CC BY
128
Влияние различных видов обработки кормовых средств и добавок, содержащих микро-, наночастицы металлов, на способность бактерий рубца к адгезии
К.С. Кондакова, аспирантка, ВНИИМС РАСХН;
Е.А. Дроздова, к.б.н., Е.В. Япрынцева, студентка, Оренбургский ГУ
Состояние обмена веществ, здоровья и продуктивность жвачных животных в определённой степени зависят от функции рубца и, соответственно, от жизнедеятельности его микрофлоры [1].
Основная часть рубцовой ферментации грубых кормов осуществляется микроорганизмами в контакте с пищевыми частицами [4]. В норме основную часть микробиоты рубца составляют целлюлозолитические бактериальные популяции, адгезированные на кормовых субстратах. С этими микроорганизмами связано 75% обменной энергии АТФ [5]. Прикрепляясь к пищевым частицам, они выделяют ферменты, которые деструктурируют фрагменты растений, разрушая молекулу целлюлозы, отделяя боковые цепи и гидролизуя оставшиеся олигосахариды [2]. Микробные популяции, связанные с кормовыми частицами, предположительно отвечают за 88—91% эндоглюканазной, ксиланазной активностей, 70% амилазной и 75% протеазной активностей в рубце. Таким образом, микробные популяции, обладающие адгезивной активностью, имеют важнейшее значение для пищеварения в рубце, оказывая непосредственное влияние на степень и темпы переваримости кормов, производство микробного белка и ЛЖК [6].
Локализация прикреплённых бактерий и характер адгезии зависят от многих факторов, среди которых существенная роль отводится физическим и химическим свойствам корма [6].
Поскольку научных исследований по изучению особенностей адгезии рубцовой микрофло-
ры недостаточно, то решение этой проблемы имеет немаловажное научное и практическое значение. Поэтому нами были проведены исследования, направленные на изучение влияния обработки кормовых средств и микро-, наночастиц металлов на способность рубцовой микрофлоры к адгезии.
Объект и методы. Для исследования в качестве субстрата были использованы пшеничные отруби. Субстрат в нативном состоянии и в смеси с разными добавками, содержащими кальций и микронаночастицы металлов ^е, Си, Сг), подвергали различным видам обработки (экструзии, ультразвуку и СВЧ).
Подопытных животных с фистулой рубца содержали в условиях вивария Оренбургского государственного университета на сбалансированном рационе согласно детализированным нормам кормления, поили вволю [3]. У фистульного бычка через три часа после кормления (пик рубцового пищеварения) отбирали пробы рубцовой жидкости, которые затем фильтровали через четыре слоя стерильной марли.
На первом этапе нашего исследования разработали методику количественного учёта микроорганизмов рубцовой жидкости, адгезированных на кормовых частицах. При оптимизации методики были решены следующие задачи: определён временной оптимум инкубации микроорганизмов, при котором на частицах субстрата адгезируется наибольшее их количество; найден оптимальный режим центрифугирования, при котором в поле зрения можно увидеть достаточное количество частиц субстрата среднего размера, превышающего размер бактерий в 20—30 раз. Последнюю задачу решали методом ступенчатого центрифугирования, начиная с 10§. При этом использовали центрифугу СМ6М.
