CC BY
42
original article
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.36-002-022-085.373.012
Олейник Е.А.1, Леплина О.Ю.1, Тыринова Т.В.1, Тихонова М.А.1, Пыринова Г.Б.2, Останин А.А.1, Старостина Н.М.1, Черных Е.Р.1
ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ CORE И NS3 ВИРУСА ГЕПАТИТА С НА СОЗРЕВАНИЕ И ФУНКЦИИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, ГЕНЕРИРУЕМЫХ IN VITRO В ПРИСУТСТВИИ ИНТЕРФЕРОНА-а
1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, г Новосибирск, Россия;
2 ЗАО «Вектор-Бест», 630117, г Новосибирск, Россия
Использование вакцин на основе дендритных клеток (ДК) рассматривают в качестве перспективной стратегии для запуска иммунного ответа при хроническом вирусном гепатите С. При этом важными факторами, определяющими эффективность ДК-вакцин, учитывая иммуносупрессивные свойства вирусных антигенов, служит выбор вирусных белков и типа ДК. Цель работы — оценка влияния рекомбинантных вирусных белков HCV Core (1—120) и NS3 (1192—1457) на созревание и функции ДК, генерированных из моноцитов крови в присутствии GM-CSF и интерферона-а (ИФН-ДК). Исследовали влияние краткосрочной инкубации ИФН-ДК с вирусными белками на экспрессию поверхностных маркеров, продукцию цитокинов, а также аллостимуляторную активность ДК и их способность стимулировать Т-клетки к продукции Th1- и Т1п2-цитокинов в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ). Нагрузка ИФН-ДК рекомбинантными HcV Core и NS3 белками не влияла на экспрессию HLA-DR, CD80 и CD25 и умеренно снижала уровень экспрессии CD83. Исследуемые вирусные белки также не оказывали ингибирующего эффекта на продукцию дендритными клетками TNFa, IL-6 и IL-10, не подавляли аллостимуляторную активность ИФН-ДК и не изменяли их ТМ/Т1п2-стимулирующей активности в СКЛ. Таким образом, рекомбинантные HCV белки Core (1—120) и NS3 (1192—1457) при совместном краткосрочном культивировании с ИФН-ДК не оказывали какого-либо выраженного ингибирующего эффекта на созревание и функции ИФН-ДК.
Ключевые слова: дендритные клетки; ИФН-a; рекомбинантные HCV белки.
Для цитирования: Олейник Е.А., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Пыринова Г.Б., Останин А.А., Старостина Н.М., Черных Е.Р. Влияние рекомбинантных белков Core и NS3 вируса гепатита C на созревание и функции дендритных клеток, генерируемых in vitro в присутствии интерферона-а. Иммунология. 2016; 37(5): 239-245. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-239-245
Oleynik E.A.1, Leplina O.Yu.1, Tyrinova T.V.1, Tikhonova MA.1, Pyrinova G.B.2, Ostanin A.A.1, Starostina N.M.1, Chernykh E.R.1
THE INFLUENCE OF RECOMBINANT HCV PROTEINS CORE AND NS3 ON MATURATION AND FUNCTIONS OF DENDRITIC CELLS GENERATED IN VITRO WITH INTERFERON-ALPHA
1 Research Institute of Fundamental and clinical Immunology, 630099, Novosibirsk, Russian Federation;
2 «vektor-Best», 630117, novosibirsk, Russian Federation
Dendritic cell-based vaccines seem to be a promising strategy for induction of the immune response in chronic viral hepatitis C. Given the immunosuppressive properties of the viral antigens the kind of viral proteins and the type of dendritic cells (DCs) are the important factors that determine the effectiveness of DC-vaccines. The main aim of the current research is to study whether recombinant HCV proteins Core (1—120) and NS3 (1192—1457) influence the maturation and functions of DCs, generated by culturing of blood monocytes with GM-CSF and interferon-alpha (IFN-DC). We investigated the effect of short-term preincubation with Core and NS3 antigens on surface marker expression and cytokine production by IFN-DCs as well as their allostimulatory and Th1/Th2-stimulatory activity in mixt lymphocyte culture (MLC). The loading of IFN-DCs with viral proteins didn't change the expression of HLA-DR, CD80, CD25 and slightly decreased CD83. The recombinant HCV proteins also failed to suppress the production of TNF-alpha, IL-6 and IL-10 by IFN-DCs and did not suppress their allostimulatory and Th1/Th2 stimulatory activity in MLC. Thus, the short-term loading of DCs with recombinant HCV proteins Core (1—120) and NS3 (1192—1457) have no any marked inhibitory effect on maturation and functions of IFN-DCs.
Keywords: dendritic cells; IFN-alpha; recombinant HCV proteins.
For citation: OleynikE.A., Leplina O.Yu., Tyrinova T.V., TikhonovaM.A., Pyrinova G.B., OstaninA.A., StarostinaN.M., Chernykh E.R. The influence of recombinant hcv proteins core and ns3 on maturation and functions of dendritic cells generated in vitro with interferon-alpha. Immunologiya. 2016; 37(5): 239-245. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-239-245 For correspondence: Ekaterina A. Oleynik, graduate student of the Research Institute of Fundamental and clinical Immunology, E-mail: ct_lab @ mail.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. The study had no sponsorship.
