CC BY
49
doi: 10.24411/0235-2451-2020-10805 УДК 577.29:574.24:57.047:577.151.42
Влияние Septoria glycines Hemmi на активность гидролитических ферментов сои сорта Лидия
С. И. ЛАВРЕНТЬЕВА12, Н. В. МАРТЫНЕНКО1, Д. К. ЧЕРНЫШУК1, Л. Е. ИВАЧЕНКО12
'Всероссийский научно-исследовательский институт сои, Игнатьевское ш., 19, Благовещенск, Амурская обл., 675027, Российская Федерация
2Благовещенский государственный педагогический университет, ул. Ленина 104, Благовещенск, Амурская обл., 675000, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью анализа ответной реакции семян и проростков сои сорта Лидия (Glycine max (L.) Merr.) на стресс, вызванный грибковой инфекцией Septoria glycines Hemmi (S. glycines), для расширения спектра белковых маркеров, которые необходимы в обеспечении создания новых сортов, устойчивых к S. glycines. Семена сои выращены в Амурской области в 2019 г. на лугово-черноземовидной почве. Отбор семян, зараженных S. glycines, выполняли визуально по морфологическим признакам. Удельную активность гидролитических ферментов (рибонуклеазы, кислой фосфатазы, эсте-разного и амилазного комплексов) и концентрацию малонового диальдегида определяли в семенах сои и их десятидневных проростках, зараженных и незараженных (контроль) септориозом, спектрофотометрическим методом. Множественные формы исследуемых гидролаз выявляли методом электрофореза в 7,5 %-ном полиакриламидном геле. Математическую обработку данных осуществляли с использованием программы Statistics 10. В проростках сои, пораженных S. glycines, наблюдали увеличение концентрации малонового диальдегида на 17 %, относительно контроля, что свидетельствует об окислительном стрессе. Отмечено достоверное увеличение удельной активности гидролаз инфицированных семян сои, по сравнению с контролем: рибонуклеазы - на 40 %, амилазного комплекса - 16 %, эстеразного комплекса - 33 %. Повышение удельной активности амилазного комплекса в пораженных проростках сои, по сравнению с контролем, составило 7 %. Число и электрофоретическая подвижность множественных форм рибонуклеаз, эстераз и амилаз изменялась в ответ на действие патогена. Активность кислых фосфатаз в условиях заражения оставалась стабильной. Рибонуклеаза обладает повышенным уровнем полиморфизма и селективным нейтральным поведением (по отношению к S. glycines на сорте сои Лидия), что открывает возможности для ее использования в качестве белкового маркера.
Ключевые слова: соя (Glycine max), Septoria glycines, окислительный стресс, гидролазы, удельная активность, множественные формы.
Сведения об авторах: С. И. Лаврентьева, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, доцент (e-mail: lana. lavrenteva.1984@mail.ru); Н. В. Мартыненко, младший научный сотрудник; Д. К. Чернышук, научный сотрудник; Л. Е. Иваченко, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, профессор.
Для цитирования: Влияние Septoria glycines Hemmi на активность гидролитических ферментов сои сорта Лидия / С. И. Лаврентьева, Н. В. Мартыненко, Д. К. Чернышук и др. // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т. 34. № 8. С. 33-38. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10805.
Influence of Septoria glycines Hemmi on the activity of hydrolytic enzymes of soybean 'Lidia'
S. I. Lavrent'yeva 12, N. V. Martinenko1, D. K. Chernyshuk1, L. E. Ivachenko12
All-Russian Scientific Research Institute of Soybean, Ignatevsky highway, 19, Blagoveshchensk, Amurskaya obl., 675027, Russian Federation
2BlagoveschenskState Pedagogical University, Lenin street, 104, Blagoveshchensk, Amurskaya obl., 675000, Russian Federation
Abstract. The purpose of the studies was to analyze the response of seeds and seedlings of Lidia soybean variety (Glycine max (L.) Merr.) to stress caused by the fungal infection Septoria glycines Hemmi (S. glycines) to expand the range of protein markers that are necessary for breeding new varieties resistant to S. glycines. Soybean seeds were grown in the Amur region in 2019 on meadow chernozem-like soil. The seeds infected with S. glycines were selected visually by morphological characteristics. The specific activity of hydrolytic enzymes (ribonuclease, acid phosphatase, esterase, and amylase complexes) and the concentration of malondialdehyde were determined spectrophotometrically in soybean seeds and their ten-day-old seedlings infected and uninfected (the control) with septoriosis. Multiple forms of the studied hydrolases were detected by electrophoresis in 7.5% polyacrylamide gel. The data were processed mathematically using the Statistica 10 software. In soybean seedlings infected with S. glycines, we detected an increase in the concentration of malondialdehyde by 17% relative to the control that indicated oxidative stress. We also registered a significant increase in the specific activity of hydrolases of infected soybean seeds, in comparison with the control. The specific activity of ribonuclease increased by 40%; the activity of amylase complex increased by 16%, the activity of esterase complex raised by 33%. The specific activity of the amylase complex in the affected soybean seedlings, in comparison with the control, increased by 7%. The number and electrophoretic mobility of multiple forms of ribonucleases, esterases, and amylases changed in response to the action of the pathogen. The activity of acid phosphatases under conditions of infection remained stable. Ribonuclease is characterized by an increased polymorphism and selective neutral behaviour (in relation to S. glycines in the soybean variety Lydia). This opens up possibilities for its use as a protein marker.
