CC BY
60
Влияние регуляторных пептидов на параметры эякулята человека
В.В. Евдокимов1, В.Б. Туровецкий2, А.А. Каменский2, Л.А. Андреева3, Н.Ф. Мясоедов3
ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России, Москва; 2биологический факультет ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; 3ФГБУН«Институт молекулярной генетики» РАН, Москва
Контакты: Валерий Васильевич Евдокимов [email protected]
В работе представлены результаты воздействия некоторых биологически активных синтезированных веществ: антиоксидантов и регуляторных олигопептидов. Применение семакса в качестве стимулирующего агента в эксперименте показало положительный эффект, который выразился в повышении общей подвижности сперматозоидов и более значительно в активноподвижной популяции. Селанк обладает также стимулирующим действием на подвижность сперматозоидов, повышая общую подвижность на 18 %, а активную — на 39 %. Значительным положительным эффектом обладают регуляторные пептиды. Использованные в одной концентрации все 3 пептида показали аналогичные результаты, повышая общую подвижность в 1-й час инкубации на 21—36 %, к 3-му часу — на 25—42 %. Активная подвижность повышалась на 39—79 % и на 63—88 % соответственно. Мексидол показал заметные изменения подвижности сперматозоидов как в эксперименте, так и в группе больных с патоспермией. Таким образом, использование биологически активных пептидов в эксперименте может служить основанием для их внедрения в клиническую практику андрологов и репродуктологов.
Ключевые слова: сперматозоиды, подвижность, пептиды
Effect of regulatory peptides on the parametres of human ejaculate
V.V. Evdokimov1, V.B. Turovetskiy2, A.A. Kamenskiy2, L.A. Andreeva3, N.F. Myasoedov3
1Research Institute of Urology, Ministry of Health of Russia, Moscow;
Department of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University;
3Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow
The results of the impact of some biologically active synthetic substances, antioxidants, and regulatory oligopeptides. Application Semax as stimulating agent in the experiment showed a positive effect, which is expressed in increasing overall sperm motility and much more in actively movindpopulation. Selank also has a stimulating effect on sperm motility, improving the overall mobility by 18 %, and active — 39 %. Have a significant positive effect of regulatory peptides. Used in a concentration of all three peptides showed similar results, improving the overall mobility in the first hour of incubation at 21—36 % for the 3rd hour — 25—42 %. Active mobility increased by 39—79 % and 63— 88 %, respectively. Meksidol showed noticeable changes in sperm motility in the experiment, and in patients with patospermia. Thus, the use of biologically active peptides in an experiment can serve as a basis for their introduction into clinical practice andrology and reproduction.
Key words: sperm, motility, peptides
E
W
E
Введение
Современная демографическая ситуация в нашей стране характеризуется резким падением рождаемости, и эта тенденция, по оценкам демографов, сохранится еще на протяжении многих лет. В настоящее время установлено, что ведущей причиной бесплодного брака является мужской фактор. По данным ВОЗ, частота бесплодного брака в разных странах мира составляет от 10 до 20 % общего числа супружеских пар. В Российской Федерации более 4 млн мужчин страдают бесплодием различной формы. Многочисленные исследования в разных странах мира показали, что на
протяжении последних десятилетий уровень мужской фертильности, т. е. способности к деторождению, значительно снизился [1—4]. Отмечается существенное падение подвижности сперматозоидов с одновременным увеличением патологических форм половых клеток — астенотератозооспермия, это основные показатели уровня фертильности спермы. Причины такого состояния мужской репродуктивной функции разнообразны и вызываются различными внешними и внутренними факторами [5—7].
Основными внешними факторами являются экологические: электромагнитные излучения мобильных
телефонов, компьютеров, ноутбуков, бытовых приборов; радиация различных источников — рентгеновская аппаратура, изотопы, применяемые в медицине и в промышленности, а также загрязнение воздуха, воды, почвы. К этим факторам также можно отнести и профессиональные вредности: производство органических веществ, тяжелых металлов, красителей и т. д. Все эти воздействия могут влиять одновременно, суммируя и усиливая влияние каждого из них, повышая тем самым риск для здоровья человека.