Received 25.05.16 Accepted 07.06.16
Д ля корреспонденции: Олейник Екатерина Александровна, аспирант НИИ фундаментальной и клинической иммунологии, E-mail: ct_lab @ mail.ru
оригинальные статьи
Хронический гепатит С (ХГС) характеризуется широкой распространенностью, является одной из наиболее частых причин поражения печени и существенно повышает риск развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [1]. Механизмы пер-систенции вируса гепатита С (HCV) связывают с его высокой генетической изменчивостью [2] и иммуно-супрессивными свойствами, в результате чего иммунная система оказывается не способной элиминировать вирус [3].
Используемые в современном лечении ХГС препараты интерферона-a (в виде монотерапии или в сочетании с рибавирином) имеют ограниченную эффективность и зачастую вызывают развитие тяжелых побочных эффектов, вынуждающих прекратить лечение [4]. Таргетная терапия ингибиторами протеаз, обещающая стать прорывом в лечении ХГС, также имеет ряд серьезных побочных эффектов, показана только для пациентов с генотипом 1 и на сегодняшний день ограничена высокой стоимостью [5]. Поэтому поиск новых подходов к лечению ХГС остается актуальным.
Согласно современным представлениям, элиминацию вируса и исход в выздоровление связывают с запуском сильного мультиэпитопного (с широкой кросс-реактивностью) ответа CD8+ и CD4+ T-клеток, продуцирующих цитокины 1-го типа [6, 7]. Соответственно исход в хронизацию и персистенция вирусной инфекции ассоциированы с недостаточностью Т-клеточного ответа [8, 9]. Ведущая роль в запуске Т-клеточного ответа отводится дендритным клеткам (ДК), способным эффективно презентировать антигены, активировать наивные Т-клетки и поддерживать иммунный ответ против патоген-ассоциированных антигенов. Многочисленные исследования выявили нарушения ДК при ХГС, проявляющиеся задержкой созревания, изменением продукции цитокинов и снижением аллостимуляторной активности генерируемых из моноцитов и циркулирующих ДК, включая миелоидные и плазмоцитоидные ДК [10, 11]. С этой точки зрения индукцию сильного иммунного ответа с помощью генерированных ex vivo ДК рассматривают в качестве новой стратегии создания лечебных вакцин при хроническом ВГС [12].
Традиционно в качестве источника ДК-вакцин используют ДК, полученные путем культивирования моноцитов в присутствии GM-CSF и IL-4 (IL-4-ДК) [13]. В качестве кандидатных вирусных антигенов для нагрузки ДК обсуждается использование как структурных, так и неструктурных белков (Core, NS3-NS5 антигенов) или входящих в их состав пептидов, которые, будучи высоко иммуноген-ными, индуцируют Т-клеточный иммунный ответ, включая активацию Т-хелперов 1-го типа и генерацию цитотоксических лимфоцитов [14, 15]. Способность IL-4-ДК индуцировать специфический ответ CD4 и CD8 T-лимфоцитов против капсидного и неструктурных белков HCV была недавно продемонстрирована в культурах in vitro у доноров [16], а также in vivo у больных ХГС [17]. Тем не менее
первые клинические испытания продемонстрировали недостаточную эффективность индуцированного Т-клеточного ответа в подавлении репликации вируса [18, 19].
При учете, что эффективность ДК-вакцин во многом зависит от свойств генерируемых ДК, а также тот факт, что вирусные белки могут существенно влиять на функции ДК, одним из важных вопросов при разработке ДК-вакцин становится выбор типа ДК и исследование супрессивных эффектов вирусных белков, используемых для нагрузки ДК.
В качестве возможной платформы для разработки нового типа ДК-вакцин мы предлагаем использовать ДК, генерированные из моноцитов в присутствии GM-CSF и интерферона-a (ИФН-ДК). Недавние исследования показали важную роль ИФН-ДК в индукции дифференцировки и созревания ДК. Учитывая также, что ИФН-ДК продуцируется в ответ на вирусную инфекцию, можно полагать, что данный цитокин служит физиологическим дифференцировочным фактором для ДК. Генерированные in vitro ИФН-ДК характеризуются частично зрелым фенотипом и обладают свойствами миелоидных, плазмоцитоидных и натуральных киллерных клеток [20]. Эти клетки отличаются от IL-4-ДК более стабильным (в отсутствие цитоки-нов) фенотипом, продуцируют ИФН-ДК, обладают более высокой миграционной активностью, а также большей эффективностью к кросс-презентации длинноразмерных пептидов, стимуляции цитоток-сических Т-клеток и экспансии Т-клеток памяти [21, 22]. Исследования in vivo на иммунодефицит-ных мышах подтвердили, что ИФН-ДК более эффективны в индукции вирус-специфических CD8+ T-клеток по сравнению с lL-4-ДК [23].
В качестве вирусных антигенов для нагрузки ИФН-ДК были выбраны рекомбинантные протеины, кодируемые фрагментами генов иммунодоминантных районов белков Core (1—120) и NS3 (1192—1457) HCV генотипа 1b. Оба белка содержат эпитопы, распознаваемые CD4 и CD8 Т-клетками [24]. Данные литературы о влиянии вирусных белков или пептидов, кодируемых фрагментами генов Core и NS3, на функции ДК весьма противоречивы. С одной стороны, продемонстрировано ингибирующее влияние капсидного и неструктурных белков HCV на диффе-ренцировку, созревание и функции генерируемых in vitro дендритных клеток [25, 26]. С другой стороны, в ряде исследований показано, что нагрузка ДК белками Core и NS3 не оказывает негативного влияния на их созревание и стимуляторную активность [27, 28]. При этом все эффекты вирусных белков оценивались в культурах IL-4-ДК, тогда как какие-либо данные о влиянии вирусных белков/пептидов на созревание и функции ИФН-ДК отсутствуют.
