CC BY
10Ученые записки Таврического национального университета им В. И. Вернадского Серия «Биология» Том 14 (53). 2001 г. №1. С. ¡21-128.
УДК 577.322 : 537.632.5
Мартынюк B.C., Калиновский П.С., Цейслер Ю.В.
ВЛИЯНИЕ СЛАБОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ КРАЙНЕ НИЗКОЙ ЧАСТОТЫ НА СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЦИТОХРОМА С В ПРИСУТСТВИИ ХЛОРОФОРМА
ВВЕДЕНИЕ
Согласно современным представлениям первичные механизмы воздействия ПеМП реализуются на уровне структурных перестроек молекулярных асссоциатов воды |1|. которые могут играть важную роль в динамическом поведении и функционировании биополимеров |2].
Показано, что в воде и водных растворах имеет место возникновение пространственно-временного порядка за счет сил дальнодействия, который может быть изменен или разрушен слабыми воздействиями [3]. Предполагается, что изменение структурно-динамических свойств водной фазы может приводить к изменению гидрофильно-гидрофобного баланса в коллоидных системах [4]. Подтверждением этого предположения следует рассматривать данные об изменении оптических свойств растворов глицилтриптофана [4], а также растворимости бензола и ретинолацетата в воде и водных растворах альбумина [5,6].
В связи с этим целью настоящего исследования была оценка влияния ПеМП на спектральные характеристики цитохрома с. вызванных взаимодействием раствора белка с агентом гидрофобной природы - хлороформом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В настоящем исследовании, так же как и предыдущих работах |5,6J, в качестве базовой модели гидрофобных взаимодействий было использовано явление насыщения растворов белка низкомолекулярными углеводородами и их галогенпроизводными гидрофобной природы [7|. Насыщение 0.05 %-ных растворов цитохрома с хлороформом осуществляли путем наслаивания 3 мл раствора белка на 1.5 мл хлороформа с последующей инкубацией образцов при комнатной температуре 22-24°С. Лиофильный электрофоретически чистый препарат цитохрома с (окисленная форма) был любезно предоставлен научно-производственной компанией «Биоритм» (Украина). Водные растворы цитохрома с характеризовались максимумом поглощения полосы Соре 408-409 нм. По окончании установленного срока инкубации регистрировали дифференциальные спектры растворов цитохрома с, насыщенных хлороформом, против растворов данного белка, находящихся в тех же условиях без добавления хлороформа.
Для моделирования окислительно-восстановительных процессов, протекающих с участием цитохрома с использовали реакцию восстановления белка раствором
аскорбиновой кислоты в конечной концентрации 0,11 мМ/л. К 1,5 мл 0,05% раствора цптохрома с добавляли 0,2 мл 1 мМ раствора аскорбиновой кислоты рН=7.0. Перед измерением активности растворы цптохрома с в объеме 1,5 мл инкубировали с 0,5 мл хлороформом в течение 1, 2 и 3 часов при температуре 20-23ПС. Активность фермента оценивали по изменению оптической плотности при длине волны 1=550 нм.
Импульсное магнитное поле создавали кольцами Гсльмгольца. Импульсы были прямоугольной формы и разной полярности. Частота магнитного поля составляла 8 Гц, индукция 25 цТ. Вектор индукции создаваемого магнитного поля был параллельным вектору геомагнитного поля. Опытные образцы помещали в кольца Гельмгольца. Контрольные пробы находились в условиях фоновых значений ПеМП, характерных для данной лаборатории (20-65 пТ). Для оценки возможного влияния различий в уровне фоновых ЭМП в местах расположения опытных и контрольных образцов проводили эксперименты с ложным воздействием МП. В этом случае опытные образцы помещали в кольца Гельмгольца, но не подвергали воздействию МП.
Для оценки достоверности влияния МП КНЧ использовали ^критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рисунке 1 представлены дифференциальные спектры раствора цптохрома с Как видно при его насыщении хлороформом спектр поглощения претерпевает «голубой сдвиг». Согласно [8] это свидетельствует об увеличении полярности среды, окружающей хромофор. В данном эксперименте увеличение полярности среды может быть вызвано двумя причинами, которые не исключают друг друга и могут реализоваться одновременно.
В первом случае «голубой сдвиг» может быть вызван большей доступностью молекул воды к хромофору (гему). Учитывая, что в нативном цитохроме с гем почти полностью погружен в гидрофобную полость белковой глобулы и практически недоступен полярному растворителю, «голубой сдвиг» можно интерпретировать как свидетельство частичной денатурации белка, вызванной связыванием хлороформа, и экспонирования хромофора (гема) к полярному растворителю - воде.
