CC BY
11
УДК 57.084.1;616.995.121
https://doi.org/10.31016/978-5-6046256-9-9.2022.23.490-496
влияние секреторно-экскреторных продуктов плероцеркоидов лентеца чаечного
dibothriocephalus dendriticus и лигулы
lígula interrupta на воспалительную активацию макрофагов
Челомбитько М. А.
кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела математических методов в биологии,
chelombitko@mail.bio.msu.ru
Павлюченкова А. Н. 12,
научный сотрудник лаборатории паразитологии и экологии гидробионтов, нженер 1-ой категории отдела молекулярной энергетики микроорганизмов,
anabella.gen@gmail.com
Кутырев И. А. 2,
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории паразитологии и экологии гидробионтов,
ikutyrev@yan dex.ru
Мазур О. Е. 2,
кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории паразитологии и экологии гидробионтов,
olmaz33@yandex.ru
Дугаров Ж. Н. 2,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории паразитологии и экологии гидробионтов,
zhar-dug@biol.bscnet.ru
Аннотация
В данной работе впервые был исследован противовоспалительный потенциал секреторно-экскреторных продуктов (СЭП) плероцеркоидов лентеца чаечного D. dendriticus и лигулы L. interrupta в модели ЛПС-индуцированной
1 Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова (119992, Россия, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40)
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (670047, Россия, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, д. 6)
активации макрофагов in vitro. В качестве модели макрофагов была использована клеточная линия моноцитов, полученная от пациента с острым моноцитарным лейкозом, THP-1. Клетки дифференцировали в макрофаги с помощью форболового эфира. Противовоспалительные свойства СЭП определяли по содержанию в инкубационной среде провоспалительных Thl-цитокинов ФНО и ИЛ-6, а также антивоспалительных ^2-цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 с помощью коммерческих наборов для иммуноферментного анализа. Результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о том, что инкубация макрофагов с СЭП от плероцеркоидов L. interrupta в концентрации 100 мкг/мл в течение ночи приводила к двукратному снижению содержания Thl-цитокинов ФНО и ИЛ-6 в среде культивирования в ходе ЛПС-индуцированной активации макрофагов. Предварительная инкубация макрофагов с СЭП от плероцеркоидов D. dendriticus в течение ночи не влияла на содержание в среде Thl-цитокинов ФНО и ИЛ-6. Таким образом, результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о том, СЭП от плероцеркоидов L. interrupta обладают выраженным противовоспалительным эффектом, в то время как СЭП от плероцеркоидов D. dendriticus таким эффектом не обладают. При этом механизм противовоспалительного действия СЭП от L. interrupta не выяснен и требует дальнейшего исследования.
Ключевые слова: лентец чаечный, D. dendriticus, лигула, L. interrupta, макрофаги
the effect of excretory/secretory products
from dibothriocephalus dendriticus plerocercoids of gull tapeworm and ligula interrupta ligula on inflammatory activation of macrophages
Chelombitko M. A. 1,
Candidate of Biological Sciences, Researcher of the Department of Mathematical Methods in Biology, chelombitko@mail.bio.msu.ru
Pavlyuchenkova A. N. 12,
Researcher of the Laboratory of Parasitology and Ecology of Aquatic Organisms, Engineer of the 1st Category of the Department of Molecular Energetics of Microorganisms, anabella.gen@gmail.com
1 A. N. Belozersky Research Institute of Physico-Chemical Biology of Lomonosov Moscow State University (1, Leninskye Gory, Bldg. 40, Moscow, 119992, Russia)
2 Institute of General and Experimental Biology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (6, Sakhyanovoi st., Ulan-Ude, 670047, Russia)
Kutyrev I. A. 2,
Doctor of Biological Sciences, Leading Researcher of the Laboratory of Parasitology and Ecology of Aquatic Organisms,
ikutyrev@yan dex.ru
Mazur O. E. 2,
Candidate of Biological Sciences, Researcher of the Laboratory of Parasitology and Ecology of Aquatic Organisms,
olmaz33@yan dex.ru
Dugarov Zh. N. 2,
Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher of the Laboratory of Parasitology and Ecology of Aquatic Organisms,
zhar-dug@biol.bscnet.ru
Abstract
In this paper, the anti-inflammatory potential of excretory/secretory products (ESP) from plerocercoids of D. dendriticus gull tapeworm and L. interrupta ligula was estimated for the first time in the model of LPS-induced activation of macrophages in vitro. A monocyte cell line derived from a patient with acute monocytic leukemia, THP-1, was used as a macrophage model. Cells were differentiated into macrophages using phorbol myristate acetate. The anti-inflammatory properties of ESP were determined by measurement of pro-inflammatory Thl-cytokines TNF and IL-6, as well as anti-inflammatory Th2-cytokines IL-4 and IL-10, in the incubation medium using commercial kits for Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. The results of our study demonstrated that overnight incubation of macrophages with ESP from plerocercoids of L. interrupta at a concentration of 100 ^g/ml led to a twofold decrease in the content of Thl-cytokines TNF and IL-6 in medium during LPS-induced activation of macrophages. Pre-treatment of macrophages with ESP from plerocercoids of D. dendriticus overnight did not affect the content of Thl-cytokines TNF and IL-6. The results of our study indicated that ESP from L. interrupta has a pronounced anti-inflammatory effect, while ESP from D. dendriticus does not have such an effect. At the same time, the mechanism of the anti-inflammatory action of ESP from L. interrupta has not been elucidated and requires further research.