Целью настоящего исследования стала оценка влияния рекомбинантных белков, служащих аналогами фрагментов Core и NS3 антигенов, на созревание и функции генерируемых in vitro ИФН-ДК у HCV негативных доноров.
original article
Материал и методы
В исследование были включены здоровые доноры крови, негативные по сывороточным маркерам вирусного гепатита С. Мононуклеарные клетки (МНК) получали центрифугированием гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина. Для генерации ДК прилипающую фракцию МНК культивировали при 37 °С в С02-инкубаторе в течение 4 сут в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 5% сыворотки плодов коровы (FCS, БиолоТ, Санкт-Петербург), в присутствии GM-CSF (40 нг/мл, Sigma-Aldrich) и IFN-a (1000 Ед/мл, Роферон-А, Roche, Швейцария) с последующим дозреванием в течение 24 ч с липополисахаридом (10 мкг/мл, ЛПС, E. coli 0114: B4, Sigma-Aldrich). Исследовали как незрелые, интактные ДК, так и зрелые, ЛПС-стимулированные ДК.
Для нагрузки ИФН-ДК использовали комбинацию рекомбинантных протеинов, кодируемых фрагментами генов иммунодоминантных районов белков core (1—120) и NS3 (1192—1457) HCV генотипа 1b, полученных в лаборатории рекомбинантных белков ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Кратко: фрагменты генов, кодирующих каждый из белков, были получены с помощью обратной транскрипции с РНК HCV генотипа 1b с последующей амплификацией и клонированием в вектор pUC-18. Соответствие полученных последовательностей ДНК генам Hcv генотипа 1b было подтверждено секвенированием. Затем полученные фрагменты, кодирующие иммунодоминантные районы белков Core (1—120 ак) и NS3 (1192—1457 ак), были перенесены в плазмиды pET-21 и pET-28 соответственно и экспрессированы в E. coli штамма BL21(DE3). Полученные рекомбинантные белки содержали дополнительно олигогистидиновые мотивы и были очищены с помощью хроматографии на смоле His-Bind (Novagen) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя по денатурирующему протоколу в присутствии 8 М мочевины. Очищенные белки с помощью диализа были переведены в фосфатно-солевой буферный раствор (pH = 7,2) и профильтрованы через мембрану с диаметром пор 0,2 мкм.
Генерированные в 4-суточных культурах незрелые, интактные ИФН-ДК инкубировали в течение 1 ч с рекомбинантными белками HCV Core и NS3 в дозе по 5 мкг/мл, после чего клетки однократно отмывали и индуцировали конечное созревание добавлением ЛПС (10 мкг/мл на 24 ч).
Фенотипический анализ ИФН-ДК проводили методом проточной цитофлуорометрии (FACS Calibur, Becton Dickinson, США) с использованием FITS- или PE-меченных мо-ноклональных анти- CD14, -CD83, -CD80, -HLA-DR, -CD25 антител (BD PharMingen, США).
Продукцию цитокинов (TNF-a, IL-6,
^-10) в супернатантах ИФН-ДК оценивали методом иммуноферментного анализа, используя соответствующие тест-системы («Вектор-Бест», Новосибирск).
Аллостимуляторную активность ИФН-ДК оценивали в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) при культивировании МНК доноров (0,Ь106/лунку) в 96-луночных круглодонных планшетах в присутствии аллогенных ИФН-ДК (0,Ь105/лунку) в соотношении 10:1. Интенсивность пролиферации оценивали на 5-е сутки радиометрически по включению 3Н-тимидина, вносимого в лунки за 18 ч до конца культивирования в дозе 1 мкК/лунку. Индекс влияния ДК в алло-СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии ДК к уровню спонтанной пролиферации МНК.
Способность ИФН-ДК активировать ТЫ- и ^2-ответ оценивали в алло-СКЛ (как описано выше). В качестве отвечающих клеток использовали МНК доноров (0,Ь106 МНК/лунку), истощенных от фракции адгезивных клеток. Культуральные супернатанты собирали на 5-е сутки и оценивали содержание ТЫ-(1БП-у) и ^2- (^-6) цитокинов методом иммунофер-ментного анализа, используя соответствующие тест-системы («Вектор-Бест», Новосибирск).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Stаtisticа 6.0. Данные представлены в виде медианных значений (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR, 25—75% квартили). Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрический ^-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.
результаты
Известно, что ДК, генерируемые из моноцитов крови в присутствии GM-CSF и ШМ-а, по сравнению с «классическими» ^-4-ДК характеризуются более зрелым фенотипом [20]. Поэтому на первом этапе представлялось важным оценить, способны ли ИФН-ДК к дальнейшему созреванию при стимуляции ЛПС через ТоП-Нке-рецепторы 4-го типа. Действительно,
Таблица
влияние ЛПс на экспрессию поверхностных маркеров в культурах
ифн-дк
Маркер Относительное содержание ИФН-ДК, % Средняя интенсивность флуоресценции, усл. ед.