Во втором случае, «голубой сдвиг» может быть вызван связыванием молекул хлороформа с гидрофобными полостями цптохрома с. Несмотря на то, что хлороформ относят к группе неполярных веществ, молекула данного вещества характеризуется достаточно высоким для неполярных веществ дипольным моментом ЦХлороформ=1.06 Б (для сравнения |Лвода=1.84 Б, Цбензсщ-Цгептан ~ о Б). Это свойство молекул хлороформа, заполняющих гидрофобные полости белка, также может вносить существенный вклад в формирование наблюдаемого в эксперименте «голубого сдвига». Согласно [7], связывание углеводородов в гидрофобных полостях молекул белков, растворенных в воде не приводит к существенным конформационным изменениям. В связи с этим наиболее обоснованным, является предположение о том, что наблюдаемый «голубой сдвиг» происходит в результате заполнения гидрофобных полостей цптохрома с слабополярными молекулами
wavelength (nm)
Рис. 1 Интегральный (1. левая шкала) и дифференциальные (2-4.-правая шкала) спектры 0.05% растворов цшпохрома с через 2 (2). 4 (3) и 24 (4) часа инкубации с хлороформом.
Табл. 1. Основные характеристики дифференциальных спектров цшпохрома с
Время ■жспозици и (ч) Параметр Контрольные образцы (нм) Ложное воздействие (им) .1 ¡агнитное поле (нм) Изменение относительно контрольных образцов {%) Изменение относительно ножного воздействш (%)
2 ) '-max 397,3 ± 1,9 394,0 ± 3,8 387,8 ± 5,0* -2,9 -1,6
4 ^-max 391,5 ±3,0 398,8 ± 1,6 390,3 ± 4,3*' -0,6 -2,1
24 ^IIKIX 393,2 ± 1,8 395,8 ± 2,2 391,0 ±5,1 -1,1 -1,2
2 у '-nun 413,9 ±0,5 415,0 ± 1,3 413,0 ± 0,9 -0,2 -0,5
4 ) . 412,7 ±0,7 414,3 ±2,6 413,9 ±0,7 0,3 -0,1
24 у 'чпш 414,4 ±0,4 415,2 ±0,4 415,()± 1,0 0,0 0,0
2 ^-ишГ^-тах 16,7 ± 1,7 21.0 ±3.4 25,2 ±4,3* 76,2 20
4 ^-пшГ^-тах 21,3 ±2,9 15.5 ±2,9 23,6 ± 3,7** 24,0 52,3
24 ^•пшГ^-та* 21,2 ± 1,9 19,4 ±2,4 24,0 ±4,1 32,7 23,7
2 34,0 ± 2,4 38,3 ±7,1 38,3 ± 5,8 12,6 0,0
4 Dniax-I^iniii 32,1 ±2,7 34,5 ± 4,2 3.3,0 ± 3,0 2,8 -4,4
24 46,3 ±2,8 45,6 ± 3,9 54,8 ± 1,6*'** 18,3 20,1
Примечание: *- достоверные отличия относительно кошролытых образцов; ** - достоверные отличия относительно ложной экспозиции.
хлороформа, которые в дополнение к этому оказывают частичное денатурирующее действие и открывают доступ гема к воде.
Следует обратить внимание, что процесс насыщения раствора цитохрома с характеризуется определенной динамикой в дифференциальных спектрах (рис. 1). По мере насыщения белка хлороформом максимум дифференциального спектра (^■тах) смещается в более короковолновую область, тогда как положение минимума (А,тш) почти не изменяется. Этот процесс сопровождается также небольшим гипохромным эффектом.
Анализ дифференциальных спектров показал, что влияние импульсного магнитного поля наиболее ярко выражено в первые часы процесса насыщения растворов цитохрома с хлороформом. В частности, данный фактор ускоряет формирование «голубого сдвига» (табл. 1) При этом наиболее чувствительным элементом к действию магнитного поля является спектральный максимум, который претерпевает смещение в «голубую» область, а также разность длин волн Х^щ-А-тщ (табл 1).
При длительной суточной экспозиции растворов цитохрома с в магнитном поле в дифференциальном спектре также зарегистрировано достоверное увеличение параметра Отах-Отш (табл. 1), который согласно |9| характеризует количество связанного лиганда.
Time (hours) Time (hours)
Рис. 2. Влияние переменного магнитного поля на активность цитохрома с насыщаемого хлороформом в % по отношению к контрольным образцам, не насыщаемых хлороформом, (левый рисунок - эксперимент с магнитным полем; правый рисунок - эксперимент с ложным воздействием; линия 1 - влияние хлороформа; линия 2 - одновременное влияние хлороформа и переменного магнитного поля; линия «100%» - контроль; *, ** достоверное влияние магнитного поля относительно контрольных и насыщенных хлороформом образцов цитохрома с).
