CC BY
7
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 3
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ BIOLOGICAL SCIENCES
Научная статья УДК 663.15, 66.098
doi: 10.18522/1026-2237-2023-3-140-146
ВЛИЯНИЕ рН И СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ДЕГИДРОГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ESCHERICHIA COLn
Мария Валерьевна Дмитриева1 Василий Дмитриевич Мязин2, Екатерина Викторовна Золотухина1'3
1:2,3Федеральный исследовательский центр проблем химической физики и медицинской химии РАН, Черноголовка, Россия
Московский государственный университет, Москва, Россия Московский физико-технический институт, Долгопрудный, Россия 1angel. maria@mail. ruB 2vasily-miazin@yandex.ru 3zolek@icp. ac. ru
Аннотация. «Грубые» экстракты - новый перспективный тип биоэлектрокатализаторов для биотопливных элементов. Способ получения «грубого» экстракта путем дезинтегрирования мембран бактериальных клеток (например, ультразвуком) в сравнении с чистыми энзимами более прост и экономичен. С научной точки зрения изучение биокаталитических свойств «грубых» экстрактов весьма интересно, поскольку дезинтегрированная биомасса содержит каскад ферментов, участвующих в метаболизме микроорганизмов, и коферменты, необходимые для окислительного/восстановительного превращения. Этот набор биоактивных веществ позволяет в искусственной среде моделировать процессы, протекающие при работе «природного» топливного элемента.
Изучено влияние рН и состава питательной среды LB, используемой при выращивании E. coli, на де-гидрогеназную активность белковых экстрактов, полученных из данной культуры. Показано, что, подбирая рН и модифицируя состав питательной среды LB, можно увеличить значение удельной дегидроге-назной активности экстрактов практически в 9 раз (с 0,25 до 2,2 мг/мг).
Ключевые слова: биоэлектрокатализаторы, белковые экстракты, E. coli, дегидрогеназная активность, питательная среда LB
Благодарности: данная работа проводилась в рамках выполнения государственного задания (номер госрегистрации АААА-А19-119061890019-5). Работа М.В. Дмитриевой была поддержана стипендией Президента Российской Федерации № СП-5461.2021.1.
Для цитирования: Дмитриева М.В., Мязин В.Д., Золотухина Е.В. Влияние рН и состава питательной среды на дегидрогеназную активность экстрактов, полученных из Escherichia coli // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2023. № 3. С. 140-146.
Статья опубликована на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC-BY 4.0).
© Дмитриева М.В., Мязин В.Д., Золотухина Е.В., 2023
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 3
Original article
EFFECT OF pH AND NUTRIENT MEDIUM COMPOSITION ON DEHYDROGENASE ACTIVITY OF EXTRACTS OBTAINED FROM ESCHERICHIA COLI
Maria V. Dmitrieva1B, Vasily D. Myazin2, Ekaterina V. Zolotukhina1'3
'•2' 3Federal Research Center of Problems of Chemical Physics and Medicinal Chemistry RAS, Chernogolovka, Russia
Moscow State University, Moscow, Russia
Moscow Institute of Physics and Technology, Dolgoprudny, Russia 'angel. maria@mail. ruB 2vasily-miazin@yandex.ru 3zolek@icp. ac. ru
Abstract. "Crude" extracts are a new perspective type of bioelectrocatalysts for biofuel cells. The method of obtaining a "crude " extract by disintegrating bacterial cell membranes (for example, by ultrasound) is simpler and more economical in comparison with pure enzymes. From a scientific point of view, the study of the biocatalytic properties of "crude " extracts is very interesting, since the disintegrated biomass contains a cascade of enzymes involved in the metabolism of microorganisms and coenzymes necessary for oxidative/reductive transformation. This set of bioactive substances makes it possible to simulate the processes occurring during the operation of a "natural" fuel cell in an artificial environment. The effect of the pH and composition of the LB nutrient medium used in the cultivation of E.coli on the dehydrogenase activity of protein extracts obtained from this culture was studied. It is shown that by selecting the pH and modifying the composition of the LB nutrient medium, it is possible to increase the value of the specific dehydrogenase activity of extracts by almost 9 times (from 0.25 to 2.2 mg/mg).
Keywords: bioelectrocatalysts, protein extracts, E. coli, dehydrogenase activity, LB nutrient medium
Acknowledgments: this work was carried out within the framework of the state task (state registration number AAAA-A'9-''906'8900'9-5). The work ofM. V. Dmitrieva was supported by the scholarship of the President of the Russian Federation No. SP-5461.202'.'.
