CC BY
67
УДК 631.4 М.П. Сартаков, В.В. Леонов
ВЛИЯНИЕ ЩЕЛОЧНЫХ РАСТВОРОВ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ТОРФОВ СРЕДНЕГО ПРИОБЬЯ НА АКТИВНОСТЬ ЛИПАЗЫ
В статье исследовано влияние щелочных растворов гуминовых кислот торфов. Сделаны выводы, что все исследованные образцы гуминовых кислот торфов Среднего Приобъя имеют биологическую активность по тесту ингибирования фермента липазы.
Ключевые слова: гуминовые кислоты, биологическая активность, липаза, Среднее Приобье.
M.P. Sartakov, V.V. Leonov INFLUENCE OF PEAT HUMIC ACID ALKALINE SOLUTION ON LIPASE ACTIVITY IN MIDDLE PRIOBYE
Peat humic acid alkaline solution influence is researched in the article. The conclusions that all researched peat humic acid samples of Middle Priobye have biological activity according to the test of lipase enzyme inhibition are drawn.
Key words: humic acids, biological activity, lipase, Middle Priobye.
Введение. Многочисленные работы указывают на существование положительных биологических эффектов при взаимодействии гуминовых кислот с живыми организмами [1, 5].
Чаще всего гуминовые кислоты применяют в растениеводстве как стимуляторы роста и микроудобрения [4]. Поэтому, если говорить о гуминовых кислотах как о ростовых веществах, то очень важно их влияние на липидные мембраны, где липидный слой подвергается постоянно, как правило, воздействию различных внешних факторов, что приводит к образованию пероксидов липидов, которые очень долго живут и токсичны для растений. Поражение молекул липидов, их окисление и получение перекисных липидов происходит под влиянием различных стрессов. В природе растения испытывают многократно стрессовые состояния под действием экстремальных температур и дефицита или избытка влаги. Мембраны все время повреждаются за счет накопления липазы, фермента, который разрушает липидный слой [3, 6].
Объекты и методы исследований. В качестве объектов исследований нами были использованы препараты гуминовых кислот, выделенных из поверхностных слоев верховых, переходных и низинных торфов Среднего Приобья. Извлечение проводилось по ранее описанной методике [2].
Изучалось ингибирующее влияние щелочных растворов гуминовых кислот с концентрацией 0,001 % на фермент липазу, которая содержится в тестовом препарате TRIGLYCERIDES GRO-PAP method/liguid, произведенный фирмой Chonolab AG (Швеция), и может расщеплять триглицериды стандартного расвора. Рабочий реагент, кроме того, имеет в своем составе для приближения к естественным стабильным природным условиям дыхательные ферменты: пероксидазу, оксидазу и каталазу, которые не учавствуют в расщеплении липидов и являются переносчиками О2 и Н2 в растительной клетке.
Определение ингибирующего действия гуминовых кислот на липазу проведено спектрофотометрическим методом.
Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определенных участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами ферментов, субстратами или продуктами реакции. Этот метод отличается высокой чувствительностью, быстротой определения, малым расходованием фермента и реактивов и позволяет следить за течением реакции во времени. Для этого в 1 см (l) кювету последовательно вносят с помощью микропипетки 0,1 мл одного из приготовленных растворов триглицеридов
Вестник^КрасТАУ 2011. №6
и 2 мл рабочего реагента из набора Chronolab; полученный раствор тщательно перемешивают стеклянной палочкой и сразу включают секундомер. Кювету помещают в кюветное отделение КФК (Л=505 нм), выводят на ноль и измеряют оптическую плотность D исследуемого раствора против раствора сравнения, записывая результаты через каждые 30 с. Раствор сравнения готовят, добавляя 0,1 мл дистиллированной воды к 2 мл рабочего реагента. Измерение продолжают до тех пор, пока значения оптической плотности не перестанут изменяться. Аналогично проводят измерения для всех приготовленных растворов.
Этот процесс протекает по свободнорадикальному механизму с накоплением чрезвычайно токсичных перекисных низкомолекулярных радикалов.
Результаты исследований и их обсуждение. Макромолекулы гуминовых кислот можно рассматривать как стабильные свободные радикалы, способные к рекомбинации при взаимодействии с агрессивными свободными радикалами перекисей липидов, т.е. быть их «ловушками». Этот эффект проявляется в подавлении активности фермента липазы под действием гуминовых кислот.
Определяя подавление активности липазы, можно говорить о характере влияния гуминовых кислот на растения биологической активности.