Keywords: gull tapeworm, D. dendriticus, ligula, L. interrupta, macrophages
Введение. В последние два десятилетия усилился интерес к использованию иммунорегуляторных свойств секреторно-экскреторных продуктов (СЭП) гельминтов для терапии воспалительных и аллер-
2 Institute of General and Experimental Biology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (6, Sakhyanovoi st., Ulan-Ude, 670047, Russia)
гических заболеваний [2, 5]. Имеются сведения о том, что паразиты и их СЭП могут оказывать противовоспалительный эффект, в частности, за счет влияния на макрофаги, клетки врождённого иммунитета, играющие ключевую роль в регуляции воспаления [1, 4]. Информации об иммунорегуляторах в классе Cestoda крайне мало [3]. В связи с этим в настоящей работе мы исследовали противовоспалительный потенциал СЭП плероцеркоидов D. dendriticus и L. interrupta в модели ЛПС-индуцированной активации макрофагов in vitro.
Материалы и методы. Для получения СЭП плероцеркоидов D. dendriticus и L. interrupta паразитов извлекали из полости тела хозяев, промывали в 0,65% физиологическом растворе для холоднокровных животных и помещали в раствор Хенкса, содержащим 105 МЕ/л пенициллина и 100 мг/л линкомицина, инкубировали 6 ч при 40С. Белковые фракции СЭП плероцеркоидов D. dendriticus и L. interrupta получали путем объединения инкубационной среды и ее центрифугирования в концентрирующих колонках с диаметром пор 3 kDa. В полученных фракциях измеряли белок по Брэдфорд, далее образцы фильтровали через фильтры с размером пор 0,22 мкм. Оценка противовоспалительных свойств СЭП D. dendriticus и L. interrupta была проведена на клеточной линии моноцитов, полученной от пациента с острым моноцитарным лейкозом, THP-1. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 2 мМ глутамина при 37 0C и 5% CO2. Для экспериментов клетки высеивали на 96- и 12-луночные плашки в концентрации 500,000 клеток/мл и дифференцировали их в макрофаги путем инкубации с форболовым эфиром в концентрации 100 нМ в течение 48 часов. Для исследования цитотоксичности СЭП цестод использовали резазуриновый тест. Для исследования противовоспалительных свойств СЭП цестод клетки инкубировали с СЭП в течение ночи, далее добавляли 100 нг/мл ЛПС на 3 часа. В инкубационной среде измеряли содержание цитокинов ФНО и ИЛ-6, ИЛ-4 и ИЛ-10 с помощью коммерческих наборов для иммуно-ферментного анализа. Статистическая обработка данных и построение графиков проводились в программе GraphPad Prism 8.0. Для оценки статистической значимости отличий применяли тест множественных сравнений Даннета. Все данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения (n>3).
Результаты исследований. Для того, чтобы оценить цитотоксиче-ский эффект СЭП плероцеркоидов на дифференцированные клетки THP-1 мы провели резазуриновый тест. Результаты этого анализа по-
казали, что инкубация клеток в течение 24 часов с СЭП плероцеркои-дов D. dendriticus и Ь. Шеггир1а с содержанием белка в диапазоне от 1 до 100 мкг/мл не приводит к снижению жизнеспособности клеток (рис. 1).
