Влияние ростовых факторов на эндотелиальную дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека in vitro Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

36

Материалы III Международного Симпозиума «Актуальные вопросы клеточных технологий»

в течение 2—4 мес., выращивали в дифференциро-вочных условиях in vitro. При использовании 12 культуральных сред различного состава, было создано 16 дифференцированных клеточных линий фибробластной морфологии, которые были трансплантированы in vivo в сочетании с ГА/ТФК носителями. Через 8—16 нед. во многих трансплантатах была сформирована гистологически несомненная костная ткань человеческого происхождения. Она была хорошо минерализованной, имела пластинчатую структуру и состояла из многочисленных, тесно переплетённых трабекул. Эта кость по своим размерам значительно превосходила все костные структуры, построенные in vivo клетками — потомками ЭСКч, которые были описаны ранее. Культуральные среды, созданные на основе DMEM, с добавлением ЭБС, дексаметазона и аскорбата, способствовали существенно более частому образованию кости. Напротив, среды, основанные на —МЕМ, благоприятствовали развитию тератом. В клетках дифференцированных линий — потомков HSF-6 уровни транскрипции генов, связанных с плюрипотентностью (0ct4, Nanog), остеогенезом (Coll I, Runx2, ALP, BSP) и хонд-рогенезом (Coll II и X, Aggrecan), не коррелировали с образованием ни кости, ни тератом. Полученные результаты намечают новые пути к созданию костной ткани на основе ЭСКч или собственных ИПС клеток человека.

Н.В. Ламовская, М.М. Зафранская, Г.Я. Хулуп Влияние ростовых факторов на эндотелиальную дифференцировк у мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека in vitro

Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Беларусь natkhripach@tut.by

N.V. Lamouskaya, М.М. Zafranskaya, G.Ya. Khulup The Influence of Growth Factors on Endothelial Differentiation of Human Multipotential Mesenchymal Stromal Cells into Endothelial-like Cells in vitro

Цель исследования. Изучить влияние ростовых факторов на дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) в эндотелиальном направлении по экспрессии эндотелиальных и мезенхимальных маркеров дифференцируемыми культурами для оптимизации протокола направленной дифферен-цировки ММСК в эндотелиоциты.

Материал и методы. Для получения ММСК моно-нуклеары костного мозга и обработанный коллагеназой липоаспират засевали в культуральные чашки в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки коров, 2 мМ L-глутамина и антибиотики. Индукцию эндотелиальной дифференцировки ММСК проводили культивированием в питательной среде т199 с пониженным содержанием сыворотки в присутствии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), фактора роста фибробластов (FGF), и различных комбинаций ростовых факторов: VEGF+FGF, VEGF+инсулиноподобный фактор роста (IGF), VEGF+FGF+IGF+эпидермальный фактор роста (EGF). Эффективность дифференцировки оценивали по экспрессии маркеров CD90, CD31, CD34 методом проточной цитометрии. В качестве положительного контроля использовали культуры эндотелиальных клеток пуповинной вены (ЭКПВ) человека.

Результаты определения маркеров при различных способах индукции эндотелиальной дифференцировки были подвергнуты кластерному анализу. Дальнейшее сравнение выделенных кластеров (подгрупп) проводили с использованием непараметрического 11-критерия Манна-Уитни. Клеточный прирост в культурах вычисляли по формуле: П = N/N(3, где П — клеточных прирост в течение пассажа, N, — количество полученных клеток; N(3 — количество посеянных клеток. Сравнение клеточного прироста при дифференцировке и в контроле в параллельных опытах (связанные группы) проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Ме (25-й — 75-й процентили).

Результаты. Недифференцированные ММСК КМ и ЖТ человека характеризовались сходной фиброблас-топодобной морфологией и стабильным фенотипом С090+/С0105+/С044+/С0347С0317С045- ЭКПВ и ММСК различались по экспрессии молекул С031, С034, характерных для эндотелиальных клеток, и С090, являющегося маркером ММСК и не экспрессирующегося на эндотелиоцитах в стандартных условиях культивирования.

При проведении кластерного анализа установлено, что культуры ММСК, в которых индукция эндотелиальной дифференцировки осуществлялась с использованием комбинации факторов роста, включающей как минимум \ZEGF и Р6Р, формируют отдельный кластер (подгруппу) за счет максимального изменения экспрессии изучаемых маркеров. В подгруппе, где для индукции дифференцировки использовалась комбинация факторов, включающая \ZEGF и Р6Р, экспрессия маркеров С031 и С034 была выше, а маркера С090 — ниже, чем в подгруппе культур, где дифференцировка индуцировалась с использованием только одного фактора (УЕОР или РОР), либо комбинации факторов, включающей УЕОР и ЮР, причем обнаруженные различия являются статистически значимыми (таблица).

Экспрессия маркеров С1Э90, С031 и С1Э34 в культурах клеток при использовании различных способов индукции направленной дифференцировки в эндотелиоциты

Подгруппа способов индукции дифференцировки

и

к

Маркер Комбинация факторов роста, включающая VEGF и FGF Использование в качестве индукторов дифференциров VEGF или FGF или VEGF+IGF Значение р

CD9O 66,6% (S8,S-71,6%) 94% (87-99,S%) O,O21

CD31 6S,3% (S1,7-47%) O,6%2(O,S-O,8%) O,O2O

CD34 S1,2S% (14,2-81%) O,4% (O,1-1,7S%) O,O42

При культивировании ММСК в присутствии комбинации факторов УЕОР+РОР в среде т199 с пониженным содержанием сыворотки отмечался меньший клеточный прирост по сравнению со стандартными условиями культивирования (соответственно, 1,54 (0,71—1,54) и 4 (4—7,62), р<0,05). При культивировании в присутствии комбинации ростовых факторов

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010