For citation: Dmitrieva M.V., Myazin V.D., Zolotukhina E.V. Effect of pH and Nutrient Medium Composition on Dehydrogenase Activity of Extracts Obtained from Escherichia Coli. Bulletin of Higher Educational Institutions. North Caucasus Region. Natural Science. 2023;(3):140-146. (In Russ.).
This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC-BY 4.0).
Введение
Среди известного многообразия биологических катализаторов можно выделить три типа: чистые энзимы, микроорганизмы и биомиметики. Ранее нами был предложен новый тип биоэлек-трокатализатора - «грубые» экстракты, представляющие собой дезинтегрированную биомассу микроорганизма, очищенную от клеточных мембран [1-4]. С научной точки зрения изучение биокаталитических свойств «грубых» экстрактов весьма интересно, поскольку такие экстракты содержат каскад ферментов, участвующих в метаболизме микроорганизмов, и коферменты, необходимые для окислительного-восстановительного превращения.
ISSN 1026-2237 ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. СЕВЕРО-КАВКАЗСКИЙ РЕГИОН. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ._2023. № 3
ISSN 1026-2237 BULLETINOFHIGHEREDUCATIONALINSTITUTIONS. NORTHCAUCASUSREGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 3
Для получения наибольшей каталитической активности необходима оптимизация технологии синтеза экстракта, одной из важных стадий которой является выращивание культуры микроорганизмов. Из ключевых параметров, влияющих на формирование дегидрогеназных ферментных систем, отметим рН и состав питательной среды, используемые при выращивании культуры.
Оптимальное значение рН цитоплазмы E. coli находится в пределах 7,6-7,8. Тем не менее E. coli могут жить в среде с pH в диапазоне от 5 до 9, но скорость деления клеток при этом уменьшается. Для поддержания внутреннего рН клетки задействуют различные механизмы, в частности транспорт кислот (или протонов) через мембрану, метаболизм аминокислот, регуляцию метаболизма глюкозы [5]. Соответственно, регулируя внешний рН, можно добиться оптимальных для роста и выработки дегидрогеназ условий при выращивании E. coli.
Следующий фактор - ионы металлов, необходимые для формирования дегидрогеназ и метаболизма клетки в целом. В [3] методом атомно-абсорбционной спектроскопии было установлено, что в экстракте E. coli представлены только ионы Fe (0,01 мкмоль/мг) и Mg (0,01 мкмоль/мг). Магний является одним из важнейших бивалентных катионов в клетке [6]. Важное свойство магния - его способность создавать активную форму АТФ [7], стабилизировать структуру нуклеиновых кислот и белков, выступая в роли кофактора [8].
Ферменты, для которых магний является кофактором: гексокиназа, глюкозо-6-фосфат-изоме-раза, фосфофруктокиназа, фосфоглицераткиназа, фосфоглицеромутаза, енолаза, пируваткиназа, пируват-дегидрогеназный комплекс, изоцитратдегидрогеназа, а-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс и другие [9].
Ионы железа, требуемые для жизнедеятельности культуры, в зависимости от степени окисления и условий выращивания микроорганизма (аэробные, анаэробные) могут быть дефицитными или оказывать токсическое действие. Так, в анаэробных условиях железо может существовать в форме Fe2+, стабильной в кислой среде. При переходе к аэробным условиям с повышенным значением pH ионы Fe2+ достаточно быстро превращаются в плохорастворимые, особенно при рН >4, ионы Fe3+ [10]. Тем не менее у клеток бактерий есть механизмы по захвату и малорастворимых комплексов железа (3+) путем перевода их в растворимые. Чтобы захватить плохорастворимые ионы Fe3+, бактерии используют сидерофоры-комплексообразователи. Сидерофоры образуют растворимые комплексы с железом, которые бактерии захватывают. В число ферментов, использующих ионы железа, входят фумараза, аконитаза, сукцинатдегидрогеназа, белки, отвечающие за метаболизм ароматических соединений, цитохромы, ферридоксины, железо-серные белки и другие [11].
Поэтому в данной работе изучали влияние рН, добавок ионов магния и железа в состав питательной среды Lysogeny broth (LB), применяемой при выращивании E. coli, на дегидрогеназную активность экстрактов (ДГА), полученных из данной культуры.