Рис. - Адгезия микроорганизмов к частице субстрата (окраска акридиновым оранжевым)
1. Адгезия бактерий рубцовой жидкости к частицам субстратов, подвергшихся экструзии, обработке СВЧ и УЗ
Субстрат Кол-во адгезированных бактерий, шт./частицу субстрата
Отруби пшеничные Отруби пшеничные + УЗ Отруби пшеничные + СВЧ Отруби пшеничные экструдированные 15,40±0,81 17,25±0,86 18,50±0,60* 20,50±0,73**
Примечание: * - р<0,01; ** - р<0,001
Использованная нами методика включила:
— отбор пробы содержимого рубца через три часа после кормления;
— фильтрование проб через четыре слоя стерильной марли;
— центрифугирование рубцовой жидкости в течение 15 мин. при 3000 об./мин., при этом в супернатанте содержались бактерии, в осадке — простейшие;
— смешивание исследуемого образца (кормовой смеси, добавок) с подготовленной рубцовой жидкостью в стерильной колбе в соотношении 1:10, дальнейшее их инкубирование при температуре 38 °С три часа периодическим помешиванием;
— центрифугирование исследуемых проб при режиме нагрузки, равной 50g (500 об./мин.), который позволил выделить оптимальный размер частиц субстратов;
— подготовка препарата из разведений супернатанта (10-3—10-5): нанесение 1 мкл подготовленной суспензии на обезжиренное предметное стекло в трёх повторностях;
— подсушивание препарата при комнатной температуре;
— фиксация лёгким нагреванием;
— окрашивание водным раствором акридина оранжевого 15 мин.;
— смыв водопроводной водой и подсушивание фильтровальной бумагой. Препарат исследовали
2. Адгезия бактерий рубцовой жидкости к частицам экструдированных кормовых средств с металлосодержащими добавками
Субстрат Кол-во адгезированных бактерий, шт./частицу субстрата
Отруби пшеничные экструдированные Отруби пшеничные экструдированные + кальций Отруби пшеничные экструдированные + хром Отруби пшеничные экструдированные +медь Отруби пшеничные экструдированные + железо 20,50±0,73 32,50±0,85* 20,50±0,78 19,20±1,58 19,88±1,04
Примечание: * — р<0,001
с помощью люминесцентного микроскопа (рис.). Количество клеток, адгезированных на частичках субстрата, подсчитывали на 10 частицах и более в трёх параллелях.
После микроскопии были получены данные о количестве микроорганизмов, адгезированных на частицах субстрата. Результаты статистически обработали с помощью программы Excel с определением средней арифметической величины и ошибки средней арифметической. Для выявления статистически значимых (достоверных) различий использовали критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение. В таблице 1 приведены результаты количественной оценки адгезионной активности рубцовых бактерий к частицам пшеничных отрубей, подвергшихся экструзии, обработке СВЧ и УЗ. В качестве контроля использовали пшеничные отруби, не подвергавшиеся обработке.
На основании полученных данных установлено, что обработка корма увеличивает адгезию микроорганизмов из биоценозов содержимого рубца крупного рогатого скота к субстрату. Предварительные результаты показывают, что наиболее выраженная адгезия бактерий к субстрату происходит при экструзионной обработке. Это связано с особенностями воздействия гидробаротермической обработки на химическую и физическую структуру корма. В ходе экструзии имеет место увеличение удельной поверхности продукта. Кроме того, образуются разрывы молекулярных цепочек крахмала, белков. В результате открывается доступ для активной деятельности микроорганизмов.
На следующем этапе исследования изучали влияние металлосодержащих добавок на адгезивную активность бактерий рубцовой жидкости (табл. 2). В качестве контроля были выбраны образцы экструдированных пшеничных отрубей.
В результате проведённого опыта было обнаружено, что только кальцийсодержащая добавка значительно повышала адгезивную активность
рубцовых микроорганизмов. Данный факт можно объяснить тем, что катионы кальция придают стабильность клеточным мембранам, осуществляют межклеточные связи, обеспечивая адгезию клеток при тканеобразовании, и, соответственно, играют аналогичную роль в адгезии бактерий к субстрату
Заключение. Из результатов исследования следует, что наиболее выраженная адгезия рубцовых бактерий к субстрату происходит при экструзионной обработке исходных кормов и при введении кальцийсодержащих добавок, что можно использовать для активации адгезионной и ферментативной активностей микроорганизмов. Полученные данные говорят о перспективе
изучения взаимосвязей между физическими и химическими свойствами кормовых средств и адгезионной активностью рубцовых бактерий.
Литература
1. Алиев А.А., Димов В. Обмен веществ у жвачных животных. М.: НИЦ «Инженер», 1997. 419 с.
2. Орсков Э.Р. Энергетическое питание жвачных животных. Боровск, 2003. С. 17—35.
3. Калашников А.П. Кормление сельскохозяйственных животных. М., 1988. С, 37-39.
4. Me Cowan R.P., Cheng K.-J. Adherent bacterial populations on the bovine rumen wall: distribution patterns of adherent bacteria. Appl. Environni. Microbiol., 1980, 1: 233-241.
5. Cheng K.-J., Costerton J.W. Adherent rumen bacteria — their role in the digestion of plant material, urea and epithelial cells. In: Digestive physiology and metabolism in ruminants. Wesport. Conn., 1980: 227-250.
6. J. Miron, D. Ben-Ghedalia, and M. Morrison Adhesion Mechanisms of Rumen Cellulolytic Bacteria J. Dairy Sci. 2001.84:1294-1309.