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что слабое импульсное магнитное поле край низких частот усиливает процесс связывания хлороформа с гидрофобными полостями белка. Это является дополнительным подтверждением представлений о том. что в основе биологического действия слабых переменных магнитных полей лежит изменение гидрофильно-гидрофобного баланса в водных растворах биополимеров и поверхностно-активных веществ.
Как известно, низкомолекулярные органические растворители, в том числе и хлороформ, являются мощными денатурирующими агентами. Возникает естественный вопрос о влиянии связывающегося хлороформа на функциональную активность цитохрома с. Для внесения ясности в данную проблему были проведены исследования каталитической активности цитохрома с в условиях его насыщения хлороформом и воздействия переменным магнитным полем. Как видно (рис. 2) ингибирующее действие хлороформа в исследуемой модельной системе проявляется относительно слабо и. как правило, достоверно выявляется через 2 часа инаубации, а снижение ферментативной активности не превышает 10 %. Это указывает на то, что насыщение белка хлороформом в «мягких» условиях не приводит к значительным конформационным перестройкам и, соответственно, не приводит к полной потери активности изучаемого фермента.
Полненные результаты в экспериментах с магнитным полем (рис. 2) показывают, что ускорение связывания хлороформа цитохромом с, вызванное действием физического фактора, приводит к достоверному снижению активности фермента в первый час эксперимента на 15-20%. Данный факт свидетельсвует о том, что переменное магнитное поле стимулирует связывание хлороформа цитохромом с и тем самым усиливает денатурирующее действие неполярного растворителя на нативную структуру белка.
ВЫВОДЫ
1. Насыщение водного раствора цитохрома с хлороформом сопровождается формированием «голубого сдвига» в спектре поглощения гема, что указывает на связывание хлороформа данным белком.
2. Связывание хлороформа цитохромом с не приводит к существенной потере активности фермента, что свидетельствует о сохранении нативной конформации данного белка.
3. Переменное магнитное поле ускоряет формирование «голубого сдвига» в области полосы Соре в спектре цитохрома с, что указывает на ускорение связывания хлороформа белком.
4. Переменное магнитное поле, ускоряя процесс насыщения цитохрома с хлороформом, приводит к достоверному снижению активности фермента на 15-20% в первые часы инкубации и тем самым усиливает денатурирующее действие неполярного растворителя.
5. Изменение белковых характеристик при комбинированном действии хлороформа и ЭМП зависит от времени воздействия, что свидетельствует о динамичности конформационных перестроек белка при действии возмущающих агентов.
Список литературы
1. Слесарен В. И.. Шабров А. В. Влияние структуры воды на её статические и динамические свойства. / Тезисы докладов 2-го Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поляк излучения в биологии и медицине». Санкт-Петербург 3-7 июля 2000. - Санкт Петербург, 2000.-С. 102-103.
2. Кяйверяйнен J1. И. Динамическое поведение белков в водной среде и их функции. - Л.: Наука, 1980.-272 с.
3. Черников Ф.Р. Влияние некоторых физических факторов на колебания светорассеяния в воде и водных растворах биополимеров // Биофизика. - 1990. - Т. 35. - в. 5. - С. 711- 715.
4. Лобышев В.И., Рыжиков Б.Д., Шихлинская Р.Э. Спонтанные и индуцированные внешними электромагнитными полями долговременные переходные процессы в разбавленных водных растворах глицилтринтофана и воде//Биофизика. - 1998. - Т. 43. - в. 4. - С. 710 - 715.
5. Мартынюк B.C., Шадрина О.Г. Влияние переменного магнитного поля крайне низкой частоты на растворимость бензола в воде и растворах белка // Биомедицинская радиоэлектроника. - 1999. - № 2. - С. 56-60.
6. Калиновский П. С., Мартынюк В. С. Действие переменных магнитных полей на связывание гидрофобных лигандов сывороточным альбумином // Учёные записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского сер. «Биология» - 2000. - т. 14. - №2. С. 89-93.
7. Измайлова В Н., Ребиндер П.А. Сгр\,кт\рообразовачНие в белковых системах. - М.:Наука, 1974.-286с.
8. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков.. - Киев:Наукова думка, 1981.-208 с.
9. Ахрем A.A., Тишенко Е.И., Киселев H.A., Метелица Д.И. Спектральные характеристики взаимодействия цитохрома с и гемоглобина с метанололом и анилином // Биохимия. - 1978. -Т. 43.-в. 11.-С. 2033-2037.
Статья поступила в редакцию 08.01.2001