ДК0 ДКлпс ДК0 ДКлпс
HLA-DR 89 (85—96) 87 (84—93) 451 (318—907) 891 (629—1721)*
CD80 39 (22—50) 49 (29—62) 40 (24—57) 66,5 (59—145)*
CD25 3 (2—8,5) 14,5 (5—26)* 57 (39—77) 63,5 (53—80)
CD83 8 (6—12) 14 (11—20)* 56 (51—73) 48 (39—66)
CD83+CD14+ 4 (3—7) 10 (7—16,5)*
Примечание. Относительное содержание ИФН-ДК и среднюю интенсивность флуоресценции поверхностных маркеров оценивали в культурах интактных (ДК0) и ЛПС-стимулированных ИФН-ДК (ДКлпс), генерированных из моноцитов крови здоровых доноров (п = 8). Данные представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона (в скобках); * — р < 0,05; достоверность различий по сравнению с ДК0. и
оригинальные статьи
Таблица 2
Влияние рекомбинантных HCV белков Core/NS3 на фенотип ЛПС-стимулированных ИФН-ДК
Относительное содержание Средняя интенсивность флуоресцен-
Маркер ИФН-ДКЛПС, % ции, усл. ед.
Контроль +Core/NS3 Контроль +Core/NS3
HLA-DR 87 (84—93) 93 (88,5—95) 891 (629—1721) 1022 (562—1618)
CD80 49 (29—62) 50 (35—54) 66,5 (59—145) 75 (55—120)
CD25 14,5 (5—26) 14 (7—28) 63,5 (53—80) 53 (40—70)
CD83 14 (11—20) 11 (7—18)* 48(39—66) 39 (35—57)
CD83+CD14+ 10 (7—16,5) 8 (5—14,5)*
Примечание. Относительное содержание ДК и среднюю интенсивность флуоресценции поверхностных маркеров оценивали в культурах ЛПС-стимулированных ИФН-ДК здоровых доноров (п = 8), ненагруженных (контроль) и нагруженных вирусными белками (+Соге/^3). Данные представлены в виде медианы и интерквар-
тильного диапазона (в скобках). нию с контролем.
- pv < 0,05; достоверность различий по сравне
как видно из данных табл. 1, культивирование ИФН-ДК с ЛПС (в качестве дозревающего стимула) сопровождалось достоверным увеличением количества ДК, экспрессирующих CD80 (ко-стимуляторные молекулы), CD25 (активационные молекулы) и CD83 (маркер зрелости), а также возрастанием интенсивности средней флуоресценции HLA-DR и CD80. Значительная часть ДК при этом продолжала ко-экспрессировать CD14, что характерно для ИФН-ДК. Так, половина CD83+-клеток несла одновременно молекулу CD14, и количество CD83+CD14+ ИФН-ДК на фоне стимуляции ЛПС возрастало более чем в 2 раза.
Индуцированное ЛПС созревание ИФН-ДК сопровождалось также закономерным возрастанием уровня продукции цитокинов и аллостимуляторной активности ДК в СКЛ. Так, стимуляция ЛПС приводила к значительному усилению продукции TNF-a, IL-6 и IL-10 (рис. 1, а). Аналогичным образом ДКЛПС характеризовались более высокой стимуляторной активностью в алло-СКЛ. Так, индекс влияния ЛПС-индуцированных ИФН-ДК значимо превышал таковой для нестимулированных клеток (Pu = 0,04) (рис. 1, б).
Чтобы оценить эффект вирусных рекомбинантных белков (Core + NS3) на созревание и функции ДК, исследовали влияние краткосрочной инкубации ИФН-ДК с указанными антигенами на экспрессию поверхностных маркеров и продукцию цитокинов в культурах ЛПС-активированных ДК, а также их аллостимуляторную активность и способность стимулировать Т-клетки к продукции Th1- и ^2-цитокинов в СКЛ.
Краткосрочная инкубация ИФН-ДК с рекомбинантными вирусными белками не влияла на жизнеспособность генерируемых ДК. Клеточный выход ИФН-ДК из 106 МНК при стандартных условиях культивирования, а также после 1-часовой нагрузки Core/NS3 антигенами достоверно не различался и составлял в среднем 1,3 ± 0,28 и 1,5 ± 0,26^105 ДК соответственно. Таким образом, исследуемые рекомбинантные HCV белки в суммарной дозе 10 мкг/мл не оказывали токсического влияния на ИФН-ДК.
Сравнительный анализ поверхностных маркеров ЛПС-стимулированных ИФН-ДК показал (табл. 2), что средняя интенсивность флуоресценции HLA-DR, CD80 и CD25 в культурах ДК, нагруженных вирусными белками, и в контрольных культурах значимо не различалась. Единственным выявленным отличием ДК, нагруженных вирусными белками, было незначительное снижение относительного содержания клеток, экспрессирующих CD83 (рц = 0,035). Тем не менее средняя интенсивность флуоресценции данного маркера достоверно не менялась (pv = 0,18).
Поскольку функциональная активность ДК определяется не только степенью зрелости ДК, но и продуцируемыми ими цитокинами, далее был проведен анализ влияния вирусных белков на продукцию TNF-a, IL-6 и IL-10 в культурах ЛПС-стимулированных ИФН-ДК. На рис. 2 видно, что уровень продукции исследуемых цитокинов в культурах ИФН-ДК, нагруженных вирусными белками, был сопоставим с контрольными культурами ДКЛПС. Таким образом, нагрузка ИФН-ДК вирусными антигенами не оказывала значимого влияния на продукцию про- и противовоспалительных ци-токинов.
