных S. tiphimurium, E.coli есть липополисахарид, уменьшающий отрицательный заряд клеточной стенки и снижающий ее проницаемость. У грамотрица-тельных бактерий также самая длинная поли-сахаридная цепь, О-антиген, обеспечивающий дополнительный барьер к антимикробным пептидам [22]. При взаимодействии антимикробных пептидов с цитоплазматической мембраной бактерий срабатывают механизмы для снижения притяжения. Так, для бацилл и грамположительных характерно наличие интегральных белков, обеспечивающих электростатическое отталкивание [19]. Но даже в случае присоединения антимикробных пептидов к цитоплазматической мембране бактерий, они могут их удалить, используя специальные комплексы сопротивления - насосы, также существующие у многих грамотрицательных микроорганизмов [9] и бацилл. По последним данным, у грамположительных и грамотрица-тельных бактерий, в том числе и у S. tiphimurium, идентифицирована система, регулирующая экспрессию генов, участвующих в регуляции устойчивости к антимикробным пептидам [15]. Несмотря на то, что из литературных данных известно, что защитные механизмы устойчивости к антимикробным пепти-
дам присутствуют у многих микробов, они сработали не у всех исследуемых представителей в отношении пептидов анизакид. Подобный эффект устойчивости мы ожидали от P.vulgaris, так как известно, что он также обладает сильными протеолитическими свойствами [8;21]. Midha A, Schlosser J. et al. [18] установили, что к соматическим продуктам A.suum, к антибактериальным компонентам более чувствительна грамположительная микрофлора S. aureus, менее чувствительна или не чувствительна грамотрицательная E.coli и P.vulgaris.
Бактериостатическое действие гельминтов потенциально возможно использовать для лечения некоторых инфекционных заболеваний [14, 18, 20]. Эти данные основываются на том, что гельминты имеют природные механизмы устойчивости к бактериальным популяциям. Данные механизмы необходимо исследовать в связи с растущей антибиотико-устойчивостью и фармакологической устойчивостью патогенов. По последним данным известно, что эксреторно-секреторные белки анизакид возможно использовать для лечения иммунных, и в перспективе - аллергических заболеваний [17]. Поэтому необходимо не только изучение влияния бактерий на продукты нематод, но и наоборот, что в последующем может стать целью разработки антибактериальных и антигельминтных средств [18].
Заключение. Полученные в ходе нашего эксперимента данные подтверждают антагонистические отношения белковых продуктов личинок анизакид и микроорганизмов. В результате исследования выявлена различная степень активности антигенов соматического экстракта из анизакид на культуры микроорганизмов, наибольшее влияние экстракт оказал на культуры палочек E.coli и микрококков Micrococcus sp. Полученные результаты можно использовать для разработки модели бактериальных клеток как тест-объектов для оценки антигенной активности соматических, экскреторно-секреторных экстрактов и метаболитов различных гельминтов.
Литература
1. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам : методические указания. М. : Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 125 с.
2. Волкова Л. В., Гришина Т. А., Волков А. Г. Низкомолекулярные катионные пептиды лейкоцитов, индуци- рован-ные различными антигенами // Вестник ПНИПУ. Химическая технология и биотехнология. 2015. № 4. С. 35-48.
3. Сивкова Т. Н. Получение и характеристика антигенов гельминтов : учебно-методическое пособие / сост. Т. Н. Сивкова. Пермь : Пермская ГСХА, 2009. 14 с.
4. Сивкова Т. Н. Кариопатическое и патоморфологическое действие продуктов метаболизма личинок анизакид : монография. Пермь : Пермская ГСХА, 2011. 132 с.
5. Abner S. R., Parthasarathy G., Hill D. E., Mansfield L. S. Trichuris suis: detection of antibacterial activity in excretory-secretory products from adults // Exp. Parasitol. 2001. No. 99. Р. 26-36. 28 Биология и биотехнологии www.avu.usaca.ru Аграрный вестник Урала № 01 (168), 2018 г.