Многочисленными исследованиями установлено, что под воздействием даже незначительных физических или химических факторов во многих органах и структурах организма человека происходят глубокие изменения, и это явление называется «биологическим усилением». Известно, например, что даже излучение мобильного телефона с малой мощностью рассматривается как потенциально повреждающий фактор для человека. Установлено также, что чем выше частота волн излучения, тем большей проникающей способностью обладают эти волны. Широкое распространение мобильных телефонов и компьютеров влечет за собой негативные последствия. Аналогичные результаты получены и при воздействии на половые клетки электромагнитного излучения компьютера или ноутбука.
Причинами мужского бесплодия, помимо упомянутых внешних факторов, могут быть факторы образа жизни: стресс, питание, курение, алкоголь, наркотики; различные инфекционные болезни, включая инфекции, передаваемые половым путем. Инфекционные заболевания поражают половые органы, включая яички и придатки яичек. Таким образом, нарушения фертильности оцениваются как многофакторное состояние и тем самым обусловливают трудности диагностики и лечения мужского бесплодия.
В связи с перечисленными причинами, регулирующими репродуктивную функцию мужчин, проблема мужской фертильности представляет медицинскую и социальную значимость. Исследование механизмов регуляции репродуктивной системы также представляет актуальную проблему андрологии и репродукции человека. В настоящее время в данной области достигнуты определенные успехи. Так, известны этапы развития сперма-тогенного эпителия от гоноцитов до сперматозоидов, установлены основные механизмы регуляции сперматогенеза — гормональные, иммунные, геномные и др. Однако еще не решенным остается вопрос о возможности регуляторного воздействия на фертильные параметры эякулята человека, особенно в связи с высоким уровнем идиопатической формы мужского бесплодия. Все эти обстоятельства определяют актуальность наших исследований, направленных на сохранение физиологического уровня фертильности эякулята. Целью работы было изучение влияния различных регуляторных пептидов на основные параметры фертильности эякулята.
Материалы и методы
В наших исследованиях были использованы следующие антиоксиданты: мексидол, семакс, селанк и регуляторные олигопептиды. В серии опытов в образцы эякулята добавляли препараты в разной концентрации. Наблюдали изменение подвижности сперматозоидов через 1, 3 и 24 ч инкубации при комнатной температуре. Целостность мембраны сперматозоида определялась по способности 1 % водного раствора эозина проникать внутрь клетки и окрашивать ее в красный цвет. Анализ эякулята проводили на световом микроскопе с увеличением ><400 в соответствии с рекомендациями ВОЗ 4-го издания [4].
Результаты и обсуждение
Мексидол, действующим веществом которого является этилметилгидроксипиридина сукцинат, относится к группе антиоксидантов. К основным свойствам препарата относят ноотропное, антиоксидантное, мембраностабилизирующее и адаптогенное действие. Мексидол на клеточном уровне тормозит перекисное окисление липидов, повышает активность антиокси-дантной системы, активирует энергосинтезирующие функции митохондрий, улучшает энергетический обмен в клетке, активизирует внутриклеточный синтез белка и нуклеиновых кислот, ферментативные процессы цикла Кребса, способствует утилизации глюкозы, синтезу и внутриклеточному накоплению аденозин-трифосфата, восстанавливает структуру и функции мембран. Все перечисленные свойства мексидола позволяют улучшать метаболизм и реологические свойства крови, функционирование иммунной системы, подавлять агрегацию тромбоцитов [8, 9].
Химические и биологические характеристики мек-сидола позволяют нам рассчитывать на благоприятное влияние на характеристики эякулята (табл. 1).