пг/мл 26 000-,
24 00022 00020 000 -
4000-г 300020001000-
имп/мин 8000 п
6000-
4000-
2000-
TNF-a
IL-10 1 ДК0 1 ДК„™
IL-6
г 20
-15
-10
-5
ь
m
МНК
мнк+дклпс
мнк+дко
Рис. 1. Влияние ЛПС на функциональную активность ИФН-ДК.
График слева — данные (Ме; IQR) по продукции (пг/мл) TNF-a (n = 4), IL-10 (n = 4), IL-6 (n = 7) в культурах интактных (ДК0) и ЛПС-стимулированных ИФН-ДК (ДКлпс). График справа — данные (Ме; IQR; n=15) по пролиферации (имп/мин) МНК в отсутствие ИФН-ДК, а также в алло-СКЛ в присутствии интактных (ДК0) и ЛПС-стимулированных ИФН-ДК (ДКЛПС). Представлены также индексы влияния (расч. ед.) ДК в алло-СКЛ; * — pv < 0,05 достоверность различий по сравнению с ДК0.
original article
пг/мл 26 00024 00022 00020 000 -L
4000 -у
3000
2000
1000
0
TNF-a
IL-10
Контроль
IL-6 +core/NS3
Рис. 2 Влияние рекомбинантных HCV белков Core/NS3 на продукцию цитокинов ЛПС-стимулированными ИФН-ДК. Данные (Ме; IQR) по продукции (пг/мл) TNF-a (n = 4), IL-10 (n = 4) и IL-6 (n = 7) в культурах ЛПС-стимулированных ИФН-ДК здоровых доноров, ненагруженных (контроль) и нагруженных вирусными белками (+Core/NS3).
Оценка влияния вирусных белков на функциональную активность ИФН-ДК показала (рис. 3, а), что уровень пролиферативного ответа МНК в алло-СКЛ в присутствии ИФН-ДК, нагруженных вирусными Core/ NS3 белками, не отличался от такового в присутствии ЛПС-стимулированных ИФН-ДК, не нагруженных вирусными антигенами. Индексы влияния интакт-ных ДК, и ДК, инкубированных с рекомбинантными HCV белками, были сопоставимы между собой. Эти данные четко указывают на то, что нагрузка ИФН-ДК вирусными Core и NS3 антигенами не оказывает негативного влияния на их способность индуцировать пролиферацию Т-клеток в ответ на стимуляцию алло-антигенами. Нагрузка вирусными антигенами также не влияла на способность ИФН-ДК активировать Т-лимфоциты к продукции Th1- (IFN-y) и Th2- (IL-6) цитокинов (рис. 3, б).
Обсуждение
имп/мин 8000 п
Влияние HCV белков на ДК представляет интерес с точки зрения выяснения механизмов иммунных дисфункций у пациентов с ХГС и разработки технологий получения лечебных ДК-вакцин. Действительно, согласно многочисленным независимым исследованиям, генерируемые из моноцитов ДК у пациентов с ХГС обладают сниженной способностью активировать Т-лимфоциты и продуцировать IL-12, активирующий Thl-ответ [10, 11]. Аналогичным образом выделенные из периферической крови больных ХГС миелоидные и плазмацитоидные ДК отличаются сниженной продукцией IL-12 и IFN-a соответственно, а так-
6000-
4000-
2000-
же меньшей ТЫ-поляризующей активностью [29]. Нарушение функций ДК рассматривается как одна из возможных причин неэффективного Т-клеточного противовирусного ответа при ХГС и обосновывает разработку ДК-вакцин как новую стратегию для восстановления иммунного ответа при ХГС. Вместе с тем, поскольку нарушение функций ДК во многом связывают с действием вирусных белков, выбор вирусных антигенов для нагрузки ДК и характеристика их супрессивных свойств становятся непременным этапом разработки ДК-вакцин.
В настоящей работе впервые изучено влияние комбинации рекомбинантных белков, представляющих аналоги усеченных фрагментов Core (1—120 ак) и NS3 (1192—1457 ак) на созревание и функции ДК, генерируемых из моноцитов крови в присутствии GM-CSF и IFN-a. Выбор именно этих белков обусловлен тем, что оба содержат эпитопы, распознаваемые CD4 Т-хелперными клетками и CD8-цитотоксическими лимфоцитами. При этом Core-белок имеет большое значение во взаимодействии с внутриклеточными сигнальными молекулами [30], а NS3 антиген является иммунодоминантным. Кроме того, ^3-реактивные Т-клетки играют важную роль в элиминации вируса [31]. Необходимость оценки совместного влияния вирусных белков была связана с планируемым использованием для нагрузки ИФН-ДК одновременно капсидного и неструктурного HCv антигенов, которые тем не менее в такой комбинации могли обладать аддитивным супрессивным эффектом.
Проведенные исследования показали, что 1-часовая нагрузка ИФН-ДК вирусными белками Core и NS3 в дозе по 5 мкг/мл не оказывала ингибирующего влияния на выход ДК и экспрессию ко-стимуляторных и активационных молекул (CD86, HLA-DR, CD25). Ин-гибирующий эффект вирусных антигенов на экспрес-
г20
-15
За (D
-10
-5
пг/мл 12 000 n
11 00010 0009000 -2000 -" 150010005000 —
МНК
| Контроль
IFN-y +Core/NS3
IL-6
Рис. 3 Влияние рекомбинантных HCV белков Core/NS3 на функциональную активность ИФН-ДК.