6. Andersson M., Boman A., Boman H. H. Ascaris nematodes from pig and human make three antibacterial peptides: isolation of cecropin P1 and two ASABF peptides // Cell. Mol. Life Sci. 2003. No. 60. Р. 599-606.
7. Audicana M. T., Kennedy M. W. Anisakis simplex: from obscure infectious worm to inducer of immune hypersensitivity // Clin Microbiol. Rev. 2008. No. 21. Р. 360-379.
8. Belas R., Manos J., Suvanasuthi R. Proteus mirabilis ZapA metalloprotease degrades a broad spectrum of substrates, including antimicrobial peptides // Infect. Immun. 2004. No. 72. Р. 5159-5167.
9. Delmar J. A., Su C. C., Yu E. W. Bacterial multidrug efflux transporters // Annu. Rev. Biophys. 2014. No. 43. Р. 93-117.
10. Drake L., Korchev Y., Bashford L., Djamgoz M., Wakelin D., Ashall F. et al. The major secreted product of the whipworm, Trichuris, is a pore-forming protein // Proc. Biol. Sci. 1994. No. 257. Р. 255-261.
11. Eberle R., Brattig N.W., Trusch M., Schlüter H., Achukwi M. D., Eisenbarth A., Renz A., Liebau E., Perbandt M., Betzel C. Isolation, identification and functional profile of excretory-secretory peptides from Onchocerca ochengi // Acta Trop. 2015. No. 142. Р. 156-166.
12. F®ste C. K., Jonscher K. R., Dooper M. et al. Characterisation of potential novel allergens in the fish parasite Anisakis simplex // EuPA Open Proteomics. 2014. No. 4. Р. 140-155.
13. F®ste C. K. Fish feed as source of potentially allergenic peptides from the fish parasite Anisakis simplex (S. L.) // Animal feed science and technology. 2015. No. 202. Р. 52-61.
14. Haarder S., Kania P. W., Holm T. L., Gersdorff J. L., Buchmann K. Effect of ES products from Anisakis (Nema-toda: Anisakidae) on experimentally induced colitis in adult zebra fish // Parasite Immunol. 2017. V. 39. I. 10. P. 66.
15. Joo H. S., Fu C. I., Otto M. Bacterial strategies of resistance to antimicrobial peptides // Philos Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2016. No. 26. P. 1-11.
16. Kato Y. Humoral defense of the nematode Ascaris suum: antibacterial, bacteriolytic and agglutinating activities in the body fluid // Zoolog. Sci. 1995. No. 12. Р. 225-230.
17. Mehrdana F., Buchmann K. Excretory secretory products of anisakid nematodes: biological and pathological roles // Acta Veterinaria Scandinavica. 2017. No. 59:42. Р. 1-12.
18. Midha A., Schlosser J., Hartmann S. Reciprocal Interactions between Nematodes and Their Microbial Environments // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2017. V. 7:144. Р. 1-20.
19. Peschel A. et al. Staphylococcus aureus resistance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor Mpr F is based on modification of membrane lipids with L-lysine // J. Exp. Med. 2001. No. 193. Р. 10671076.
20. Reynolds L. A., Finlay B. B., Maizels R. M. Cohabitation in the intestine: interactions between helminth parasites, bacterial microbiota and host immunity // Journal of immunology. 2015. 195. No. 9. Р. 4059-4066.
21. Schmidtchen A., Frick I. M., Andersson E., Tapper H., Bjorck L. Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37 // Mol. Microbiol. 2002. No. 46. Р. 157-168.
22. Silhavy T. J., Kahne D., Walker S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb. // Perspect. Biol. 2010. No. 2 (5).
P. 87.
23. Shelton C. L., Raffel F. K., Beatty W. L., Johnson S. M., Mason K. M. Sap transporter mediated import and subsequent degradation of antimicrobial peptides in Haemophilus // PLoS Pathog. 2011. No. 7 (11). P. 44.