Таблица 1. Влияние мексидола на общую подвижность сперматозоидов человека, %
Серии Время инкубации, ч
экспериментов исход 1 3 24
Контроль
(в отсутствие мексидола), п = 7 42,3 ± 1,3 40,1 ± 1,8 40,1 ± 2,3 14,3 ± 4,0
Опыт в присут-
ствии мексидола (50 мкг/мл), п = 9 42,3 ± 2,4 46,3 ± 4,4 44,1 ± 4,2 12,1 ± 4,6
Опыт в присут-
ствии мексидо-ла (500 мкг/мл), п = 9 42,5 ± 1,2 51,2 ± 2,4* 49,4 ± 3,0* 15,4 ± 9,8
т а т
* — различия средних арифметических значений параметров в соответствующих группах экспериментов (опыт и контроль) достоверны при р < 0,05 (95 %)._
В табл. 1 представлены экспериментальные результаты влияния мексидола на общую подвижность сперматозоидов. Внесение мексидола в концентрации 50 мкг/мл эякулята не привело к изменению подвижности сперматозоидов в течение 3-часовой инкубации, а через 24 ч в контрольных и опытных образцах эякулята подвижность сперматозоидов оставалась на прежнем уровне. Мексидол в концентрации 500 мкг/мл приводил к существенному повышению кинетики сперматозоидов уже к первому часу инкубации, и этот уровень сохранялся на протяжении 3-часового наблюдения. Через 24 ч подвижность сперматозоидов в опытных образцах не отличалась от контрольного уровня.
Кроме этого мы изучали влияние мексидола в присутствии перекиси водорода на целостность цитоплаз-матической мембраны сперматозоидов. Перекись водорода относится к активным формам кислорода и при повышенном содержании в клетке вызывает оксида-тивный стресс (табл. 2).
Данные, представленные в табл. 2, демонстрируют защитное влияние мексидола на целостность мембраны сперматозоидов в условиях активации перекисного окисления липидов. В контроле (нативный образец эякулята) на протяжении 24 ч число живых сперматозоидов существенно не изменялось. Перекись водорода, внесенная в эякулят, уже к 3-му часу наблюдения значительно увеличивает число мертвых клеток, а через 24 ч — на 30 %. Добавление мексидола в концентрации 500 мкг/мл в присутствии перекиси водорода позволяет поддерживать число неповрежденных сперматозоидов
Таблица 2. Влияние перекиси водорода и мексидола на целостность плазматической мембраны сперматозоидов человека in vitro (%)
Серии Время инкубации, ч
экспериментов 0,5 1 3 24
Контроль, п =10 91,6 ± 3,5 91,8 ± 2,5 94,6 ± 3,8 87,6 ± 1,5
Влияние Н2О2 (47 ммоль), п =10 94,6 ± 0,6 89,3 ± 4,1 70,3 ± 6,6* 66,8 ± 6,5*
.в Е га Е Влияние Н2О2 (47 ммоль) и мексидола (500 мкг/мл), п = 7 97,0 ± 1,7 96,0 ± 2,0* 93,0 ± 2,6** 64,3 ± 2,7*
09 Влияние Н2О2 (97 ммоль), п = 10 93,5 ± 3,5 82,7 ± 2,7* 71,9 ± 3,5* 57,0 ± 5,5*
.в га Влияние Н2О2 (97 ммоль) и мексидола (500 мкг/мл), п = 7 91,6 ± 5,6 88,6 ± 5,7 84,0 ± 6,0** 69,6 ± 5,8**
* — различия средних арифметических значений параметров в соответствующих группах экспериментов (в отсутствие и в присутствии Нр) достоверны при р < 0,05 (95 %);
** — различия средних арифметических значений параметров в соответствующих группах экспериментов (в отсутствие и в присутствии мексидола) достоверны прир < 0,01 (99 %).
на протяжении 3-часового наблюдения. Тем не менее, через 24 ч инкубации в опытных образцах количество мертвых клеток было соразмерно числу поврежденных клеток в образцах с перекисью водорода.