Методика эксперимента
Получение белкового экстракта из E. coli. Бактерии выращивали в среде LB, содержащей 1 % (в/о) пептона Bacto™ (BD, США), 0,5 % (в/о) дрожжевого экстракта Bacto™ (BD, США), 1 % (в/о) NaCl, 0,1 % (в/о) глюкозы и различные концентрации солей металлов в зависимости от эксперимента. Питательную среду доводили до нужного значения pH с помощью 3М раствора NaOH. Затем ее стерилизовали в автоклаве Tuttnauer 3870 EL (Tuttnauer, Израиль) при 121 °С в течение 20 мин. Колонию E. coli BB, выращенную на твердой среде (LB, 2%-й агар), инокулиро-вали в 10 мл LB для получения ночной культуры. Ночную культуру (1 мл) вносили в 100 мл LB в колбах 500 мл и выращивали при 37 °С с интенсивной аэрации. Через 6 ч после начала выращивания бактерии осаждали центрифугированием при 1700 g и использовали для получения экстракта.
Осажденные бактерии ресуспендировали в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, pH 7,2, из расчета 1 мл на 50 мл выращенной культуры. Клетки разрушали на льду, на ультразвуковом дезинтеграторе Sonoplus (Bandelin, Германия) в течение 8 мин 10 с, циклами (10 с - дезинтеграция, 10 с - перерыв) при 100%-й мощности. Экстракты осветляли центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин.
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 3
Определение ДГА. ДГА полученных экстрактов определяли при помощи 2,3,5-трифенилтет-разолия хлорида (ТТХ), который под действием дегидрогеназ восстанавливается до окрашенного ТТХ-формазана, как было описано в [4].
Определение белка в экстрактах. Определение содержания белка вели по методу Бенедикта [12], используя спектрофотометрический метод детекции с помощью спектрофотометра Multiscan sky (Thermoscientific, Германия) при длине волны 330 нм.
Результаты и обсуждение
Показана возможность использования «грубых» экстрактов E. coli в качестве перспективных биоэлектрокатализаторов. При этом было установлено, что для электрохимических исследований рекомендуется брать экстракт, полученный из 6-часовой культуры, соответствующей периоду экспоненциальной фазы роста E. coli (рис. 1) [3]. Показано, что для экстракта из 6-часовой культуры E. coli в отношении глюкозы (топливо для биотопливных элементов), максимальное значение удельной ДГА составляет 0,25 мг/мг [4].
ДГА экстрактов напрямую коррелирует с их электрохимической активностью [4]. Повышая значения ДГА, можно увеличить вольтамперные характеристики биоэлектрохимических систем, работающих с участием экстрактов.
Первоначально оптимизировали рН питательной среды, используемой для выращивания. С этой целью 6-часовая культура клеток E. coli была получена в питательной среде LB с рН от 7,20 до 8,35. Как видно из рис. 2, выход белка начинает увеличиваться от значения рН 7,56, достигая максимального значения при рН 8,17, что говорит о создании оптимальных условий по выработке наибольшего количества белков для 6-часовой культуры при таких значениях pH.
о о
о
Q
О
10 15 Время, ч
20
25
Рис. 1. Кривая роста E. coli. / Fig. 1. E. coli growth curve
Рис. 2. Влияние рН питательной среды LB, используемой при выращивании E. coli, на содержание белка в экстрактах, полученных из выращенной культуры / Fig. 2. LB nutrient medium pH effect on the protein content in extracts obtained from the E. coli culture grown on that medium
Как видно из рис. 3, ДГА, оцениваемая количеством образовавшегося формазана, мг/мл экстракта, и удельная ДГА (ДГА, отнесенная на мг белка) повышаются в 2,7 раза для белковых экстрактов с ростом рН среды выращивания от 7,20 до 7,91, достигая максимума.
С дальнейшим повышением рН наблюдается снижение ДГА. Таким образом, можно заключить, что максимальное количество белка, вырабатываемого при более высоких рН, не означает выработку именно дегидрогеназ и не гарантирует их высокую активность. При этом следует отметить, что в процессе жизнедеятельности клетка выделяет кислоты в окружающую среду, понижая тем самым рН среды [5, 6]. Следовательно, если клетки выращиваются в течение 6 ч в зоне оптимального рН, они будут находиться наибольшее время при исходном рН среды (около 8).
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 3
Следующий фактор, который варьировали при выращивании микроорганизмов, - добавка солей магния и железа в питательную среду. Исходили из предположения, что эти добавки могут привести к увеличению ДГА, поскольку у клеток будут ресурсы для синтеза ферментов, использующих данные ионы металлов [9, 11]. В качестве добавок применяли сульфат магния и сульфат железа (II). Как видно из рис. 4, добавка 0,2 г Mg2+ (0,81 мМ) и 0,1 или 0,2 г Бе2+ (0,36 мМ и 0,72 мМ соответственно) не оказывает влияние на содержание белка в экстрактах (рис. 4).