Keywords: soybean (Glycine max); Septoria glycines; oxidative stress; hydrolases; specific activity; multiple forms. Author Details: S. I. Lavrent'yeva, Сand. Sc. (Biol.), leading research fellow, assoc. prof. (e-mail: lana.lavrenteva.1984@mail.ru); N. V. Martynenko, junior research fellow; D. K. Chernyshuk, research fellow; L. E. Ivachenko, D. Sc. (Biol.), leading research fellow, prof. For citation: Lavrent'yeva SI, Martinenko NV, Chernyshuk DK, et al. [Influence of Septoria glycines Hemmi on the activity of hydrolytic enzymes of soybean 'Lidia' ]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2020;34(8):33-8. Russian. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10805.
Соя (Glycine max (L.) Merr) - одна из важных культур мирового сельского хозяйства, которую считают основой решения проблемы дефицита белка. Значительное расширение посевов и повышение урожайности сои во многом обусловлено большим количеством разнообразных сортов, их приспособленностью к климатическим условиям
зоны выращивания и прогрессивными технологиями возделывания. Традиционный лидер Российской Федерации по производству сои - Амурская область, которая ежегодно обеспечивает более 35 % валового сбора семян культуры [1].
Одно из наиболее широко распространенных и вредоносных заболеваний зерновых культур не толь- 33
ко в России, но и в мире - септориоз [2, 3]. Возбудители инфекции - грибы из рода Septoria (S. Nodorum, S. Graminum, S. Tritici, S. Hordei, S. Secalis и др.) [4]. По данным филиала ФГБУ «Россельхозцентр» по Амурской области в 2019 г. из 140,9 тыс. га посевов сои, обследованных на распространение и развитие гриба Septoria glycines (S. glycines), заболеванием было поражено 79,5 тыс. га [5].
Важную роль во взаимоотношениях растений и патогенов играют активные формы кислорода (АФК), которые вызывают перекисное окисление липидов (ПОЛ) или деградацию липидных компонентов в клетке. АФК играют центральную роль в иммунитете растений, их низкие концентрации вызывают активацию защитных генов и развитие адаптивных реакций, а высокие приводят к гибели клеток [6].
Взаимодействие возбудителя и хозяина вызывает значительные изменения в функциональном состоянии растений, что, прежде всего, отражается на молекулярном уровне. С конца ХХ века для сохранения генофонда растений в селекционных программах применяют методы биотехнологии in vitro, включающие методы культуры клеток и тканей и методы генетической инженерии [7]. Для их использования необходимы маркеры, с помощью которых можно контролировать экспрессию генов [8]. Маркерный подход в совершении локальных селекционных проектов - одно из перспективных направлений современной мировой науки [9]. В качестве белковых маркеров для решения самых разных проблем биологии наиболее широко используют изоферментные системы, в частности их множественные формы [10].
В условиях стресса, наблюдаются ферментативные изменения в прорастающих семенах сои [11]. Кроме того, воздействие стрессора регулирует экспрессию различных ферментов, главным образом, гидролитического комплекса, в частности кислой фосфатазы и амилазы [12]. Углеводно-активные ферменты участвуют в синтезе, разложении и модификации углеводов. При этом они представляют собой перспективные биомаркеры [13]. Важно заметить, что карбоксилэстеразы, исторически называемые неспецифическими эстеразами, - повсеместно встречающиеся гидролазы с высокой каталитической эффективностью [14]. В современной науке достоверно подтвержден факт участия в противодействии различным стрессорам рибонуклеаз [15]. Учитывая изложенное, мы отобрали для исследований ферменты гидролазного комплекса: рибонуклеазу (РНКаза) (К.Ф. 3.1), кислую фосфатазу (К.Ф. 3.1.3.2), эстеразу (К.Ф. 3.1.1.X) и амилазу (К.Ф. 3.2.1.1.).
Комплексное изучение природы патогенности микроорганизмов и защитных механизмов растения актуально, как в общебиологическом, так и в практическом отношении (в качестве теоретической основы для разработки новых средств защиты растений и создания, устойчивых к патогенам сортов). Кроме того, уровень активности гидролитических ферментов при инфицировании, может служить дополнительным маркером при анализе степени устойчивости растений к патогену [4].
Цель исследования - изучить влияния S. glycines на активность гидролитических ферментов семян и проростков сои сорта Лидия для расширения спектра белковых маркеров, необходимых при создании новых сортов сои, устойчивых к S. glycines.
