CC BY
21
ORIGINAL STUDY
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФИБРИНОГЕНА НА СВОЙСТВА ФИБРИНОВОЙ МАТРИЦЫ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ СОСУДИСТОЙ ИНЖЕНЕРИИ
© В.Г. Матвеева, М.Ю. Ханова, Т.В. Глушкова, Л.В. Антонова
ФГБНУ Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия
Цель. Тестирование фибриновых матриц, содержащих 10, 20 и 30 мг/мл фибриногена (фибрин-10, фибрин-20 и фибрин-30 соответственно) на возможность их применения в тканевой сосудистой инженерии (ТСИ).
Материалы и методы. Фибриноген выделяли методом этаноловой криопреципита-ции и полимеризовали с помощью тромбина и раствора СаС12. Структуру фибрина изучали сканирующей электронной микроскопией, физико-механические свойства материала тестировали на испытательной машине Zwick/Roell. Метаболическую активность эндотели-альных клеток (ЭК) на поверхности фибрина оценивали МТТ-тестом, жизнеспособность фибробластов в толще фибрина и возможность миграции - с помощью флуоресцентной и световой микроскопии. Определен процент усадки фибрина по изменению объема образцов до и после удаления влаги.
Результаты. Диаметр волокон всех образцов фибринов не различался, при этом размер пор в фибрине-30 был меньше по сравнению с фибрином-10 и фибрином-20. Подтверждена возможность миграции фибробластов в толщу фибриновой матрицы и сохранение жизнеспособности клеток от 97 до 100% на глубине 5 мм. Метаболическая активность ЭК на поверхности фибрина-20 и фибрина-30 превышала коллаген, фибронектин и фибрин-10. Все образцы фибрина дали усадку объема до 95,5-99,5%, при этом усадка фибрина-10 была самой большой. Физико-механические свойства фибрина в 10 раз уступали а. таттагга человека.
Заключение. Фибрин с концентрацией фибриногена 20 и 30 мг/мл поддерживает высокую метаболическую и пролиферативную активность ЭК на поверхности, а также высокую жизнеспособность фибробластов в толще. Доступность, простота получения и наличие ряда благоприятных свойств делают фибрин перспективным материалом для ТСИ. Однако, проблема недостаточной прочности требует дальнейших исследований.
Ключевые слова: фибрин; фибриноген; структура; биосовместимость; механическая прочность; тканевая сосудистая инженерия.
INFLUENCE OF DIFFERENT CONCENTRATIONS OF FIBRINOGEN ON THE PROPERTIES OF A FIBRIN MATRIX FOR VASCULAR TISSUE ENGINEERING
V.G. Matveeva, M.Yu. Khanova, T.V. Glushkova, L.V. Antonova
Scientific Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases,
Kemerovo, Russia
Aim. To evaluate the potential utility of fibrin matrices containing 10, 20, and 25 mg/ml of fibrinogen (fibrin-10, fibrin-20, and fibrin-30, respectively) in vascular tissue engineering (VTE).
Materials and Methods. Fibrinogen was isolated using the method of ethanol cryoprecipitation and polymerized using a solution of thrombin and CaCl2. The fibrin structure was
© Eco-Vector, 2021
ORIGINAL STUDY DOI:10.23888/PAVLOVJ202129121-34
studied in a scanning electron microscope, and the physical and mechanical properties of the material were tested on a Zwick/Roell test machine. The metabolic activity of endothelial cells (EC) on the fibrin surface was evaluated by the MTT assay, and the viability of fibroblasts in the thickness of fibrin and possibility for migration by in fluorescent and light microscopy. Percent of fibrin shrinkage was determined from the difference in the sample volumes before and after removal of moisture.
Results. The fiber diameter did not differ among all fibrin samples, but the pore diameter in fibrin-30 was smaller than those in fibrin-10 and fibrin-20. A possibility for migration of fibroblasts into the depth of the fibrin matrix and preservation of 97-100% viability of cells at a depth 5 mm was confirmed. The metabolic activity of EC on the surface of fibrin-20 and fibrin-30 exceeded that on collagen, fibronectin, and fibrin-10. All fibrin samples shrank in volume to 95.599.5%, and the highest shrinkage was seen in fibrin-10. The physical and mechanical properties of fibrin were inferior to those of human A. mammaria by a factor of 10.