С
I—I «
а/а
1-Н
S
аз
i-Q
Ц
ID
et
0,8
0,6
0,4
6/Ъ
M
7,2 7,4 7,6 7,8 pH
8,0 8,2 8,4
7,2 7,4 7,6
7,8 pH
1,0 8,2 8,4
Рис. 3. Влияние рН питательной среды LB, используемой при выращивании E. coli, на ДГА (а) и удельную ДГА (б) в экстрактах, полученных из выращенной культуры / Fig. 3. LB nutrient medium pH effect on the dehydrogenase activity (a) and specific dehydrogenase activity (b) of extracts obtained
from the E. coli culture grown on that medium
Состав питательной среды
Рис. 4. Влияние добавок различных солей металлов в питательную среду LB на содержание белка в экстрактах, полученных из выращенной 6-часовой культуры / Fig. 4. The effect of cation addition to LB nutrient medium on the protein content in extracts obtained from the E. coli culture grown on that medium
Однако добавление солей Mg2+ в концентрации 0,81 мМ и Fe2+ в концентрациях 0,36 и 0,72 мМ приводит к заметному росту удельной ДГА экстракта (рис. 5), причем наиболее выраженному для добавки 0,72 мМ Fe2+. Таким образом, посредством модификации состава питательной среды LB удалось увеличить удельную ДГА в 3,2 раза.
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 3
g
S
S
<
u
10
8 6 4 2 0
a/a
LB I.B I LB+ LB +
0,81 mM 0,36 mM ,72 mM
Mg Fe Fe
Состав питательной среды
ч s
s <
I—I
х л
R
к
П >
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
б/Ь
LB LB+ LB+ LB +
0,81 мМ 0,36 Мм 0,72 мМ
Mg Fe Fe
Состав питательной среды
Рис. 5. Влияние добавок различных солей металлов в питательную среду LB на ДГА (а) и удельную (б) экстрактов, полученных из выращенной культуры / Fig. 5. The effect of cation addition to LB nutrient medium on the dehydrogenase activity (a) and specific dehydrogenase activity (b) of extracts obtained
from the E. coli culture grown on that medium
Заключение
Выполненные исследования показали, что, варьируя рН и минеральный состав питательный среды, используемой для выращивания культуры E. coli, можно непосредственно влиять на величину удельной ДГА белковых экстрактов, получаемых из 6-часовой культуры. Найденное оптимальное значение питательной среды LB находится в диапазоне 7,9-8,2, а наиболее важной добавкой является 0,72 мМ Fe2+. Сочетая влияние обоих факторов, удельную ДГА 6-часовой культуры E. coli удалось увеличить в 8,8 раза (с 0,25 до 2,2 мг/мг).
Список источников
1. Dmitrieva M.V., Zolotukhina E.V. Data describing the cofactor additives effect on bioelectrocatalytic activity of "crude" extracts // Data in brief. 2020. Vol. 30. P. 105-513.
2. DmitrievaM.V., ShishovI.N., Shmalii S.V., Myazin V.D., Bazhenov A.Yu., Gerasimova E.V., Zolotukhina E.V. Kinetics of Mediated Bioelectrocatalytic Oxidation of Glucose by Protein Extracts of Escherichia coli // Russian J. of Electrochemistry. 2020. Vol. 56, № 11. P. 938-945.
3. Dmitrieva M.V., Gerasimova E.V., Terent 'eva A.A., Dobrovol 'skii Yu.A., Zolotukhina E.V. Electrochemical peculiarities of mediator-assisted bioelectrocatalytic oxidation of glucose by a new type of bioelectrocatalyst // Russian J. of Electrochemistry. 2019. Vol. 55, № 9. P. 889-899.
4. Dmitrieva M.V., Zolotukhina E.V., Gerasimova E.V., Terent 'eva A.A., Dobrovol 'skii Yu.A. Dehydrogenase and electrochemical activity of Escherichia coli extracts // Applied Biochemistry and Microbiology. 2017. Vol. 53, № 4. P. 458-463.
5. Maurer L.M., Yohannes T., Bondurant S.S., Radmacher M., Slonczewski J.L. pH regulates genes for flagellar motility, catabolism, and oxidative stress in Escherichia coli K-12 // J. of Bacteriology. 2005. Vol. 187, № 1. P. 304-319.
6. MaguireM.E., Papp-WallaceK.M. Magnesium transport and magnesium homeostasis // EcoSal Plus. 2008. Vol. 3, № 1.
7. Wacker W.E. C. The biochemistry of magnesium // Annals of the New York Academy of Sciences. 1969. Vol. 162. P. 717-726.