График слева — данные (Ме; IQR; n = 15) по пролиферации (имп/мин) МНК в отсутствие ИФН-ДК, а также в алло-СКЛ в присутствии ЛПС-стимулированных ИФН-ДК, ненагруженных (контроль) и нагруженных вирусными белками (+Core/NS3). Представлены также индексы влияния (расч. ед.) ДК в алло-СКЛ. График справа — данные (Ме; IQR; n = 6) по продукции (пг/мл) Th1-(IFN-y) и Th2- (IL-6) цитокинов в алло-СКЛ в присутствии ЛПС-стимулированных ИФН-ДК, ненагруженных (контроль) и нагруженных вирусными белками (+Core/NS3).
оригинальные статьи
сию CD83 был слабо выраженным. Таким образом, исследуемые рекомбинантные белки не оказывали негативного влияния на созревание ИФН-ДК.
Нагрузка ДК вирусными белками ^ге и NS3 также не оказывала ингибирующего действия на продукцию TNF-a, IL-6 и IL-10 на стадии конечного созревания ИФН-ДК. Аналогичным образом Core и NS3 белки не влияли на аллостимуляторную активность ИФН-ДК и их способность активировать Т-клетки к продукции Th1- и ТЬ2-цитокинов. Способность ДК стимулировать пролиферацию аллогенных Т-лимфоцитов и детерминировать Th1/Th2 во многом определяется экспрессией ко-стимуляторных молекул и спектром продуцируемых цитокинов. Поскольку эти параметры не менялись под действием исследуемых вирусных антигенов, отсутствие эффекта рекомбинантных Core- и ^3-белков на аллостимуляторную и Th1/Th2-стимулирующую активность ИФН-ДК представляется вполне объяснимым.
Имеющиеся в литературе данные об иммуносу-прессивных свойствах вирусных белков на ДК неоднозначны и достаточно противоречивы. С одной стороны, показано, что структурные и неструктурные вирусные белки подавляют диффренцировку и функции ДК. Так, Dolganiuc A. и соавт. продемонстрировали, что Core- и ^3-белки (но не оболочечный белок E2) активируют моноциты и подавляют их дифферен-цировку в ДК. Генерируемые в присутствии этих белков незрелые ДК отличаются повышенной продукцией IL-10, сниженной аллостимуляторной активностью и при контакте с аллогенными Т-клетками усиливают способность Т-лимфоцитов продуцировать IL-10, одновременно снижая способность секретировать IL-2 [32]. Waggoner S.N. и соавт. показали, что Core белок подавляет индуцированную ЛПС или poly(I:C) продукцию IL-12, не снижает аллостимуляторную активность ДК, однако угнетает Th1- и усиливает Th2-стимулирующую активность ДК в алло-СКЛ [26]. Нарушение антигенпрезентирующей функции ДК также продемонстрировано при трансфекции аденовируса, содержащего HCV Core и Е1-антигены. ДК, экспрес-сирующие Core или Core и Е1-кодируемые белки, обладали низкой аллостимуляторной активностью и индуцировали слабый пролиферативный ответ ау-тологичных Т-клеток вследствие низкой продукции Т-клетками IL-2 [25].
С другой стороны, Dolganiuc A. и соавт. отметили, что супрессивный эффект Core- и ^3-белков проявляется на этапе дифференцировки ДК, но не выявляется на этапе созревания, т. е. в культурах ЛПС-стимулированных ДК [32]. Схожие данные получены Landi A. и соавт., которые показали, что трансфекция РНК Core и NS3 в незрелые ДК не оказывала инги-бирующего влияния на созревание и аллостимуля-торную активность ДК [28]. В исследованиях Li W. показано, что ДК, экспрессирующие NS3- или Core-белок, обладали обычным фенотипом, сохранной аллостимуляторной активностью и эффективно стимулировали антиген-специфический ответ Т-клеток на чужеродные антигены [27]. В свою очередь, при
тестировании эффектов вирусных белков на миелоид-ные ДК, выделенные из периферической крови, было показано, что HCV Core-белок умеренно усиливает экспрессию CD83, CD86 и CD40 на ДК, но при этом подавляет способность ДК активировать наивные Т-клетки к продукции IFN-y [33].
Разнонаправленные эффекты вирусных белков на созревание и функции ДК могут отчасти объясняться особенностями тестируемых ДК, связанными с источником получения, условиями генерации и способами индукции созревания ДК. В этом аспекте генерируемые нами ИФН-ДК отличаются от IL-4-ДК более зрелым фенотипом [20], что может объяснять их резистентность к ингибирующему действию вирусных белков.
Кроме того, нами использовались рекомбинант-ные белки, представляющие аналоги усеченных форм Core и NS3 вирусных белков, которые отличались от рекомбинантных белков, используемых другими авторами. Согласно данным литературы, иммуносу-прессивная активность свойственна в большей степени полноразмерным белкам [34], тогда как усеченные фрагменты Core- и/или NS3-белков или их пептиды не обладают выраженными иммуносупрессивными свойствами [35, 36].