Conclusion. Fibrin with fibrinogen concentrations of 20 and 30 mg/ml maintains a high metabolic and proliferative activity of EC on the surface and also a high viability of fibroblasts in the matrix. Its availability, ease of preparation, and a number of other favorable properties make fibrin a promising material for VTE. However, the problem of insufficient strength requires further investigations.
Keywords: fibrin; fibrinogen; structure; biocompatibility; mechanical strength; vascular tissue engineering.
Продолжается активный поиск идеального материала для тканевой сосудистой инженерии (ТСИ). Ряд синтетических материалов: дакрон, или политетрафторэтилен (англ.: polytetrafluoroethylene, PTFE), полиэтилентерефталат (англ.: polyethylene terephthalate, PET), - с успехом используются в реконструкции сосудов большого диаметра, но малопригодны для протезирования сосудов малого диаметра (менее 6 мм), поскольку в условиях низкой скорости кровотока вызывают гипертрофию интимы, тромбозы и последующий рестеноз [1].
Перспективным направлением в создании протезов сосудов малого диаметра является использование биодеградируе-мых полимеров, которые после имплантации выполнят роль временного каркаса для последующего формирования собственного полноценного сосуда in situ. Опыт применения различных полимеров в ТСИ показывает, что их поверхность не обладает достаточной биосовместимостью и одной общей причиной является отсутствие сайтов для клеточной адгезии [2].
Понимание важности физиологических реакций сосудистой стенки в профилактике этих осложнений дало начало но-
вому направлению в ТСИ, основанное на имитации структуры и функции нативной сосудистой стенки. Для имитации используют различные биополимеры (коллагены, фибронектин, эластин, фибрин) [3]. Среди перечисленных биополимеров фибрин является самым доступным, поскольку просто и в короткие сроки может быть получен из аутологичной крови. Соответственно, такой материал не имеет риска переноса различных патогенов и запуска иммунной реакции организма на инородное тело. Фибрин обладает идеальной биосовместимостью, отличается высоким сродством к различным биологическим поверхностям, биодеградация происходит посредством фибринолиза, при этом продукты биодеградации нетоксичны [4].
Как известно, фибрин формируется на конечном этапе коагуляционного каскада и представляет собой сеть переплетенных и разветвленных фибриновых волокон. В зависимости от условий и соотношения компонентов фибрин полимери-зуется с большим разнообразием структурных, биологических, химических и физико-механических свойств. Пористость и диаметр волокон зависят от концентрации
компонентов полимеризации (фибриноген, тромбин, ионы кальция (Са2)) и варьируют от микро- (до 2 нМ) до мезо- (2-50 нМ) и макропористости (более 50 нМ) [5,6]. С диаметром волокон и пористостью связаны как физико-механические, так и биологические характеристики. В работе Ы, й а1. (2016) описана зависимость жесткости фибринового сгустка от диаметра волокон [7]. Толстые волокна обладают меньшей жесткостью, что объясняется неоднородностью структуры толстых и тонких волокон. Эти данные представлены для фибрина с низкой концентрацией фибриногена (3-6 мг/мл). При создании фиб-риновых каркасов для ТСИ используют высокие концентрации фибриногена: от 10 до 30 мг/мл [8]. Соответственно, в этом диапазоне концентраций такая закономерность может отличаться от описанной '. Ы, й а1. и требует уточнения.
Волокна фибрина содержат сайты клеточной адгезии, которые обеспечивают прикрепление, миграцию и пролиферацию клеток - процессы необходимые для формирования полноценной ткани [5]. От пористости и толщины волокон будет зависеть не только адгезия клеток на поверхности материала, но и жизнеспособность клеток внутри матрицы, поскольку структура определяет скорость диффузии питательных веществ внутрь фибринового каркаса и удаление отработанных продуктов жизнедеятельности. Фибрин имеет сложную фибриллярную структуру и демонстрирует нелинейные механические, структурные и биологические свойства. В литературе имеются разрозненные данные о влиянии различных высоких концентраций фибриногена на клеточную жизнедеятельность (жизнеспособность и миграционную активность), однако ввиду большой значимости для ТСИ необходимо дополнительное изучение данного вопроса.
Таким образом, целью исследования стало тестирование фибриновых матриц, полученных из фибриногена 10, 20 и 30 мг/мл, для оценки возможности и варианта использования в тканевой сосудистой инженерии.
ORIGINAL STUDY
Материалы и методы
Работа одобрена Локальным этическим комитетом ФГБНУ Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний (Протокол №22 от 10 декабря 2018 г.).
