CC BY
87
Биомедицина • № 2, 2014, C. 51-55
Влияние синтетического нанопептида на сперматогенез у осетровых рыб
А.В. Лабенец1, Г.Д. Капанадзе2, Э.В. Бубунец3
1 - ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ирригационного рыбоводства РАСХН, Москва
2 - ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область
3 - ФГБУ «Центральное управление по рыбохозяйственной экспертизе и нормативам по сохранению, воспроизводству водных биологических ресурсов и акклиматизации», Москва
Контактная информация: д.б.н. Капанадзе Гия Джемалиевич, [email protected]
Однократные инъекции нанопептида С56Н7^16012 в дозировке 2 см3 раствора концентрацией 5 мкг/мл (10 мкг/особь) стабильно индуцируют спермиацию у самцов осетровых рыб в условиях культивирования. Стандартные критерии качества эякулятов и результаты функционального тестирования показали их физиологическую полноценность и пригодность для использования в процессе воспроизводства.
Ключевые слова: нанопептид С56Н7^16012, осетровые рыбы, индукция спермиации, качество спермы.
Синтетические нанопептиды находят все более широкое применение в практике животноводства и медицине [5]. Растет использование веществ этой группы и в аквакультуре.
Воспроизводство многих наиболее ценных видов рыб осуществляется при помощи искусственной индукции созревания половых продуктов, реализуемой путем инъекций гормональных препаратов. Начиная с 30-х гг. прошлого века, для данной цели использовались нативные гипофизы соответствующих видов рыб, а позднее - получаемые из них препараты. Возникающие по мере распространения этой практики вопросы, такие как проблема стандартизации активности препаратов гипофиза, растущий дефицит сырья для их производства и др., длительное время не находили удовлетворительного решения. На этом
фоне возросла актуальность адекватной замены гипофизарных препаратов. Наиболее эффективным подходом здесь оказался поиск заменителей гипофизов рыб среди гормонов совсем иной природы, чем гонадотропины.
Исследование механизмов, обеспечивающих регуляцию деятельности гонад, позволило установить, что синтез и выведение гонадотропных гормонов гипофиза находятся под контролем гипоталамуса, который осуществляет эту функцию с помощью рилизинг-гормо-нов. Последние являются пептидами, состоящими всего из 10 аминокислот [2]. Многие их синтетические аналоги, выпускаемые в настоящее время, обладают многократно большей биологической активностью, чем естественные рилизинг-гормоны. В отечественной аквакультуре наибольшее распростра-
нение получил синтетическим аналог лютеинизирующего гормона - рили-зинг гормона (ЛГ-РГ) млекопитающих - «Сурфагон» (СзДДР^).
Несмотря на наличие определенных проблем, он широко применяется в современной практике воспроизводства многих видов рыб [1]. Основное внимание здесь уделяется отработке оптимальных схем использования препарата для стимулирования овуляции ооцитов и анализу получаемых при этом результатов. Исследования особенностей эякулятов, получаемых в результате индукции спермиации нанопептидом, до настоящего времени привлекают неоправданно мало внимания [6].
Целью работы являлось изучение эякулятов культивируемых осетровых рыб, продуцируемых при индукции спермиации синтетическим нанопепти-
дом С56Н7Л6012.
Материалы и методы
Для получения исследованных эяку-лятов использовались половозрелые самцы ряда видов осетровых, выращенные и содержащиеся в предприятиях Московской области - Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе и рыбоводном хозяйстве Электрогорской ГРЭС-3 им. Р.Э. Классона. Регламент преднерестового содержания и условия среды в целом соответствовали нормативным значениям [7].
Для стимулирования созревания применялся препарат «Сурфагон» производства ЗАО «Мосагроген», одноименное действующее вещество которого имеет структурную формулу №^1у10, D-Ala6]-LHRH ethylamide) и является, соответственно, синтетическим нонапептидом, так как содержит
на одну аминокислоту меньше, чем естественный рилизинг-гормон.
Индукция спермиации осуществлялась путем однократного иньецирова-ния производителей в спинную мышцу (рис. 1) раствором сурфагона (5 мкг/мл) в 0,9 % растворе хлорида натрия. Дозировка составляла 2 см3 на особь. Продолжительность экспозиции составляла от 18 до 30 ч в зависимости от температуры воды.