Условия, материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали семена сои сорта Лидия, выращенные на лугово-черноземовидной почве в с. Садовое (Амурская область) в 2019 г. Сорт сои Лидия - не только наиболее востребованный у местных производителей (25,5 % площади посевов культуры в Амурской области), но и используется как стандарт в исследованиях [16].
Отбор семян проводили в лабораторных условиях: зараженных S. glycines - визуально по морфологическим признакам (наличие на семядолях округлых красно-коричневых пятен диаметром 6...10 мм с многочисленными пикнидами); незараженых - по чистосортности, всхожести, выровненности и фито-санитарному состоянию семян (здоровье, засоренность). Зараженные и незараженные семена проращивали согласно методике определения зараженности семян (ГОСТ 12044-93), в течение 10 суток при 20 ± 2 °С в темноте. Наличие инфекции определяли по следующим признакам: отдельные коричневые пятна на проростке, которые при этом часто укорачивались; появление на ростках мелких черных бугорков, при этом проростки могли быть искривленными; иногда на оболочке проросших семян образовывались пикниды. Зараженность рассчитывали по ГОСТ 12044-93. Для анализа развития ответной реакции растения на стресс, вызванный грибковой инфекцией Septoria glycines Hemmi в семенах и десятидневных проростках сои, определяли удельную активность и множественные формы ферментов (рибонуклеазы, кислой фосфатазы, эстеразного и амилазного комплексов), а также концентрацию малонового диаль-дегида в двух биологических и трех аналитических повторностях.
Схема опыта предусматривала следующие варианты: 1 - семена без заражения S. glycines (контроль),
2 - семена, зараженные S. glycines (вариант 1),
3 - проростки без заражения S. glycines (контроль),
4 - проростки, зараженные S. glycines (вариант 2).
Экстракт белков сои получали путем гомогенизации семян (500 мг) в 0,15 М NaCl при 4 °С в течение 15 мин. Затем экстракт центрифугировали при 3000 об/ мин в течение 15 мин. Белок определяли по методу Лоури (Lowry, 1951).
Определение содержания МДА (малоновый диальдегид) проводили, основываясь на свойстве этого вещества реагировать при высокой температуре в кислой среде с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), образуя окрашенный триметиновый комплекс в соответствие с методическими указаниями в практикуме по физиологии и биохимии растений (Рогожин В.В., СПб.: Гиорд, 2013). Растительный материал растирали в ступке с небольшим количеством реакционной среды, состоящей из 0,25 %-ного раствора ТБК в 10 %-ном растворе ТХУ. Гомогенат переносили в стеклянную пробирку небольшими порциями реакционной смеси. Конечный объем каждой пробы составлял 4 мл. Пробы перемешивали и помещали в нагретую до 95 °С водяную баню на 30 мин. Затем их резко охлаждали, помещая в сосуд с холодной водой. Содержимое переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (ПромЭколаб) при 532 нм и 600 нм против контроля, содержащего только реакционную смесь.
Удельную активность рибонуклеазы определяли с высокополимерной РНК (Sigma) из дрожжей в
качестве субстрата. К 0,1 мл экстракта белков сои добавляли 0,4 мл 1 %-ной дрожжевой РНК в 0,2 М ацетатном буфере (рН 5,6). Смесь инкубировали при 37 °С в течение 45 мин, затем не гидролизованную РНК осаждали, добавляли к пробам по 1 мл спиртово-магниевого осадителя, после чего пробирки ставили на 1 ч на лед для формирования осадка, который удаляли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин. Из супернатанта отбирали пробы по 0,5 мл, к каждой прибавляли по 3 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 260 нм на спектрофотометре (Про-мЭколаб)против контроля(дистиллированная вода). Параллельно обрабатывали контрольную пробу, в которую вносили спиртово-магниевый осадитель до ферментного раствора.
Удельную активность кислой фосфатазы определяли с п-нитрофенилфосфатом (динатриевая соль) (PanReacAppliChem) в качестве субстрата. Реакционную смесь, состоящую из 0,1 мл экстракта белков сои, 3mM п-нитрофенилфосфат в 1,4 мл 100 тМ ацетатном буфере инкубировали в течение 20 минут при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 2 мл охлажденного 0,1 М NaOH. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре (ПромЭ-колаб) при 415 нм относительно контроля, в который экстракт белка добавляли после раствора щелочи.
Удельную активность эстеразного комплекса определяли по методу Ван Асперна, основанном на том, что в процессе инкубации происходила реакция сочетания между нафтолом, освобождающимся при гидролизе субстрата эстеразой, и солью диазония (прочный синий В) (ДИАЭМ). В результате образовывалось окрашенное в малиновый цвет азосоедине-ние, из которого отбирали пробы по 0,1 мл, прибавляли к каждой 4 мл воды, перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 550 нм на спектрофотометре (ПромЭколаб) против контроля, включающего все компоненты, кроме белка.