Материалом исследования служила отработанная плазма с цитратом натрия. Фибриноген выделяли методом этаноловой криопреципитации. Для этого в пробирки с плазмой медленно при постоянном перемешивании добавляли раствор 16% этанола на ИереБ-буфере (рН 7,4) (&Ьсо, США) и помещали в шейкер на 1 час при температуре +4оС. Далее пробирки центрифугировали 25 мин при 1000§ в условиях охлаждения до +4оС. Супернатант удаляли, преципитат растворяли в ИереБ-буфере. Концентрацию фибриногена определяли по Клауссу на автоматическом коагулометре СА-540 Sysmex (США). Концентрацию фибриногена в преципитате доводили ИереБ-буфером до 10, 20 и 30 мг/мл. Полимеризацию фибриногена проводили с помощью тромбина и раствора хлорида кальция (СаС12). Для приготовления тромбино-кальциевой смеси на 10 мл смеси вносили 2000 К1Е гордокса (Гедеон Рихтер, Германия), 500 и бычьего тромбина (Б1§ша-АШсЬ, США) и 5 мл раствора СаС12 40 шМ (81§та-АЫгюЬ, США). Фибриновые образцы получали при смешивании в равных объемах подготовленного преципитата фибриногена и тромбино-кальциевой смеси.
Для подготовки фибриновых матриц к сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) образцы фиксировали в 1% растворе глутарового альдегида ^§та-А1с1п сЬ, США) в течение суток, далее трехкратно отмывали в растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ; &Ьсо, США) и в дистиллированной воде. После этого образцы замораживали и лиофилизировали в установке Freezone 2.5 ^аЬсопсо, США) при температуре -40°С и давлении <0,133 мбар. Готовые образцы монтировали на специальные столики и методом ионного распыления формировали на их поверхности токопро-водящее (Аи/РсС) покрытие толщиной 7 нм
ORIGINAL STUDY
в установке EM ACE200 (Lei са Mikrosysteme GmbH, Австрия). Структуру оценивали методом СЭМ на микроскопе S-3400N (Hitachi , Япония) в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ в режиме вторичных электронов.
Оценку механических свойств фиб-риновых образцов выполняли в условиях одноосного растяжения в соответствии с ISO 37: 2017 на универсальной испытательной машине серии Z (Zwi ck/Roell, Германия), используя датчик с номинальной силой 50 Н. Испытания проводили в термокамере при температуре 37°С, скорость перемещения траверсы при испытании составила 50 мм/мин. Образцы для исследования готовили на вырубном прессе ZCP 020 (Zwi ck/Roell, Германия) с использованием ножа специальной формы. Для измерения толщины образцов использовали толщиномер - ТР (ЗАО Красный инструментальщик, Россия) с пределом допустимой погрешности ±0,01мм и прижимным усилием 1,5Н. Предел прочности определяли по максимальному напряжению при растяжении (МПа), упруго-деформативные свойства - по относительному удлинению, до начала разрушения (%) и модулю Юнга (МПа), который определяли в пределах малых деформаций.
В качестве эндотелиальных клеток использовали культуру колониеформи-рующих эндотелиальных клеток, полученных и протестированных в собственной лаборатории [9].
Метаболическая (пролиферативная) активность эндотелиальных клеток (ЭК) была изучена с помощью МТТ-теста (Abcam, Великобритания). Для этого проводили покрытие лунок 96-луночного планшета (Thermo Sci enti fi с, США) коллагеном I типа из хвостов крыс 5 мкг/см
(G b o, США), фибронектином из бычьей
2
плазмы 5 мкг/см (Sigm a-Aldri ch, США) и фибрином с концентрацией фибриногена 10, 20, 30 мг/мл (далее в рисунках и по тексту для обозначения соответствующих образцов будет использована аббревиатура «фибрин-10», «фибрин-20» и «фибрин-
30»), n=6 для каждого вида покрытия. В каждую подготовленную лунку вносили ЭК в количестве 5*10 . Контролем служили заселенные ЭК лунки без покрытия (n=6). Для исключения влияния белкового покрытия на оптическую плотность (ОП) дополнительно заливали лунки (n=3) с каждым видом белка и последующим проведением всех манипуляций культивирования, но без клеток.