Рис. 1. Инъецирование самца стерляди раствором нанопептида С56Н78Ш6012.
Получение спермы проводилось при помощи силиконового катетера, вводимого в семяпровод. Для сбора эякулятов использовались полиэтиленовые пробирки (рис. 2).
Рис. 2. Получение спермы у самца русского осетра.
Изучение эякулятов проводили с использованием методик, имеющих широкое применение в работах такого рода [3]. Соотношение живых и мертвых спермиев определялось путем глазомерной оценки спермы под микроскопом с использованием 5-балльной шкалы. Количество спермиев в единице объема определялась путем их подсчета в камере Горяева с разбавлением эякулята в 200 раз 4% раствором формалина в эри-троцитном меланжере.
Активность спермиев оценивалась по длительности двух фаз: I - до перехода большей части спермиев (>50-60%) от поступательного движения к колебательному; II - до полного прекращения движения большинства спермиев. Продолжительность движения измерялись с использованием электронного секундомера под микроскопом с увеличением 400*. Для определения сперматокрита, которое проводилось немедленно после получения эякулятов, использовалась центрифуга МГЦ-8 и стандартные гематокритные капилляры [3, 8]. Обработка полученных данных проведена с использованием пакета программ <^а^йса 6.0».
Результаты и их обсуждение
Основные показатели качества эя-кулятов осетровых рыб при индукции спермиации синтетическим нанопепти-дом приведены в таблице. Визуальная оценка полученных эякулятов показала их близкое к среднему качество. Существенный разброс данных (2-5 баллов) и весьма высокая их вариабельность обусловлены, по-видимому, спецификой сперматогенеза у отдельных самцов.
Важным элементом оценки качества спермы является определение
концентрации спермиев в единице объема эякулята. Как показывают приведенные в табл. данные, у всех использованных в экспериментах видов (за некоторым исключением стерляди) величины этого показателя были близки к средним видовым значениям, обычно рассматриваемым в качестве нормативных [7]. Сперматокрит, как показатель довольно тесно коррелирующий с концентрацией спермиев, в большинстве случаев закономерно соответствовал величинам последнего параметра. Высокая изменчивость исследованных эякулятов по этим параметрам, очевидно, детерминировалась индивидуальными особенностями продуцировавших их самцов и наличием объективных различий в физиологическом статусе рыб.
Активность спермиев, оцениваемая по времени их подвижности, в значительной степени определяется внешними факторами, которые в условиях культивирования могут существенно отличаться от характерных для естественных условий. В первую очередь, это касается температуры воды и некоторых гидрохимических показателей [4]. Однако, несмотря на несколько меньшую, по сравнению со считающейся типичной, длительность обеих фаз движения спермиев, время их поступательного движения следует рассматривать как вполне достаточное для эффективного оплодотворения.
Решающим критерием оценки качества эякулятов является их функциональное тестирование, т.е. определение оплодотворяющей способности спермы. В процессе проведения данной работы оплодотворяемость икры (оценивавшаяся на стадии второго деления)
53
БюшеШете • № 2, 2014
составила в разных партиях: у белуги - 30-97, у русского осётра - 82-92, севрюги - 50-94, сибирского осётра - 78-85 и стерляди - 60-81%. Таким образом, значения этого важнейшего показателя у всех исследованных видов не имели значимых отличий от современных нормативов [7].
Выводы
1. Применение нанопептида С56Н7^16012 для индукции спермиации у самцов осетровых рыб обеспечива-
ет продуцирование физиологически полноценных эякулятов, соответствующих по исследованным показателям производственным нормативам и обладающих высокой оплодотворяющей способностью.
2. Использование нанопептида С56Н^16012 в условиях аквакультуры достаточно эффективно для гормональной стимуляции созревания самцов таких видов осетровых, как севрюга и белуга, до настоящего времени считающихся проблемными.