24. Svanevik C. S., Lunestad B. T., Levsen A. Effect of Anisakis simplex (sl) larvae on the spoilage rate and shelflife of fish mince products under laboratory conditions // Food Control. 2014. No. 46. Р. 121-126.
25. Tarr D. E. K. Distribution and characteristics of ABFs, cecropins, nemapores, and lysozymes in nematodes // Dev. Comp. Immunol. 2012. No. 36. Р. 502-520.
26. Wardlaw A. C., Forsyth L. M., Crompton D.W. Bactericidal activity in the pig roundworm Ascaris suum // J. Appl. Bacteriol. 1994. No. 76. Р. 36-41.
27. Zhang H., Yoshida S., Aizawa T., Murakami R., Suzuki M., Koganezawa N. et al. In vitro antimicrobial properties of recombinant ASABF, an antimicrobial peptide isolated from the nematode Ascaris suum // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. No. 44. Р. 2701-2705.
THE INFLUENCE OF SOMATIC EXTRACT OF ANISAKIDAE LARVAE ON BACTERIA
O. I. Lazareva, Post-Graduate Student
T. N. Sivkova, Dr. Bio. Sci., Associate Professor
T. S. Prokhorova, Cand. Bio. Sci., Associate Professor
Perm State Agro-Technological University
23, Petropavlovskaya St., Perm, 614099, Russia
E-mail: tatiana-sivkova@yandex.ru
ABSTRACT
The previous research established that protein products, being a part of A. simplex somatic, excretory and secretory products, possess a pronounced karyopathic effect, however, its mechanism remains insufficiently studied. This study is necessary to understand pathological processes in a damaged cell and manage karyopathic impact. The mentioned issues established the relevance of research. There are very few data on the mechanisms of interaction of helminths somatic extracts and microorganisms. It is assumed that anisakidae somatic extract renders a negative effect on microorganisms due to its protein components and metabolites. The aim of research was to study the influence of extract on cells culture of microorganisms diverse in morphological characters and resistance to environmental factors. The extract was prepared from anisakidae larvae removed from frozen Micromesistius poutassou. Then the extract was tested for sterility and harmlessness, the protein content was determined. The following daily cultures of bacteria were selected for the research: Micrococcus sp., Escherichia coli, Proteus vulgaris and Salmonella tiphimurium. Microorganisms were cultured with discs that contained anisakidae antigenic extract, thereby detected the zone of bacteriostasis in Micrococcus sp., E. coli and P. vulgaris after 12 hours in a thermostat at + 37 ° C. The extract had no effect on the growth of S. tiphimurium. The development of pronounced sterility zone indicates that the protein extract contains biologically active components with bacteriostatic effect. Key words: somatic extract, anisakidae larvae, metabolites, bacteria, bacteriostatic effect.
References
1. MUK 4.2.1890-04. Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam : metodicheskie ukazaniya (Determination of the sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs : methodical instructions), Moscow, Federal'nyi tsentr Gossanepidnadzora Minzdrava Rossii, 2004, 125 p.
2. Volkova L. V., Grishina T. A., Volkov A. G. Nizkomolekulyarnye kationnye peptidy leikotsitov, indutsirovannye razlichnymi antigenami (Low-molecular cationic peptides of leukocytes induced by various antigens), Vestnik PNIPU. Khimicheskaya tekhnologiya i biotekhnologiya, 2015, No. 4, pp. 35-48.
3. Sivkova T. N. Poluchenie i kharakteristika antigenov gel'mintov : uchebno-metodicheskoe posobie (Obtaining and characterization of helminths antigens : educational-methodical manual), sost. T. N. Sivkova, Perm', Permskaya GSKhA, 2009, 14 p.