Учитывая положительный эффект влияния мексидола на подвижность сперматозоидов и сохранность мембраны клеток in vitro, мы использовали данный препарат в группе пациентов с выраженной астенотератозооспермией. Пациенты принимали мексидол перорально в суточной дозе 100 мг, разделенной на 2 приема. Курс медикаментозной терапии составлял 1 мес.
Таблица 3. Влияние мексидола на фертильность эякулята (n =10)
Показатель До лечения После лечения %
Объем, мл 4,6 4,0 87
Концентрация сперматозоидов, млн/мл 75,6 67,3 89
Живые сперматозоиды, % 63,6 71,3 112
Активноподвижные сперматозоиды, % 13,0 25,6 197
Общая подвижность сперматозоидов, % 32,0 48,0 150
Нормальные формы сперматозоидов, % 36,0 47,3 131
Результаты исследования представлены в табл. 3.
Как свидетельствуют полученные данные, после терапии произошло существенное повышение общей подвижности сперматозоидов на 50 % и более высокий подъем активной подвижности — почти в 2 раза, что достигает физиологической границы подвижности. Можно также выделить заметное увеличение числа нормальных форм сперматозоидов на 31 % и некоторое повышение числа живых клеток на 12 %.
Полученные результаты, базирующиеся на экспериментальных данных, показали значительные изменения основных параметров фертильности эякулята после курса применения мексидола в виде монотерапии. Более выраженный эффект воздействия препарата отмечен в 1,5-2-кратном повышении подвижности сперматозоидов.
Таким образом, мексидол оказывает положительный эффект в отношении фертильных характеристик эякулята, что позволяет рекомендовать его даже в качестве монотерапии при астенотератозооспермии.
Семакс — синтетический гептапептид, созданный на основе адренокортикотропного гормона (Н-Ме1-01и-Н18-РЬе-Рго-01у-Рго-0Н), в основном применяется в области неврологии. В экспериментах на культуре ткани продемонстрировано мощное трофотропное действие препарата на нейроны холинергической группы
как в полной среде, так и в неблагоприятных условиях, обусловленных депривацией глюкозы и кислорода. Препарат оказывает выраженное антиоксидантное, ангио-протекторное и нейротрофическое действие [10—12]. Улучшение трофического обеспечения и снижение реакций оксидантного стресса оказались решающими в выборе семакса для использования его при подготовке эксперимента с эякулятом.
Исследование эякулята проводилось по следую -щей схеме. Образцы эякулята были разделены на 2 группы. В 1-й группе исследовалась сперма от пациентов с патоспермией с добавлением семакса, ко 2-й группе мы отнесли эякулят без добавления семакса.
После разжижения полученного эякулята (время разжижения составляло от 20 до 30 мин) выполнялось его исследование согласно нормативам рекомендаций ВОЗ по основным показателям. На втором этапе полученные образцы 1-й группы смешивались с 0,05 мл 0,1 % водного раствора семакса (1 мкг/мл). В обеих группах образцов эякулята исходная подвижность находилась на одном уровне и характеризовалась как астенозооспермия.
Контроль подвижности сперматозоидов осуществлялся через 1, 3 и 24 ч соответственно для каждой из групп. Результаты приведены в табл. 4.
Таблица 4. Сравнение изменения общей подвижности сперматозоидов (%) при воздействии семакса
Семакс Контроль
Исходно 34,7 ± 3,1 33,2 ± 2,1
1 ч 36,1 ± 3,6 32,1 ± 3,6
3 ч 36,7 ± 6,4
24 ч 15,5 ± 6,3 22,7 ± 2,2
Из табл. 4 видно, что в малой концентрации семакс не вызывает существенного подъема общей подвижности сперматозоидов через 1 и 3 ч, отмечалось лишь незначительное повышение по сравнению с исходными данными. В контрольной группе была отмечена такая же реакция. По истечении суток в группе образцов эякулята, на которую воздействовали семаксом, отмечено резкое снижение подвижности сперматозоидов — в 2 раза от исходного, в контрольной группе образцов эякулята наблюдали менее заметное снижение.