Таблица
Показатели качества эякулятов
Показатель Белуга Русский осётр Севрюга Сибирский осётр Стерлядь
Визуальная оценка эякулята, балл Lim: min-max 3-5 2-5 3-4 3-5 3-4
M±m 3,9±0,3 4,6±0,1 3,5±0,2 4,0±0,6 3,3±0,2
Сv±mCv 16,7±5,3 14,5±1,9 14,3±3,8 28,9±10,2 13,6±4,3
Концентрация спермиев, млрд/см3 Lim: min-max 0,7-1,8 0,5-6,2 0,9-3,6 0,6-3,7 0,2-0,7
M±m 1,1±0,2 1,6±0,2 2,5±0,4 1,9±0,8 0,3±0,1
Сv±mCv 40,2±12,7 72,1±9,1 37,5±10,1 82,8±29,3 69,9±22,1
Спермато-крит, % Lim: min-max 1,9-6,0 2,6-10,9 2,0-4,7 2-18 2-4
M±m 3,9±0,8 5,8±0,3 3,4±0,4 8,5±3,9 2,6±0,4
Сv±mCv 47,1±14,9 32,3±4,1 29,1±7,8 92,9±32,8 34,4±10,9
Активность спермиев Подвижность, сек. фаза I Lim: min-max 70-120 28-224 33-120 60-180 60-180
M±m 87,2±8,9 95,4±9,2 50,9±11,6 135,0±25,9 120,0±18,9
Сv±mCv 22,7±7,2 54,4±6,8 60,6±16,2 38,5±13,6 35,4±11,2
Подвижность, сек. фаза II Lim: min-max 110-540 77-1667 74-480 420-840 300-540
M±m 269,8±88,3 301,5±75,7 153,6±54,8 660,0±88,3 384,0±44,9
Сv±mCv 73,2±23,2 112,3+17,8 94,4±25,2 26,8±9,5 26,2±8,3
Список литературы
1. Баранникова И.А., Тренклер И.В., Дюбин В.П. Значение метода гормональной стимуляции созревания для сохранения и воспроизводства рыбных запасов // Актуальные проблемы рыбоводства в работах Центральной лаборатории по воспроизводству водных биоресурсов (1938-2008 гг.), к 70-летию работы. - СПб. 2008. С. 17-24.
2. ГончаровБ.Ф. Использование метода
гипофизарных инъекций в рыбоводстве. Некоторые итоги и перспективы // Исследования размножения и развития рыб. - М.: Наука. 1981. С. 16-48.
3. Казаков Р.В., Образцов А.Н. Методы оценки половых клеток рыб: рыбоводная оценка спермы//Обзорная информация. Сер. марикультура. ВНИ-ЭРХ. 1990. № 4. С. 1-54.
4. Лабенец А.В., Чагай В.Н., Шиша-нова Е.И. Качество эякулята самцов русского осетра, выращенных в садковом хозяйстве // Мат-лы межд. научно-практ. конф. «Аквакультура и интегрированные технологии: про-
блемы и возможности» (Москва, 1113 апреля 2005 г.). Т. 2. - М. 2005. С. 58-63.
5. Лисин В.И., Сушко А.Б. Результаты применения Сурфагона в практике искусственного осеменения кроликов // Науково-техшчний бюллетень ГГ НААН. 2013. № 109 (1). С. 174-181.
6. Тренклер И.В., Груслова А.Б. Применение Сурфагона для гормональной стимуляции созревания русского осетра // Мат-лы и докл. межд. симп. «Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридного климата» (Астрахань, 1618 апреля 2007 г.). -Астрахань: Изд-во АГТУ. 2007. С. 371-373.
7. Чебанов М.С., Галич Е.В. Руководство по искусственному воспроизводству осетровых рыб. Технические доклады ФАО по рыбному хозяйству и аквакультуре. № 558. Анкара: ФАО. 2013. 297 с.
8. Scott A.P., Baynes S.M. A review of the biology, handling and storage of salmonid spermatozoa // J. of Fish Biol. 1980. Vol. 17. № 6. Р. 707-739.
Effect of synthetic nanopeptide on spermatogenesis in
sturgeons
A.V. Labenets, G.D. Kapanadze, E.V. Bubunets
Single injections of nanopeptide C56H78N16O12 in a dosage of 2 cm3 of solution concentration of 5 mkg/ml (10 mkg / an individual) steadily induce a sperm allocation at males of sturgeon fishes in the conditions of cultivation. Standard criterions of quality ejaculate and results of functional testing showed their physiological full value and suitability for use in the course of reproduction.
Key words: nanopeptide C56H78N16O12, sturgeons, induction of a sperm allocation, quality of sperm.
55
Biomedicine • № 2, 2014