Удельную активность амилазного комплекса определяли по количеству нерасщепленного амилазой крахмала на спектрофотометре (ПромЭколаб) после обработки 0,3 %-ным раствором I2 в 3 %-ном водном растворе KI. Для этого в мерные колбы на 50 мл приливали около 30 мл дистиллированной воды, 1 мл 0,1N соляной кислоты, 5 капель 0,3 %-ного I2 в 3 %-ном KI и вносили из каждой пробирки по 0,5 мл смеси. Содержимое колб хорошо перемешивали, доводили до метки и измеряли оптическую плотность при длине волны 670 нм на спектрофотометре (ПромЭколаб) против воды.
Удельную активность ферментов выражали в единицах на мг белка и измеряли согласно учебному пособию по методам изучения полиморфизма ферментов сои (Иваченко Л.Е., Благовещенск, 2008).
Множественные формы ферментов выявляли методом электрофореза в 7,5 %-ном полиакрила-мидном геле при 4 °С по методу Дэвиса (Davis, 1964). На колонку, в качестве метчика, наносили бромфе-ноловый синий (Reanal), 0,1 мл экстракта белков сои и проводили электрофорез на приборе ПЭФ-1 в трис-глициновом буфере (рН 8,3) при температуре 2...6 °С и напряжении 200...500 вольт. В течение 15 минут через колонку пропускали ток 2,5 мА, затем в течение 1,0.1,5 ч - 5 мА.
Места локализации РНКаз на электрофореграмме выявляли после инкубации гелей в 0,5 %-ном рас-
творе РНК в ацетатном буфере с рН 5,7 в течение 30 мин и последующей окраской 0,2 %-ным раствором метиленовым синим (Вектон) в течение 30 мин. Избыток красителя удаляли 5 %-ным раствором уксусной кислоты.
Активность кислых фосфатаз в геле после электрофореза выявляли с 11 mM а-нафтилфосфатом (ДИАЭМ). Гель инкубировали в 100 тМ ацетатном буфере в течение 20 мин при 37 °С. Места локализации форм фермента, в виде ярких розовых полос, устанавливали после окрашивания гелей 2 mM красителем прочным синим Б (ДИАЭМ).
Для выявления активности эстеразного комплекса после электрофореза гели инкубировали 1 мин в 10 %-ном формалине, затем промывали три раза водой и помещали на инкубацию при температуре 37 °С на 10 мин с 0,1М фосфатным буфером и 2 %-ным раствором р-нафтилацетата в водном 50 %-ном растворе ацетона. Затем добавили 0,4 %-ный водный раствор прочного синего В для развития окраски.
Для определения амилазного комплекса гели помещали в холодильник на 30 мин с 1 %-ным раствором крахмала, а затем инкубировали при 37 °С в течение 10 минут в 0,2N ацетатном буфере. После гели помещали в раствор 0,3 %-ного I2 в 3 %-ном растворе KI на 3 мин.
Локализацию форм исследуемых ферментов устанавливали по относительной электрофоретической подвижности (Rf). Каждая форма ферментов сои согласно Rf была обозначена ранее: для эстераз -Э1-Э14, амилаз - А1-А10, РНКаз - Р1-Р12, кислых фосфатаз - КФ1-КФ13 (Л. Е. Иваченко. Благовещенск: БГПУ, 2011).
Экспериментальные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Statistica 10, графическое представление данных - Excel (2010). Результаты выражали как среднее (n = 6) ± стандартное отклонение, различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение. Воздействие биотических стрессоров на растения приводит к ответу, который характеризуется совокупностью неспецифи-
Рис. 1. Содержание МДА в семенах и проростках сои сорта Лидия (2019 г.): 1 - семена без заражения, 2 - семена, зараженные S. glycines, 3 - проростки без заражения, 4 - проростки, зараженные S. glycines.
ческих реакций. Наиболее ранняя реакция растительного организма на проникновение патогена -локальная генерация активных форм кислорода и, как следствие, накопление такого продукта окисления, как МДА [17]. Известно, что содержание МДА может служить показателем активности окислительных процессов и отражать адаптационную способность растений [6].
В результате наших исследований установлено увеличение концентрации МДА относительно контроля в проростках сои, зараженных S. Glycines, на 0,025 мкмоль/г сырой массы, что свидетельствует о наличии окислительного стресса. В семенах сои, зараженных септориозом, также отмечено незначительное повышение концентрации МДА (на 0,011 мкмоль/г сырой массы), в рамках погрешности методики анализа (рис. 1).