Культивирование ЭК проводили в течение 3 сут в полной питательной среде EGM-2MV (Lonza, Швейцария) c добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (ФБС; Gibco, США). После окончания срока культивирования выполняли МТТ-тест по протоколу. Считывание результатов на анализаторе «Униплан Пикон», Россия при X 595/650 нм.
Для каждого образца рассчитывали значение ДОП по формуле:
ЛОП=ОПк - ОПбк,
где ОПк - оптическая плотность клеточного образца, ОПбк - средняя оптическая плотность соответствующих бесклеточных образцов.
Изучение жизнеспособности клеток в толще фибрина. Фибробласты кожи человека получены в условиях собственной лаборатории по протоколу Хельсинского университета «Fibroblast cultures from skin biopsy» (2013), фенотип культуры CD90+CD73+CD45CD31-. В эксперименте использовали культуру 3 пассажа. Жизнеспособность фибробластов в толще фибрина исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. Для этого фибробласты кожи человека из расчета 105 клеток/мл смешивали с компонентами полимеризации фибрина-10, фибрина-20 и фибрина-30 и заливали по 1 мл в лунки 24-луночного планшета (Thermo Sci enti fi c, США) (n=3 для каждого вида фибрина), толщина слоя при этом составила 5 мм. Клетки культивировали 7 и 14 сут в полной питательной среде DMEM (Lonza, Швейцария) c 10% ФБС (Gibco, США), HEPES 1% (Gibco, США), пенициллином 100 Ед/мл, стрепто-
мицином 0,1 мг/мл и L-глутамином 2 mM/мл (Gibco, США), амфотерицином В 0,25 мг/мл (Gibco, США). По окончании срока культивирования образцы окрашивали Hoechst 33342 (Abcam, Великобритания) и этидиумом бромидом (Sigma-Aldri ch, США) и результаты оценивали на флуоресцентном инвертированном микроскопе (Carl Zeiss, Германия). В каждом поле зрения подсчитывали общее количество клеток по окраске Hoechst (синие ядра) и погибших клеток по окраске этидиумом бромидом (ядра оранжевого цвета).
Жизнеспособность клеток (ЖК) вычисляли по формуле:
ЖК (%) = количество живых клеток
х100/общее количество клеток.
В каждой группе образцов определяли ЖК на поверхности и на дне планшета (глубина 5 мм).
Исследование миграции фибробла-стов в толщу фибриновых матриц. В лунки 24-луночного планшета (Theimo S ci entifi c, США) заливали по 1 мл фибрина-10, фибрина-20 и фибрина-30 (n=3 для каждого вида). На поверхность фибрина высаживали фибробласты кожи человека в количестве 3*104 на лунку и культивировали в полной питательной среде DMEM (Lonza, Швейцария) с 10% ФБС. Через 7, 14 и 21 сут с помощью световой микроскопии (микроскоп «Carl Zeiss», Германия) определяли разницу между фокусировкой клеток на поверхности и максимально глубоко расположенных клеток и таким образом определяли глубину залегания клеток (глубину миграции). Данный метод был выбран неслучайно. При подготовке фибрина к окраске его отделяют от стенок планшета, в результате происходит уменьшение размеров материала (усадка). В таких условиях невозможно достоверно определить исходное расстояние от поверхности материала до клеток, мигрировавших в толщу.
Определение максимальной усадки фибрина. В 24-луночный планшет заливали по 1 мл приготовленной смеси преципитата фибриногена различных концен-
ORIGINAL STUDY
траций, тромбина и CaCl2 (n=6), как было описано ранее. Через 2 часа полимеризации измеряли толщину и радиус полученного сгустка фибрина с помощью толщиномера (UGNlab, Россия) и цифрового штангенциркуля (Мегеон, Россия). Далее сгусток отделяли от формы и, с помощью фильтровальной бумаги, удаляли влагу. При этом фибриновый сгусток уменьшался в размерах (давал усадку), но эластичные свойства были сохранены. После удаления влаги вновь измеряли толщину и радиус фибринового сгустка.
Объем материала рассчитывали по формуле:
V=n r2 h,
где r - радиус, h - толщина, п - число п=3,14.
Статистическую и графическую обработку результатов выполняли в программе Prism 6. Характер распределения данных в выборках оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова. Количественные данные представлены в виде медианы и 1-го и 3-го квартиля (медиана (Q1; Q3)). Статистическую значимость различий между двумя независимыми группами оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Сравнение между несколькими группами проведено методом ANOVA с коррекцией результатов с учетом множественности сравнения методом FDR. Статистическая значимость определена как p<0,05 во всех тестах.