Идея мембранного эффекта обсуждается в научной литературе сейчас очень часто. Она не всеми авторами связывается со свободными радикалами, но учитывается, что гуминовые кислоты не проходят внутрь клетки, так как размеры их слишком велики в сравнении с параметрами пор растений и составляют 100-200А в свернутом состоянии в виде глобулярной структуры.
Гуминовые кислоты производят инактивацию поврежденного липидного слоя. Своим спиновым воздействием и системой полисопряжения электроны влияют на те реакции, которые происходят на самой мембране. Наши результаты подтверждают эти положения.
Мембранные эффекты играют очень важную роль. Признается, что мембрана состоит из липидного и белковых слоев, но основную роль играют липиды и изменение их структуры. Липидным мембранам клетки придается большое значение в метаболических процессах. Они позволяют задерживать и выбрасывать токсичные вещества, не давая им проникнуть внутрь клетки. Поэтому их поражение может носить глобальный характер.
Гуминовые кислоты являются адаптогенами, они лучше действуют в стрессовом состоянии на растения и в профилактических целях.
Для ингибирования использовались щелочные растворы гуминовых кислот с концентрацией 0,0001 %, которые извлекились из торфов различного ботанического состава и степени разложения.
По мере протекания ферментативного гидролиза липидов раствор из слабо-желтой окраски приобретает красную окраску в результате протекания каскада ферментативных реакций, приводящих к образованию окрашенного хинонимина:
triglycerides + H2O LiPase glycerol + fatty acid glycerol + АТП —glycerol-3-phosphate + ADP glycerol-3-phosphate + О-2 GPO ► dihydroxyacetone phosphate +H2O2 2H2O2 + 4-aminoantipyrin + 4- chlorophenol POD ► guinoneimine + HCl + +4H2O.
Для выявления ингибирования липазы гуминовой кислотой была рассчитана и изучена активность фермента в присутствии гуминовой кислоты.
Активность липазы определяли по формуле
Alip — (ck-Do/Dk • ck)^^.,
где Alip - активность липазы;
ck - концентрация контроля;
D0 - оптическая плотность;
Dk - оптическая плотность контроля;
икуб. - время инкубации.
Активность липазы без добавления гуминовых кислот определили по отношению концентрации ко времени инкубации (табл.).
Ингибирование активности липазы
Вид исходного торфа к % Активность липазы, ммоль л-1мин-1
Без гуминовых кислот -- 0,53
Пушицево-сфагновый 65 0,22
Пушицевый 55 0,16
Вахтовый 60 0,25
Древесный 45 0,16
Сфагновый 15 0,26
Травяной 15 0,26
Сфагновый (100 % фускум) 5 0,10
Древесный 10 0,21
Травяно-сфагновый 35 0,14
Древесный 25 0,19
Примечание. R - степень разложения.
Из полученных данных видно, что активность липазы снижается в присутствии гуминовых кислот. Наибольшую ингибирующую активность на липазу оказал препарат гуминовой кислоты, извлеченный из сфагнового торфа, состоящего на 100 % из сфагнума бурого со степенью разложения 5 %.
Гуминовая кислота этого торфа в сравнении с другими препаратами характеризуется особой химической структурой - меньшей степенью бензоидности и конденсированности молекул, высокой долей алифатических фрагментов и концентрации парамагнитных центров.
Выводы
1. Установлено ингибирующее действие гуминовых кислот торфов Среднего Приобья на активность липазы, которая может рассматриваться как мера биологической активности гуминовых. Содержание липазы снижается на 50-80 %.
2. Наибольший эффект антисептического действия выявлен у препарата, извлеченного из однородного по ботаническому составу сфагнового торфа с низкой степенью разложения.
Литература
1. Бирюков М.В. Биологическое действие гуминовых кислот и его пространственная локализация в почве: дис. ... канд. биол. наук. - М., 2006. - 103 с.
2. Комиссаров И.Д., Стрельцова И.Н. Влияние способа извлечения гуминовых кислот из сырья на химический состав полученных препаратов // Науч. тр. Тюменского СХИ. - 1971. - Т. 14. - С. 34-48.
3. Комиссаров И.Д., Климова А.А. Влияние гуминовых кислот на биокаталитические процессы // Науч. тр. Тюменского СХИ. - 1971. - Т. 14. - С. 225-242.
4. Перминова И.В. Гуминовые вещества - вызов химикам XXI века // Химия и жизнь. - 2008. - № 1. -
С. 17-23.
5. Попов А.И. Гуминовые вещества: свойства, строение, образование - СПб.: Изд-во СПб. ун-та, 2004. -
248 с.
6. Христева Л.А. Влияние гуминовых кислот на рост растений при различном соотношении питательных веществ в начале развития // Докл. ВАСХНИЛ. - 1947. - С. 23-29.