Чувствительность растений к фитопатогенам, может выражаться в экспрессии генов, кодирующих синтез новых белков растением-хозяином в ответ на инфекцию [18]. Анализ семян сои, зараженных S. glycines, выявил значительное повышение удельной активности РНКазы (с 0,025±0,002 до 0,042±0,003 ед./мг белка), а также числа множественных форм (с 2 до 4) фермента, относительно контроля. При этом для проростков сои отмечена лишь тенденция к ее увеличению (рис. 2а). Ранее мы уже отмечали повышение удельной активности РНКаз проростков сои в условиях окислительного стресса [19]. В семенах сои отмечены стабильные множественные формы РНКазы - Р3 и Р4, в проростках - Р7 и Р10 (рис. 2б).
эстераз показал наличие стабильных, по отношению к контролю, форм фермента в семенах - Э5 и проростках сои - Э9.
Роль амилаз в процессах патогенеза растений исследована недостаточно. Ранее Яруллиной с соавторами было показано, что инфицирование штаммами возбудителя септориоза различной агрессивности сопровождалось повышением уровня активности амилаз и протеиназ в растительных тканях. При этом в ходе развития инфекционного процесса наблюдалось увеличение активности [21].
Рис. 2. Удельная активность (а) и схема энзимограмм (б) рибонуклез семян и проростков сои (2019 г.): 1 - семена без заражения S. glycines, 2 -семена, зараженные S. glycines), 3 - проростки без заражения S. glycines, 4 -проростки, зараженные S. glycines, стрелка - направление электрофореза от катода к аноду.
Известно, что РНКазная активность, обнаружена у ряда белков патогенеза PR-10 («pathogenesis-related»), так называемых - «индуцируемых белков, связанных с защитой» (Inducible defence-related proteins). Поэтому индукция экстраклеточных РНКаз может быть обусловлена непосредственно формированием устойчивости к патогену [20].
При изучении удельной активности эстеразного комплекса семян и проростков сои, зараженных S. glycines, установлено увеличение удельной активности фермента в семенах в 1,5 раза (рис. 3а). При этом отмечено снижение числа множественных форм эстераз (рис. 3б). В проростках сои, зараженных S. glycines, произошло незначительное увеличение удельной активности фермента, число его множественных форм при этом оставалось стабильным, но изменялась их электрофоретическая подвижность (см. рис. 3). Также анализ энзимограмм
Рис. 3. Удельная активность (а) и схема энзимограмм (б) эстераз семян и проростков сои (2019 г.): 1 - семена без заражения S. glycines, 2 -семена, зараженные S. glycines, 3 - проростки без заражения S. glycines, 4 -проростки, зараженные S. glycines, стрелка - направление электрофореза от катода к аноду.
В результате исследований выявлено незначительное повышение, относительно контроля, удельной активности амилазного комплекса семян и проростков сои, зараженных S. glycines - с 31,23±0,06 до 36,08±0,49 ед/мг белках10-3 в семенах и с 32,54±0,23 до 35,12±0,40 ед/мг белках 10-3 в проростках (рис. 4а). При этом количество множественных форм амилаз в семенах, пораженных S. glycines, увеличивалось (с 3 до 4), а в проростках, напротив, снижалось (с 4 до 3). Следует отметить, что выявленные формы амилаз имели преимущественно низкую электрофоретиче-скую подвижность. Причем, как в семенах, так и проростках сои без заражения S. glycines были выявлены формы А2 и А6, которые, по-видимому, отвечают за сортовую специфичность, что подтверждают результаты ранее проведенных исследований [10]. Отмечены стабильные множественные формы фермента в семенах - А9 и проростках сои - А6 и А10 (рис. 4б).
Анализ фосфатазной активности семян и проростков сои, показал стабильную активность фер-
И 0,1 i
Rf
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 б) 1
A10
A9
A8
A4 A3 A2
Рис. 4. Удельная активность (а) и схема энзимограмм (б) амилаз семян и проростков сои (2019 г.): 1 - семена без заражения S. glycines, 2 -семена, зараженные S. glycines, 3 - проростки без заражения S. glycines, 4 -проростки, зараженные S. glycines, стрелка - направление электрофореза от катода к аноду.
A6
0
+
а)
2
3
4
Рис. 5. Удельная активность (а) и схема энзимограмм (б) кислых фосфатаз семян и проростков сои (2019 г.): 1 - семена без заражения S. glycines, 2 -семена, зараженные S. glycines), 3 - проростки без заражения S. glycines, 4 -проростки, зараженные S. glycines, стрелка - направление электрофореза от катода к аноду.
мента в условиях инфицирования S. glycines (рис. 5). То же самое отмечали и другие исследователи [21, 22].
Изучение множественных форм кислых фосфатаз семян и проростков сои сорта Лидия в условиях биотического стресса, позволило зафиксировать всего по две формы фермента, которые оказались стабильными, что свидетельствует о низком полиморфизме кислых фосфатаз. Отметим, что в проростках выявленные формы фермента обладали только невысокой электрофоретической подвижностью.
Таким образом, в исследуемых биотических условиях отмечены незначительные изменения удельной активности исследуемых гидролитических ферментов сои сорта Лидия. При этом число их множественных форм либо уменьшалось относительно контроля, либо оставалось стабильным.