В целом полученные нами данные свидетельствуют, что нагрузка ИФН-ДК рекомбинантными белками, соответствующими фрагментам HCV белков Core (1—120 ак) и NS3 (1192—1457 ак), не влияет негативно на созревание и функциональную активность ДК, что обосновывает целесообразность дальнейших исследований ИФН-ДК, нагруженными данными белками, в индукции специфического противовирусного иммунного ответа у больных хроническим ВГС. Исследование не имело спонсорской поддержки. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (REFERENCES)
1. Alter M.J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J. Gastroenterol. 2007; 13(17): 2436—41. doi: 10.3748/wjg.v13. i17.2436
2. Moreau I., Levis J., Crosbie O., Kenny-Walsh E., Fanning L.J. et al. Correlation between pre-treatment quasispecies complexity and treatment outcome in chronic HCV genotype 3a. Virol. J. 2008; 5: 78. doi:10.1186/1743-422X-5-78
3. Gale M. Jr., Foy E.M. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus. Nature. 2005; 436(7053): 939—45. doi:10.1038/ nature04078
4. Manns M.P., Wedemeyer H., Cornberg M. Treating viral hepatitis C: efficacy, side effects, and complications. Gut. 2006; 55(9): 1350—9. doi: 10.1136/gut.2005.076646
5. Wilby K.J., Partovi N., Ford J.A., Greanya E., Yoshida E.M. Review of boceprevir and telaprevir for the treatment of chronic hepatitis C. Can. J. Gastroenterol. 2012; 26(4): 205—10. PMID: 22506260
6. Lauer G.M., Barnes E., Lucas M., Timm J., Ouchi K., Kim A.Y. et al. High resolution analysis of cellular immune responses in resolved and persistent hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 2004; 127(3): 924—36. doi:10.1053/j.gastro.2004.06.015
7. Smyk-Pearson S., Tester I.A., Lezotte D., Sasaki A.W., Lewinsohn D.M., Rosen H.R. Differential antigenic hierarchy associated with spontaneous recovery from hepatitis C virus infection: implications for vaccine design. J. Infect. Dis. 2006; 194(4): 454—63. doi: 10.1086/505714
8. Missale G., Bertoni R., Lamonaca V., Valli A., Massari M., More C. et al. Different clinical behaviors of acute hepatitis C virus infection are associated with different vigor of the anti-viral cellmediated immune response. J. Clin. Invest. 1996; 98(3): 706—14. doi: 10.1172/JCI118842
9. Penna A., Missale G., Lamonaca V., Pilli M., Mori C., Zanelli P. et al. Intrahepatic and circulating HLA class II-restricted, hepatitis C virus-specific T cells: functional characterization in patients with chronic hepatitis C. Hepatology. 2002; 35(5): 1225—36. doi: 10.1053/jhep.2002.33153
10. Auffermann-Gretzinger S., Keeffe E.B., Levy S. Impaired dendritic cell maturation in patients with chronic, but not resolved, hepatitis C virus infection. Blood. 2001; 97(10): 317136. PMID: 11342445
11. Bain C., Fatmi A., Zoulim F., Zarski J.P., Trepo C., Inchauspe G. Impaired allostimulatory function of dendritic cells in chronic hepatitis C infection. Gastroenterology. 2001; 120(2): 512—24. doi: 10.1053/gast.2001.21212
12. Zhou Y., Zhang Y., Yao Z., Moorman J.P., Jia Z. Dendritic cell-based immunity and vaccination against hepatitis C virus infection. Immunology. 2012; 136(4): 385—96. doi: 10.1111/j.1365-2567.2012.03590.x
13. Thurner B., Roder C., Dieckmann D., Heuer M., Kruse M., Glaser
A. et al. Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical applications. J. Immunol. Meth. 1999; 223(1): 1—15. PMID: 10037230
14. Roohvand F., Kossari N. Advances in hepatitis C virus vaccines, part two: advances in hepatitis C virus vaccine formulations and modalities. Expert Opin. Ther. Pat. 2012; 22(4): 391—415. doi: 10.1517/13543776.2012.673589
15. Houghton M.,Abrignani S. Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus. Nature. 2005; 436: 961—6. doi:10.1038/nature04081
16. Li W., Krishnadas D.K., Li J., Tyrrell D.L., Agrawal B. Induction of primary human T cell responses against hepatitis C virus-derived antigens NS3 or core by autologous dendritic cells expressing hepatitis C virus antigens: potential for vaccine and immunotherapy. J. Immunol. 2006; 176(10): 6065375. doi: 10.4049/ jimmunol.176.10.6065
17. Li S., Roberts S., Plebanski M., Gouillou M., Spelman T., Latour P. et al. Induction of multi-functional T cells in a phase I clinical trial of dendritic cell immunotherapy in hepatitis C virus infected individuals. PLoS One. 2012; 7(8): e39368. doi:10.1371/journal. pone.0039368
18. ZabaletaA., D'Avola D., Echeverria I., Llopiz D., Silva L., Villanueva L. et al. Clinical testing of a dendritic cell targeted therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis C virus infection. Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 2015; 2: 15006. doi: 10.1038/mtm.2015.6.
19. Gowans E.J., Roberts S., Jones K., Dinatale I., Latour P.A., Chua
B. et al. A phase I clinical trial of dendritic cell immunotherapy in HCV-infected individuals. J. Hepatol. 2010; 53(4): 599—607. doi: 10.1016/j.jhep.2010.05.007
20. Farkas A., Kemény L. Interferon-a in the generation of monocyte-derived dendritic cells: recent advances and implications for dermatology. Br. J. Dermatol. 2011; 165(2): 247—54. doi: 10.1111/ j.1365-2133.2011.10301.x.