Результаты и их обсуждение
Интересной особенностью фибрина является неоднородность структуры на поверхности и в толще матриц. Поверхность отличается плотной волокнистой структурой практически без пор (рис. 1, А-В). В толще фибрин имеет трехмерную пористую структуру, представленную переплетением разветвленных фибриновых волокон (рис. 1, Г-Е). Статистический анализ данных показал, что диаметр волокон в толще не зависит от исходной концентрации фибриногена в выбранном нами диапазоне: 10, 20 и 30 мг/мл (рис. 1, Ж). Однако, размер пор в толще матриц с концентрацией фибриноге-
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ORIGINAL STUDY
на 30 мг/мл достоверно меньше по сравнению с концентрацией 10 и 20 мг/мл (рис. 1, З). Для фибрина 10 мг/мл диапазон размера
пор составил 169-546 нм, для 20 мг/мл -147-495 нм, и поры фибрина 30 мг/мл соответствовали 69-306 нм.
Примечание: А и Г - фибрин с концентрацией фибриногена 10 мг/мл (фибрин-10); Б и Д - 20 мг/мл (фибрин-20); В и Е - 30 мг/мл (фибрин-30), СЭМ, ув. х 10000; Ж и З - данные сравнения диаметра волокон и размера пор матриц
Рис. 1. Фотографии фибриновых матриц со стороны поверхности и в толще
Прочностные характеристики фиб-риновых матриц в зависимости от концентрации фибриногена достоверно не различались. Все матрицы обладали недостаточными физико-механическими свойствами (табл. 1). По сравнению с нативной внутренней грудной артерией человека (А. mammaгia) предел прочности фибриновых матриц, содержащих фибриноген 10, 20 и 30 мг/мл был ниже в 10 раз, жесткость -более чем в 10 раз. При этом, относительное удлинение значительно превышало показатели А. mammaгia. Соответственно, все группы фибрина обладали повышенной растяжимостью при низкой упругости.
Мы сравнили жизнеспособность фиб-робластов на поверхности и на дне матрицы толщиной 5 мм через 7 и 14 сут культивирования и не обнаружили различий (рис. 2). В этот период времени клетки сохраняли высокую жизнеспособность, в среднем от 95 до 100%. При этом, изучаемые концентрации фибриногена не оказывали влияния на жизнеспособность клеток в толще матрицы.
На фотографиях толщи фибрина визуализировались вытянутые, звездчатые фибробласты, тогда как на поверхности большинство клеток веретеновидной формы (рис. 3). Исследована глубина миграции фибробластов в толщу фибриновых матриц
DOI:10.23888/PAVLOVJ202129121-34 ORIGINAL STUDY
Таблица 1
Основные прочностные параметры образцов, медиана (01; Q3)
Анализируемый субстрат Предел прочности, мПа Относительное удлинение, % Модуль Юнга (Е), мПа
А. mammaria 2,48 (1,23; 4,50) 29,7 (23,3; 41,3) 2,420 (1,840; 3,225)
Фибрин-10 0,27* (0,20; 0,37) 209,8* (170,7; 242,4) 0,106* (0,100; 0,144)
Фибрин-20 0,18* (0,14; 0,23) 138,4* (117,0; 148,7) 0,086* (0,071; 0,155)
Фибрин-30 0,13* (0,13; 0,16) 177,5* (160,5; 182,5) 0,060* (0,054; 0,072)
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с А. mammaria
через 7 и 14 сут культивирования
Рис. 3. Фотографии фибробластов на поверхности и в толще фибрина на 14 сут культивирования (световая микроскопия, ув. х 100)
ORIGINAL STUDY
с различными концентрациями фибриногена на 7-е, 14-е и 21 -е сут культивирования.
Получены достоверные различия максимальной глубины миграции клеток на 14-е и 21 -е сут культивирования по сравнению с 7-ми сут, а также на 21 -е сут относительно 14-х сут (табл. 2). Следует
отметить, что глубина миграции в фибрин-30 на всех этапах наблюдения была ниже, чем в фибрин-10 и фибрин-20 на 7 и 21 сут. Так, в фибрин 10 на 21 сут культивирования глубина миграции составила около 1420 мкм, в фибрин-20 - 1323 мкм, тогда как в фибрин-30 - 857 мкм.