Выводы. В проростках сои, пораженных S. glycines, наблюдали увеличение концентрации МДА,
по сравнению с пораженными семенами (на 0,021 мкмоль/г сырой массы), что свидетельствует об окислительном стрессе.
Анализ удельной активности гидролаз семян и проростков, пораженных S. glycines, выявил тенденцию к ее увеличению относительно контрольных образцов: рибонуклеазы - на 0,017 и 0,012 ед/мг белка; эстеразного комплекса - на 0,017 и 0,007 ед/ мг белка; амилазного комплекса - на 4,846 и 2,58 ед/ мг белка*10-3; кислой фосфатазы - на 0,02 и 0,014 ед/мг белка соответственно.
Число и электрофоретическая подвижность множественных форм рибонуклеаз, эстераз и амилаз семян и проростков сои сорта Лидия изменялись в ответ на действие патогена. В зараженных S. glycines, семенах сои число множественных форм амилаз и рибонуклеаз увеличилось (с 3 до 4 и с 2 до 4 соответственно), а число эстераз уменьшилось (с 4 до 3). При этом подвижность форм амилаз снизилась, а эстераз увеличилась. В зараженных S. glycines проростках сои число амилаз и рибонуклеаз уменьшилось (с 4 до 3 для обоих ферментов), а подвижность эстераз заметно снизилась. При этом множественные формы кислых фосфатаз в условиях заражения оставались стабильными.
Впервые в семенах и проростках сои сорта Лидия, зараженных S. glycines, выявлено 7 форм рибонуклеаз, 5 форм эстераз, 6 форм амилаз и 3 формы кислых фосфатаз. Наибольшее число форм установлено для рибонуклеаз (7), по-видимому, с участием этого фермента усиливается метаболизм для противостояния растения биотическому фактору (S. glycines). Рибонуклеаза обладает повышенным уровнем полиморфизма и селективным нейтральным поведением (по отношению к S. glycines на сорте сои Лидия), что позволяет использовать ее в качестве белкового маркера.
Литература.
1. Синеговский М. О. Перспективы производства сои в Дальневосточном Федеральном округе // Вестник российской сельскохозяйственной науки. 2020. № 1. С. 13-16. doi: 10.30850/vrsn/2020/1/13-16.
2. Carmona M. A., Sautua F. J., Perez-Hernandez O. Copper phosphite enhances efficacy of a strobilurin-triazole fungicide in controlling late season foliar diseases of soybean // Crop protection. 2019. Vol. 115. P. 130-134. doi: 10.1016/j. cropro.2018.09.019.
3. Ng S. J., Lindsey L. E., Michel A. P. Effect of mid-season foliar fungicide and foliar insecticide applied alone and in-combination on soybean yield// Crop forage & turfgrass management. 2018. Vol. 4. No. 1. P. 1-6. doi: 10.2134/cftm2017.09.0067.
4. Активность пектиназ и их ингибиторов в листьях яровой пшеницы в связи с устойчивостью сортов к Septoria nodorum Berk/ Р. И. Ибрагимов, И. А. Шпирная, В. О. Цветков и др. // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. 2013. Т. 25. № 1. С. 30-32.
5. Итоги мониторинга на выявление вредителей и болезней в посевах сои// Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский сельскохозяйственный центр [Электронный ресурс] URL: https://rosselhoscenter.com/index.php/ otdel-zashchity-rastenij-60/20435-spetsialistami-otdela-zashchity-rastenij-podvedeny-itogi-monitoringa-na-vyyavlenie-vreditelej-i-boleznej-v-posevakh-soi (дата обращения 25.03.2020).
6. Effects of dietary cyanidin-3-diglucoside-5-glucoside complexes with rutin/Mg(II) against H2O2-induced cellular oxidative stress / X. Wei, Z. Nan, Z. Zhenhong, et al. // Food research international. 2019. Vol. 126. Article 108591. doi: 10.1016/j. foodres.2019.108591.
7. Оценка трансгенных растений сои (Glycine max (L.) Merr.) на устойчивость к фитопатогенам / О. С. Ефремова, Л. А.Дега, Е. К. Нодельман и др.// Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. 2016. № 4. С. 25-30.
8. Мухина Ж. М., Дубина Е. В. Молекулярные маркеры и их использование в селекционно-генетических исследованиях // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2011. № 02(066) С. 97-107. [Электронный ресурс]. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/molekulyarnye-markery-i-ih-ispolzovanie-v-selektsionno-geneticheskih-issledovaniyah (дата обращения 04.04.2020).
9. Zatybekov A., Abugalieva S., Didorenko S. GWAS of a soybean breeding collection from South East and South Kazakhstan for resistance to fungal diseases // Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii. 2018. Vol. 22. No. 5. P. 536-543. doi: 10.18699/ vj18.392.