8. Kehres D.G., Maguire M.E. Emerging themes in manganese transport, biochemistry and pathogenesis in bacteria // FEMS Microbiology Reviews. 2003. Vol. 27, № 2-3. P. 263-290.
9. CampbellM., Farrell S. Biochemistry. 7th ed. Cengage Learning, 2012. 481 p.
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 3
10. Cao J., Woodhale M., Alvazez J., Cartron M., Andrews S. EfeUOB (YcdNOB) is a tripartite, acid-induced and CpxAR-regulated, low-pH Fe2+ transporter that is cryptic in Escherichia coli K-12 but functional in E. coli O157: H7 // Molecular Microbiology. 2007. Vol. 65, № 4. P. 857-875.
11.AndrewsS.C. Iron storage in bacteria // Advances in Microbial Physiology. 1998. Vol. 40. P. 281-351.
12. Itzhaki R.F., Gill D.M. A micro-biuret method for estimating proteins // Analytical Biochemistry. 1964. Vol. 9, № 4. P. 401-410.
References
1. Dmitrieva M.V., Zolotukhina E.V. Data describing the cofactor additives effect on bioelectrocatalytic activity of "crude" extracts. Data in Brief. 2020;30:105-513.
2. Dmitrieva M.V., Shishov I.N., Shmalii S.V., Myazin V.D., Bazhenov A.Yu., Gerasimova E.V., Zolotukhina E.V. Kinetics of Mediated Bioelectrocatalytic Oxidation of Glucose by Protein Extracts of Escherichia coli. Russian Journal of Electrochemistry. 2020;56(11):938-945.
3. Dmitrieva M.V., Gerasimova E.V., Terentiev A.A., Dobrovol'skii Yu.A., Zolotukhina E.V. Electrochemical Peculiarities of Mediator-Assisted Bioelectrocatalytic Oxidation of Glucose by a New Type of Bioelectrocat-alyst. Russian Journal of Electrochemistry. 2019;55(9):889-899.
4. Dmitrieva M.V., Zolotukhina E.V., Gerasimova E.V., Terentiev A.A., Dobrovol'skii Yu.A. Dehydrogenase and electrochemical activity of Escherichia coli extracts. Applied Biochemistry and Microbiology. 2017;53(4):458-463.
5. Maurer L.M., Yohannes E., Bondurant S.S., Radmacher M., Slonczewski J.L. pH Regulates Genes for Flagellar Motility, Catabolism, and Oxidative Stress in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 2005; 187(1):304-319.
6. Maguire M.E., Papp-Wallace K.M. Magnesium Transport and Magnesium Homeostasis. EcoSal Plus. 2008;3(1).
7. Wacker W.E.C. The biochemistry of magnesium. Annals of the New York Academy of Sciences. 1969;162:717-726.
8. Kehres D.G., Maguire M.E. Emerging themes in manganese transport, biochemistry and pathogenesis in bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 2003;27(2-3):263-290.
9. Campbell M.K., Farrell S.O. Biochemistry. 7th ed. Belmont, CA: Brooks/Cole, Cengage Learning, 2012. 481 p.
10. Cao J., Woodhall M., Alvarez J., Cartron M., Andrews S. EfeUOB (YcdNOB) is a tripartite, acid-induced and CpxAR-regulated, low-pH Fe 2+ transporter that is cryptic in Escherichia coli K-12 but functional in E. coli O157:H7: Low pH, Fe 2+ transporter in E. coli. Molecular Microbiology. 2007;65(4):857-875.
11. Andrews S.C. Iron Storage in Bacteria. Advances in Microbial Physiology. 1998;40:281-351.
12. Itzhaki R.F., Gill D.M. A micro-biuret method for estimating proteins. Analytical Biochemistry. 1964;9(4):401-410.
Информация об авторах
М.В. Дмитриева - младший научный сотрудник. В.Д. Мязин - лаборант, студент.
Е.В. Золотухина - доктор химических наук, заведующая лабораторией электродных процессов в жидкостных системах.
Information about the authors
M.V. Dmitrieva - Junior Researcher. V.D. Myazin - Laboratory Assistant, Student.
E.V. Zolotukhina - Doctor of Science (Chemistry), Head of Laboratory of Electrode Processes in Liquid Systems.
Статья поступила в редакцию 12.04.2023; одобрена после рецензирования 12.05.2023; принята к публикации 20.06.2023. The article was submitted 12.04.2023; approved after reviewing 12.05.2023; accepted for publication 20.06.2023.