В другой серии опытов были использованы кратные концентрации семакса, данные представлены в табл. 5.
Результаты изменений общей подвижности сперматозоидов в образцах с добавлением семакса показывают, что уже через 1 ч инкубации отмечается повышение подвижности, которая нарастает к 3-му часу на 30 % при максимальной концентрации вещества. В контрольных образцах эякулята подвижность существенно не изменялась. Активная подвижность сперматозоидов выделяется более значительными сдвигами, зависящими от концентрации вещества. В контрольных образцах этот параметр имел менее значимый подъем.
Таким образом, синтетический гептапептид семакс оказывает активирующее влияние на подвижность сперматозоидов, особенно на активную фракцию в первые часы воздействия. Этот препарат может быть рекомендован для использования в качестве вещества, улучшающего фертильность эякулята, в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), учитывая отсутствие у препарата эмбриотоксичности и мутагенных свойств.
В другой серии опытов был использован синтезированный препарат селанк. Результаты влияния селан-
Таблица 5. Влияние семакса (мкг/мл) на подвижность сперматозоидов человека (%)
Исход 10 100 1000 Контроль 1 ч 10 100 1000 3ч Контроль 3 ч
Активная подвижность
%
Общая подвижность
%
17 12,5 100 39,1 100
10 19,4 155 46,2 118
12
23,3 186 48,6 124
8
20,7 166 47,7 122
16 16,8 135 42,7 109
10 16,3 130 39,7 101
12 24,0 192 49,8 127
8
23,2 186 51,0 130
16 19,6 157 42,1 107
т а т
Таблица 6. Влияние селанка (мкг/мл) на подвижность сперматозоидов (%), п = 6
Активная
подвижность
%
Общая
подвижность
%
Исход
16,6 100 42,3 100
10 - 1 ч
20,4 123 44,7
106
1000 - 1 ч
10 - 3 ч
1000 - 3 ч
21,6 130 49,3 116
17,2 104 40,7 96
23,8 143 49,4 116
Контроль 3 ч
15,6 93 40,8 96
п
Таблица 7. Влияние олигопептидов на подвижность сперматозоидов человека (%)
Исход 30 мин 1 ч 3 ч Контроль 3 ч
(pro-gly-pro) 1000 мкг/мл (n = 7)
Активная подвижность 13,1 20,2 23,5 24,7 16,5
% 100 154 179 188 126
Общая подвижность 36,7 44,4 50,1 52,2 41,8
% 100 121 136 142 113
(arg-pro-gly-pro) 1000 мкг/мл (n = 6)
Активная подвижность 12,1 - 20,3 18,6 12,2
% 100 - 168 163 107
Общая подвижность 36,8 - 44,8 45,2 34,8
% 100 - 121 125 96
(ацетат-pro-gly-pro-lec) 1000 мкг/мл (n = 6)
Активная подвижность 14,8 - 20,6 24,8 17,8
% 100 - 139 167 120
Общая подвижность 37,1 - 45,6 50,9 42,6
% 100 - 123 137 115
Е га Е
ка на подвижность сперматозоидов приведены в табл. 6. Подвижность сперматозоидов повышается через 30 мин, в течение 1-го часа она увеличивается и к 3-му часу значительно превышает исходный уровень и уровень контроля. При этом заметные сдвиги подвижности отмечены в образцах эякулята с высокой концентрацией селанка и более существенно реагирует активнопод-вижная фракция сперматозоидов.
В табл. 7 показаны изменения подвижности сперматозоидов в присутствии олигопептидов. Эти вещества синтезированы в последние годы, и их применение ограничено экспериментальными исследованиями. Использованные вещества получены в отделе химии физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН, которым руководит акад. РАН Н.Ф. Мясоедов.