10. Иваченко Л. Е. Ферменты как маркеры адаптации сои к условиям выращивания. Благовещенск: БГПУ, 2011. 192 с.
11. Михайлова М. П. Роль пероксидазы в повышении устойчивости растений сои к неблагоприятным факторам // Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2019. № 3 (205). С. 139-144. doi: 10.25808/08697698.2019. 205.3.024.
12. Radhakrishnan R. Exposure of magnetic waves stimulates rapid germination of soybean seeds by enzymatic regulation in cotyledons and embryonic axis // Biocatalysis and agricultural biotechnology. 2019. Vol. 20. Article 101273. doi: 10.1016/j. bcab.2019.101273.
13. CUPRA-ZYME: an assay for measuring carbohydrate-active enzyme activities, pathways, and substrate specificities/L. Zhixiong, P. Kitov, E. Kitova, et al. //Analytical chemistry. 2020. Vol. 92. No. 4. P. 3228-3236. doi: 10.1021/acs.analchem.9b05007.
14. Pig liver esterases PLE1 and PLE6: heterologous expression, hydrolysis of common antibiotics and pharmacological consequences / Q. Zhou, Q. Xiao, Y. Zhang, et al. // Scientific reports. 2019. Vol. 9. P. 1-12. doi: 10.1038/s41598-019-51580-4.
15. Proteomic mechanism of decabromodiphenyl ether (BDE-209) biodegradation by Microbacterium Y2 and its potential in remediation of BDE-209 contaminated water-sediment system / Y. Yuanyuan, Y. Hua, P. Hui, et al.// Journal of hazardous materials. 2020. Vol. 387. Article 121708. doi: 10.1016/j.jhazmat.2019.121708.
16. Антонова Н. Е., Синеговский М. О. Соеводство в Амурской области в разрезе глобального и национального трендов // Регионалистика. 2016. № 2. С. 21-35.
17. Карпун Н. Н., Янушевская Э. Б., Михайлова Е. В. Механизмы формирования неспецифического индуцированного иммунитета у растений при биогенном стрессе // Сельскохозяйственная биология. 2015. Т. 50. № 5. С. 540-549. doi: 10.15389/agrobiology.2015.5.540rus.
18. Чесноков Ю. В. Устойчивость растений к патогенам (обзор иностранной литературы) // Сельскохозяйственная биология. 2007. № 1. С. 16-35.
19. Рибонуклеазная активность проростков сои в условиях окислительного стресса / С. И. Лаврентьева, О. А. Терехова, Л. Е. Иваченко и др. // Вестник камчатского государственного технического университета. 2019. № 47. С. 79-85. doi: 10.17217/2079-0333-2019-47-79-85.
20. The activity of hydrolases and their protein inhibitors in potato tissues at Phytophthora infestans infection and stability inductors processing / L. G. Yarullina, R. I. Ibragimov, I. A. Shpirnaya, et al. // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2018. Vol. 9. No. 3. Pp. 1042-1048.
21. Яруллина Л. Г., Ахатова А. Р., Касимова Р. И. Активность гидролаз и их белковых ингибиторов в листьях пшеницы при обработке салициловой ижасмоновой кислотами и инфицировании штаммами Septoria Nodorum различной агрессивности // Прикладная биохимия и микробиология. 2017. Т. 53. № 5. С. 490-496.
22. Семенова Е. А., Титова С. А., Дубовицкая Л. К. Активность ферментов у сортов сои с различной степенью устойчивости к септориозу//Достижения науки и техники АПК. 2012. № 4. С. 24-26.
References
1. Sinegovskii MO. [Prospects for the production of soybean in the Far Eastern Federal District]. Vestnik rossiiskoi sel'skokhozyaistvennoi nauki. 2020;(1):13-6. Russian. doi: 10.30850/vrsn/2020/1/13-16.
2. Carmona MA, Sautua FJ, Perez-Hernandez O. Copper phosphite enhances efficacy of a strobilurin-triazole fungicide in controlling late season foliar diseases of soybean. Crop protection. 2019;115:130-4. doi: 10.1016/j.cropro.2018.09.019.
3. Ng SJ, Lindsey LE, Michel AP. Effect of mid-season foliar fungicide and foliar insecticide applied alone and in-combination on soybean yield. Crop forage & turfgrass management. 2018;4(1):1-6. doi: 10.2134/cftm2017.09.0067.
4. Ibragimov RI, Shpirnaya IA, Tsvetkov VO, et al. [Activity of pectinases and their inhibitors in spring wheat leaves in relation to cultivar resistance to Septoria nodorum Berk]. Vestnik Bashkirskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2013;25(1):30-2. Russian.
5. [Russian Agricultural Center] [Internet]. Moscow: Rscenter; 2020. [Results of monitoring to identify pests and diseases in soybean]; 2020 Feb 18 [cited 2020 Mar 25]; [about 10 screens]. Available from: https://rosselhoscenter.com/index.php/otdel-zashchity-rastenij-60/20435-spetsialistami-otdela-zashchity-rastenij-podvedeny-itogi-monitoringa-na-vyyavlenie-vreditelej-i-boleznej-v-posevakh-soi. Russian.