21. Della Bella S., Nicola S., Riva A., Biasin M., Clerici M., Villa M.L. Functional repertoire of dendritic cells generated in granulocyte macrophage-colony stimulating factor and interferon-a. J. Leukoc. Biol. 2004; 75(1): 106—16. doi: 10.1189/jlb.0403154
22. Ruben J.M., Bontkes H.J., Westers T.M., Hooijberg E., Ossenkoppele G.J. et al. Differential capacity of human interleukin-4 and interferon-a monocyte-derived dendritic cells for cross-presentation of free versus cell-associated antigen. Cancer Immunol. Immunother. 2015; 64(11): 1419—27. doi: 10.1007/s00262-015-1741-1
23. Lapenta C., Santini S.M., Spada M., Donati S., Urbani F. et al.
original article
IFN-alpha-conditioned dendritic cells are highly efficient in inducing cross-priming CD8(+) T cells against exogenous viral antigens. Eur. J. Immunol. 2006; 36(8): 2046—60. doi: 10.1002/ eji.200535579
24. Lauer G.M., Lucas M., Timm J., Ouchi K., Kim AY., Day C.L. et al. Full-breadth analysis of CD8+ T-cell responses in acute hepatitis С virus infection and early therapy. J. Virol. 2005; 79(20): 12979—88. doi: 10.1128/JVI.79.20.12979-12988.2005
25. Sarobe P., Lasarte J.J., Casares N., López-Díaz de Cerio A., Baixeras E., Labarga P. et al. Abnormal priming of CD4(+) T cells by dendritic cells expressing hepatitis С virus core and E1 proteins. J. Virol. 2002; 76(10): 5062—70. doi:10.1128/JVI.76.10.5062-5070.2002
26. Waggoner S.N., Hall C.H., Hahn Y.S. HCV core protein interaction with gC1q receptor inhibits Th1 differentiation of CD4+ T cells via suppression of dendritic cell IL-12 production. J. Leukoc. Biol. 2007; 82(6): 1407—19. doi:10.1189/jlb.0507268
27. Li W., Li J., Tyrrell D.L., Agrawal B. Expression of hepatitis С virus-derived core or NS3 antigens in human dendritic cells leads to induction of pro-inflammatory cytokines and normal T-cell stimulation capabilities. J. Gen. Virol. 2006; 87(1): 61—72. doi: 10.1099/vir.0.81364-0
28. Landi A., Yu H., Babiuk L.A., van Drunen Littel-van den Hurk S. Human dendritic cells expressing hepatitis С virus core protein display transcriptional and functional changes consistent with maturation. J. Viral Hepat. 2011; 18(10): 700—13. doi: 10.1111/ j.1365-2893.2010.01357.x
29. Kanto T., Inoue M., Miyatake H., Sato A., Sakakibara M. et al. Reduced numbers and impaired ability of myeloid and plasmacytoid dendritic cells to polarize T helper cells in chronic hepatitis С virus infection. J. Infect. Dis. 2004; 190(11): 1919—26. doi: 10.1086/425425
30. Kato N., Yoshida H., Ono-Nita S.K., Kato J., Goto T., Otsuka M. et al. Activation of intracellular signaling by hepatitis B and С viruses: C-viral core is the most potent signal inducer. Hepatology. 2000; 32(2): 405—12. doi:10.1053/jhep.2000.9198
31. Pape G.R., Gerlach T.J., Diepolder H.M., Grüner N., Jung M., Santantonio T. Role of the specific T-cell response for clearance and control of hepatitis С virus. J. Viral Hepat. 1999; 6 (Suppl. 1): 36— 40. doi: 10.1046/j.1365-2893.1999.00006.x
32. Dolganiuc A., Oak S., Kodys K., Golenbock D.T., Finberg R.W. et al. Hepatitis С core and nonstructural 3 proteins trigger toll-like receptor 2-mediated pathways and inflammatory activation. Gastroenterology. 2004; 127(5): 1513—24. doi:10.1053/j.gastro.2004.08.067
33. Liang H., Russell R.S., Yonkers N.L., McDonald D., Rodrigues B. et al. Differential effects of hepatitis С virus JFH1 on human myeloid and plasmacytoid dendritic cells. J. Virol. 2009; 83(11): 5693—707. doi: 10.1128/JVI.02671-08
34. Krishnadas D.K., Ahn J.S. Han J., Kumar R., Agrawal B. Immunomodulation by hepatitis С virus-derived proteins: targeting human dendritic cells by multiple mechanisms. Int. Immunol. 2010; 22(6): 491—502. doi: 10.1093/intimm/dxq033
35. Alvarez-Obregón J.Q, Dueñas-Carrera S., Valenzuela С., Grillo J.M. A truncated HCV core protein elicits a potent immune response with a strong participation of cellular immunity components in mice. Vaccine. 2001; 19(28-29): 3940—6. doi: 10.1016/S0264-410X(01)00141-4
36. Zeng R., Li G., Ling S., Zhang H., Yao Z., Xiu B. et al. A novel combined vaccine candidate containing epitopes of HCV NS3, core and E1 proteins induces multi-specific immune responses in BALB/c mice. Antiviral Res. 2009; 84(1): 23—30. doi: 10.1016/j. antiviral.2009.07.011
Поступила 25.05.16 Принята в печать 07.06.16