В данной статье приведены результаты использования только одной концентрации препаратов, исходя из результатов с использованием семакса и селанка. Подъем подвижности сперматозоидов начинается в первые 30 мин после внесения вещества в образец эякулята, достигая максимума к 3 ч наблюдения во всех 3 примерах.
Эти данные свидетельствуют, вероятно, о быстром проникновении препаратов в клетку и воздействии их на энергетический аппарат клетки.
Полученные результаты позволяют говорить о возможности применения этих веществ в клинической
практике при подготовке эякулята к использованию в программах ВРТ при исходно сниженной фертиль-ности, в частности при астенозооспермии.
Заключение
Таким образом, полученные данные показали, что изученные нами регуляторные пептиды и антиокси-данты обладают способностью повышать in vitro подвижность сперматозоидов человека. При этом выраженность эффекта зависела от вида пептида, его концентрации, времени инкубации. Полученные результаты позволяют надеяться на то, что дальнейшие исследования дадут возможность подобрать пептиды, максимально эффективные в повышении подвижности сперматозоидов как в эксперименте, так и при общем воздействии на организм человека.
Выводы
1. Эффективность стимулирующего действия на сперматозоиды зависит от вида пептида.
2. Выраженность действия семакса и селанка связана с концентрацией вещества.
3. Мексидол оказывает положительное воздействие на сперматозоиды и в эксперименте, и в условиях клиники.
4. Регуляторные пептиды обладают стимулирующим действием на сперматозоиды, которое зависит от концентрации вещества.
ЛИТЕРАТУРА
1. Foresta С., Flohe L., Garolla A. et al. Male fertility is linked to the selenprotein phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Biol Reprod 2002;67:967-71.
2. Гамидов С.И., Овчинников Р.И., Попова А.Ю. Особенности диагностики и лечения бесплодия у мужчин с ожирением. Фарматека 2010;9:18-23.
3. Евдокимов В.В., Ерохин А.С., Туровецкий В.Б., Айбятов Д.Т. Исследование эффекта антиоксидантов на подвижность сперматозоидов и при крио-консервации спермы. Андрол и генит хир 2009;1:23-8.
4. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. 4-е изд. М.: МедПресс, 2001. С. 143.
5. Safarinejad M.R., Safarinejad S. Efficacy of selenium and N-acetyl-cystein for
improving semen parameters in unfertile men. J Urol 2009;181:741-51.
6. Enomoto A., Wempe M.F., Tsuchida H. et al. Molecular identification of a novel carnitine transporter specific to human testis. Insights into the mechanism of carnitine recognition. J Biol Chem 2002;277:36262-71.
7. Eskenazi B., Kidd S.A., Marks A.R. et al. Antioxidant intake is associated with semen quality in healthy men. Human Reprod 2005;20(4):1006-12.
8. Девяткина Т.А., Луценко Р.В. Влияние мексидола и его структурных компонентов на содержание углеводов и перекис-ное окисление липидов при остром стрессе. Вопр мед химии 1999;45(3):246-8.
9. Короткина Р.Н., Руднова В.Г., Коростылев А.Н. и др. Защитное действие Мексидола на мембраны тромбоци-
тов при кардиохирургических операциях в условии гипертермической перфузии. Клин лаб диагност 2005;9:67-8.
10. Евдокимов В.В., Харламова Л.А., Пирутин С.К., Туровецкий В.Б. Влияние перекиси водорода и этилметилгидропи-ридина сукцината на сперматозоиды человека. Андрол и генит хир 2010;1:35-7.
11. Гусев В.И., Скворцова В.И., Мясоедов Н.Ф. и др. Эффективность се-макса в остром периоде полушарного ишемического инсульта. Журн неврол
и психиатр 1997;6:26-34.
12. Пирутин С.К., Туровецкий В.Б., Одгаева А.В., Каменский А.А. Влияние пептида семакса на индуцированное УФ-излучением повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей. Вестн МГУ 2007;3:51-4.
Е га Е