6. Wei X, Nan Z, Zhenhong Z, et al. Effects of dietary cyanidin-3-diglucoside-5-glucoside complexes with rutin/Mg(II) against H2O2-induced cellular oxidative stress. Food research international. 2019;126: Article 108591. doi: 10.1016/j.foodres.2019.108591.
7. Efremova OS, Dega LA, Nodel'man EK, et al. [Assessment of transgenic soybean plants (Glycine max (L.) Merr.) for resistance to phytopathogens]. Maslichnye kul'tury. Nauchno-tekhnicheskii byulleten' Vserossiiskogo nauchno-issledovatel'skogo instituta maslichnykh kul'tur. 2016;(4):25-30. Russian.
8. Mukhina ZhM, Dubina EV. [Molecular markers and their use in breeding and genetic research]. Politematicheskii setevoi elektronnyi nauchnyi zhurnal Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [Internet]. 2011 [cited 2020 Apr 4];(2):97-107. Available from: https://cyberleninka.ru/article/n/molekulyarnye-markery-i-ih-ispolzovanie-v-selektsionno-geneticheskih-issledovaniyah. Russian.
9. Zatybekov A, Abugalieva S, Didorenko S. GWAS of a soybean breeding collection from South East and South Kazakhstan for resistance to fungal diseases. Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii. 2018;22(5):536-43. doi: 10.18699/vj18.392.
10. Ivachenko LE. Fermenty kak markery adaptatsii soi k usloviyam vyrashchivaniya [Enzymes as markers of soybean adaptation to growing conditions]. Blagoveshchensk (Russia): BGPU; 2011. 192 p. Russian.
11. Mikhailova MP. [The role of peroxidase in increasing the resistance of soybean plants to adverse factors]. Vestnik Dal'nevostochnogo otdeleniya Rossiiskoiakademii nauk. 2019;(3):139-44. Russian. doi: 10.25808/08697698.2019.205.3.024.
12. Radhakrishnan R. Exposure of magnetic waves stimulates rapid germination of soybean seeds by enzymatic regulation in cotyledons and embryonic axis. Biocatalysis and agricultural biotechnology. 2019;20: Article 101273. doi: 10.1016/j. bcab.2019.101273.
13. Zhixiong L, Kitov P, Kitova E, et al. CUPRA-ZYME: an assay for measuring carbohydrate-active enzyme activities, pathways, and substrate specificities. Analytical chemistry. 2020;92(4):3228-36. doi: 10.1021/acs.analchem.9b05007.
14. Zhou Q, Xiao Q, Zhang Y, et al. Pig liver esterases PLE1 and PLE6: heterologous expression, hydrolysis of common antibiotics and pharmacological consequences. Scientific reports. 2019;9:1-12. doi: 10.1038/s41598-019-51580-4.
15. Yuanyuan Y, Hua Y, Hui P, et al. Proteomic mechanism of decabromodiphenyl ether (BDE-209) biodegradation by Microbacterium Y2 and its potential in remediation of BDE-209 contaminated water-sediment system. Journal of hazardous materials. 2020;387: Article 121708. doi: 10.1016/j.jhazmat.2019.121708.
16. Antonova NE, Sinegovskii MO. [Soybean breeding in the Amur Region in terms of global and national trends]. Regionalistika. 2016;(2):21-35. Russian.
17. Karpun NN, Yanushevskaya EB, Mikhailova EV. [Mechanisms of the formation of nonspecific induced immunity in plants under biogenic stress]. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2015;50(5):540-9. Russian. doi: 10.15389/agrobiology.2015.5.540rus.
18. Chesnokov YuV. [Plant resistance to pathogens (review of foreign literature)]. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2007;(1):16-35. Russian.
19. Lavrent'eva SI, Terekhova OA, Ivachenko LE, et al. [Ribonuclease activity of soybean seedlings under oxidative stress]. Vestnik kamchatskogo gosudarstvennogo tekhnicheskogo universiteta. 2019;(47):79-85. Russian. doi: 10.17217/2079-03332019-47-79-85.
20. Yarullina LG, Ibragimov RI, Shpirnaya IA, et al. The activity of hydrolases and their protein inhibitors in potato tissues at Phytophthora infestans infection and stability inductors processing. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2018;9(3):1042-8.
21. Yarullina LG, Akhatova AR, Kasimova RI. [Activity of hydrolases and their protein inhibitors in wheat leaves during treatment with salicylic and jasmonic acids and infection with Septoria Nodorum strains of various aggressiveness]. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2017;53(5):490-6. Russian.
22. Semenova EA, Titova SA, Dubovitskaya LK. [Enzyme activity in soybean varieties with varying degrees of resistance to Septoria]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2012;(4):24-6. Russian.