4. Sivkova T. N. Kariopaticheskoe i patomorfologicheskoe deistvie produktov metabolizma lichinok anizakid : mono-grafiya (Karyopatic and pathomorphological action of metabolic products of anisakid larvae : monograph), Perm', Permskaya GSKhA, 2011, 132 p.
5.Abner S.R., Parthasarathy G., Hill D.E., Mansfield L.S. Trichuris suis: detection of antibacterial activity in excretory-secretory products from adults. Exp. Parasitol. 2001, No. 99, pp. 26-36.
6.Andersson M., Boman A., Boman H.H. Ascaris nematodes from pig and human make three antibacterial peptides: isolation of cecropin P1 and two ASABF peptides. Cell. Mol. Life Sci., 2003, No.60, pp.599-606.
7.Audicana M.T., Kennedy M.W. Anisakis simplex: from obscure infectious worm to inducer of immune hypersensitivity. Clin Microbiol. Rev., 2008, no. 21, pp. 360-379/
8.Belas R., Manos J., Suvanasuthi R. Proteus mirabilis Zap A metalloprotease degrades a broad spectrum of substrates, including antimicrobial peptides. Infect. Immun., 2004, No. 72, pp. 5159-5167.
9.Delmar J.A., Su C.C., Yu E.W. Bacterial multidrug efflux transporters, Annu. Rev. Biophys, 2014, No. 43, pp. 93-117.
10.Drake L., Korchev Y., Bashford L., Djamgoz M., Wakelin D., Ashall F. et al. The major secreted product of the whipworm, Trichuris, is a pore-forming protein. Proc. Biol. Sci., 1994, No. 257, pp.255-261.
11 .Eberle R., Brattig N.W., Trusch M., Schlüter H., Achukwi M.D., Eisenbarth A., Renz A., Liebau E., Perbandt M., Betzel C. Isolation, identification and functional profile of excretory-secretory peptides from Onchocerca ochengi, Acta Trop., 2015, No.142, pp.156-166.
12.Fsste C.K., Jonscher K.R., Dooper M. et al. Characterisation of potential novel allergens in the fish parasite Anisakis simplex. EuPA Open Proteomics, 2014, №.4, pp.140-155.
13.Fsste C.K. Fish feed as source of potentially allergenic peptides from the fish parasite Anisakis simplex (S.L.) C.K. Fsste, C. Plassen, E. Egaas, A.Levsen, A.H. Lin, N.Larsen, A.Moen, T.do Van. Animal feed science and technology. Elsevier Science Publishing Company, Inc., 2015, No.202, pp.52-61.
14.Haarder S., Kania P.W., Holm T.L., Gersdorff J.L., Buchmann K. Effect of ES products from Anisakis (Nematoda: Anisakidae) on experimentally induced colitis in adult zebra fish, Parasite Immunol. 2017. V.39, I.10. D0I:10.1111/pim.12456.
15.Joo H.S., Fu C.I., Otto M. Bacterial strategies of resistance to antimicrobial peptides. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., 2016, No.26. 371(1695). pp.1-11. DOI: 10.1098/rstb.2015.0292.
16.Kato Y. Humoral defense of the nematode Ascaris suum: antibacterial, bacteriolytic and agglutinating activities in the body fluid. Zoolog. Sci., 1995, No.12, pp. 225-230.
17.Mehrdana F., Buchmann K. Excretory/secretory products of anisakid nematodes: biological and pathological roles. Acta Veterinaria Scandinavica, 2017, 59:42, pp.1-12. DOI 10.1186/s13028-017-0310-3.
18.Midha A., Schlosser J., Hartmann S. Reciprocal Interactions between Nematodes and Their Microbial Environments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2017, V.7:144, pp.1-20. DOI: 10.3389/fcimb.2017.00144.
19.Peschel A. et al. Staphylococcus aureus resistance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor Mpr F is based on modification of membrane lipids with L-lysine. J. Exp. Med., 2001, 193, pp. 1067-1076.