Рис. 1. Влияние СЭП плероцеркоидов D. dendriticus (А) и Ь. Швггир1а (Б) на жизнеспособность дифференцированных клеток THP-1
Для оценки противовоспалительного эффекта СЭП плероцеркоидов D. dendriticus и Ь. interrupta на ЛПС-индуцированную активацию макрофагов определяли концентрации ТЫ-цитокинов ФНО и ИЛ-6, а также Th2-цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 в среде культивирования. Анализ результатов данного исследования показал, что предварительная инкубация макрофагов с СЭП от плероцеркоидов D. dendriticus в течение ночи не влияет на содержание в среде ТЫ-цитокинов ФНО и ИЛ-6 ни в одной из исследуемых концентраций, что свидетельствует об отсутствии эффекта на ЛПС-индуцированную активацию (рис. 2). В тоже время, предварительная инкубация дифференцированных клеток ТНР-1 с СЭП от плероцеркоидов Ь. interrupta в концентрации 100 мкг/мл в течение ночи приводила к двукратному снижению содержанию ТЫ-цитокинов ФНО и ИЛ-6 в среде культивирования в ходе ЛПС-индуцированной активации клеток, что свидетельствует о противовоспалительном эффекте (рис. 2). Стоит отметить, что концентрация Th2-цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 в среде культивирования не превышала 20 пг/мл и не менялась под воздействием СЭП обоих видов цестод и ЛПС (данные не представлены).
Заключение. Полученные результаты, в целом, свидетельствуют о том, что СЭП плероцеркоидов Ь. interrupta обладает выраженным противовоспалительным эффектом в модели ЛПС-индуцированной
Рис. 2. Влияние СЭП от плероцеркоидов D. dendriticus (А, Б) и L. interrupta (В, Г) на ЛПС-индуцированную воспалительную активацию дифференцированных клеток THP-1.
(А, В) Относительное содержание цитокина ФНО в инкубационной среде. (Б, Г) Относительное содержание цитокина ИЛ-6 в инкубационной среде. **** p < 0,0001 по сравнению с ЛПС
активации макрофагов THP-1, в то время как СЭП от плероцеркоидов D. dendriticus таким эффектом не обладает. При этом механизм противовоспалительного действия СЭП плероцеркоидов L. interrupta не выяснен и требует дальнейшего исследования.
Авторы выражают благодарность Елизову А. В., Селиванову А. В., Попову А. Г., Никонову Д. П. (Байкальский специализированный участок по борьбе с болезнями рыб и других гидробионтов, Республика Бурятия), Жепхоловой О. Б. (ИОЭБ СО РАН) за помощь в сборе материала. Оценка противовоспалительных свойств секреторно-экскреторных продуктов цестод в модели ЛПС-индуцированной активации макрофагов THP-1 была проведена в ИОЭБ СО РАН при финансовой поддержке РНФ (грант 22-24-00341); поиск и анализ литературных источников, консультации по методике выполнения работ, анализ полученных результатов и написание статьи было проведено в НИИ ФХБ МГУ.
Список источников / References
1. Bai X., Wu X., Wang X., et al. Regulation of cytokine expression in murine macrophages stimulated by excretory/secretory products from Trichinella spiralis in vitro. Mol CellBiochem. 2012; 360: 79-88.
2. Harnett W. Secretory products of helminth parasites as immunomodulators. Mol Biochem Parasitol. 2014; 195(2): 130-136.
3. Kutyrev I. A., Biserova N. M., Olennikov D. N., Korneva J. V., Mazur O. E. Prostaglandins E2 and D2-regulators of host immunity in the model parasite Diphyllobothrium dendriticum: An immunocytochemical and biochemical study. Mol Biochem Parasitol. 2017; 212: 33-45.
4. Wang Z., Hao C., Zhuang Q., et al. Excretory/secretory products from Trichinella spiralis adult worms attenuated DSS-induced colitis in mice by driving PD-1-mediated M2 macrophage polarization. Front. Immunol. 2020; 11: 563784.
5. Wu Z., Wang L., Tang Y., Sun X. Parasite-derived proteins for the treatment of allergies and autoimmune diseases. Front. Microbiol. 2017; 8: 2164.