20.Reynolds L.A., Finlay B.B., Maizels R.M. Cohabitation in the intestine: interactions between helminth parasites, bacterial microbiota and host immunity. Journal of immunology, 2015, No.195(9), pp. 4059-4066.
21.Schmidtchen A., Frick I.M., Andersson E., Tapper H., Bjorck L. Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37. Mol. Microbiol., 2002, No.46, pp.157-168.
22.Silhavy T.J., Kahne D., Walker S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2010, No. 2 (5): a000414. DOI: 10.1101/cshperspect.a000414.
23.Shelton C.L., Raffel F.K., Beatty W.L., Johnson S.M., Mason K.M. Sap transporter mediated import and subsequent degradation of antimicrobial peptides in Haemophilus. PLoS Pathog, 2011, No.7(11): e1002360. DOI 10.1371/journal.ppat.1002360.
24.Svanevik C. S., Lunestad B.T., Levsen A. Effect of Anisakis simplex (sl) larvae on the spoilage rate and shelf-life of fish mince products under laboratory conditions. Food Control, 2014, № 46, pp.121-126.
25.Tarr D.E.K. Distribution and characteristics of ABFs, cecropins, nemapores, and lysozymes in nematodes. Dev. Comp. Immunol, 2012, No 36, pp.502-520.
26.Wardlaw A.C., Forsyth L.M., Crompton D.W. Bactericidal activity in the pig roundworm Ascaris suum. J. Appl. Bacteriol., 1994, No. 76, pp.36-41.
27.Zhang H., Yoshida S., Aizawa T., Murakami R., Suzuki M., Koganezawa N. et al. In vitro antimicrobial properties of recombinant ASABF, an antimicrobial peptide isolated from the nematode Ascaris suum. Antimicrob, Agents Chemother, 2000, No. 44, pp. 2701-2705.
УДК 636.085.55
РАЗРАБОТКА РЕЦЕПТА СТАРТЕРНОГО КОМБИКОРМА ИЗ СЫРЬЯ СОБСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА
А. Н. Малков, аспирант,
ФГБОУ ВО Ижевская ГСХА,
ул. Студенческая, д. 11, г. Ижевск, Россия, 426069
E-mail: malkoff.andrej2011@yandex.ru
Аннотация. На базе СПК (колхоз) Мысы Кезского района Удмуртской Республики разработан рецепт комбикорма-стартера из сырья местного происхождения с учетом кормовой базы хозяйства и сбалансированности рационов кормления молодняка крупного рогатого скота. Определение питательности кормов проводилось в агрохимцентре «Удмуртский» по общепринятым методикам. Дан анализ химического состава злаковых концентратов хозяйства в сравнении со справочными данными. Выявлено, что исследуемое сырье отличается низкой протеиновой питательностью, высоким содержанием клетчатки. В связи с этим в хозяйстве необходимо организовать производство комбикормов с включением местного белкового сырья, в частности, гороха, льняного жмыха. Включение в рецептуру комбикорма гороха, травяной муки и льняного жмыха привело к увеличению содержания протеина на 14,03 г, кальция - на 0,01 г, фосфора - на 0,25 г. По энергетической питательности концентраты не отличаются. Разработанный рецепт комбикорма максимально соответствует требованиям ГОСТ для молодняка крупного рогатого скота.
Ключевые слова: ремонтный молодняк, комбикорм собственного производства, травяная мука.
Введение. Основной целью выращивания ремонтного молодняка является получение скороспелых, хорошо развитых животных с крепкой конституцией, способных к использованию большого количества растительных кормов для формирования высокой продуктивности [2, 4, 8, 13].
Наиболее ответственным периодом в формировании здорового, конституционально-крепкого молодняка, который в последующем будет иметь высокую продуктивность и хорошие воспроизводительные качества, является молочный. Основным кормом в этот период является молоко, который считается