Таблица 2
Максимальная глубина миграции фибробластов (мкм), медиана (01; 03)
Длительность культивирования Фибрин-10 Фибрин-20 Фибрин-30
7 сут 582,5 (522,8; 621,0) 515,0 (487,3; 523,0) 360,1*" (293,6; 388,5)
14 сут 1156,0# (1019,5; 1198,4) 869,7# (806,1; 895,2) 634,5*,# (501,3; 741,8)
21 сут 1420,1#,## (1317,8; 1520,0) 1325,7#,## (1287,6; 1369,1) 857,5*,**,#,## (794,3; 889,0)
Примечание: # - р<0,05 по сравнению с одноименной группой на 7 сут культивирования и - на 14 сут культивирования; - р<0,05 по сравнению с фибрином-10 на соответствующие сут культивирования; - р<0,05 по сравнению с фибрином-20 на соответствующие сут культивирования
Таким образом, зарегистрирована миграция клеток в толщу всех изучаемых вариантов фибрина, при этом в фибрин-30 миграция была более затрудненная, чем в фибрин-10 и фибрин-20.
Нами проведено сравнение уровня метаболической активности клеток (ДОП) на культуральном пластике и на основных биополимерах, используемых в ТСИ (кол-
лагене, фибронектине и фибрине, рис. 4). Не выявлено статистически значимых различий метаболической активности ЭК на культуральном пластике, коллагене, фиб-ронектине и фибрине-10. При этом, показатели на фибрине-20 и фибрине-30 были значимо выше, чем на пластике, фибро-нектине, коллагене и фибрине-10.
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с пластиком, коллагеном, фибронектином и фибрином-10 Рис. 4. Результаты МТТ-теста на различных поверхностях
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ORIGINAL STUDY
Все образцы фибрина после удаления каркаса и влаги дали значительную усадку объема. Фибрин-10 уменьшился в размерах на 99,45 (99,41; 99,49) %, фибрин-20 -
на 98,21 (98,18; 98,26) %, фибрин 30 на 95,65 (95,58; 95,83) %. Процент усадки фибрин-30 был достоверно меньше, чем фибрина-10 (рис. 5).
фибрин 10 фибрин 20 фибрин 30
Рис. 5. Усадка фибрина в зависимости от различных концентраций фибриногена
Структура и физико-механические свойства фибрина зависят от концентрации входящих в него компонентов, таких как фибриноген, тромбин и
Ca [6,10].
Низкая активность или концентрация тромбина не позволяет полностью отделиться фибринопептидам А и В от фибриногена, это удлиняет время полимеризации и препятствует формированию полноценных нитей фибрина. Ионы С а2+ умеренно влияют на катализируемое тромбином высвобождение фибринопептидов [11], но значительно на последующие стадии полимеризации. С а2+ увеличивает скорость и степень боковой агрегации волокон. Показано, что более толстые волокна образуются при более высоких концентрациях Ca2+. Сохраняя стабильными параметры активности тромбина и концентрацию Ca2+ для всех образцов, мы использовали преципитат с концентрацией фибриногена 10, 20 и 30 мг/мл. В этих условиях изменение концентрации фибриногена не оказало влияния на диаметр волокон в толще фибрина, однако, размер пор у фибрина с концентрацией фибриногена 30 мг/мл был меньше по сравнению с 10 и 20 мг/мл.
Известно, что слишком мелкие поры могут ухудшать рост и выживаемость клеток в толще за счет снижения проницаемо-
сти и перфузии питательных веществ. Средняя толщина стенки коронарной артерии человека имеет диапазон от 390 до 1300 мкм [12], следовательно, выбранная толщина фибриновых матриц 5 мм значительно превышает максимальную толщину стенки артерий. Сохранение высокой жизнеспособности фибробластов на протяжении 14 сут на поверхности и в толще всех образцов наглядно демонстрирует, что структура фибрина-10, фибрина-20 и фибрина-30 не нарушает циркуляции питательных веществ по меньшей мере на глубине 5 мм.
С размером пор также связана непро-теолитическая миграционная активность. По данным различных авторов миграция клеток с сохранением жизнеспособности составляет от 519±27 мкм до 3000 мкм [13]. Результаты нашего исследования коррелируют с литературными данными. В зависимости от срока (7, 14 или 21 сут) и концентрации фибриногена в преципитате (10, 20 или 30 мг/мл) максимальная глубина миграции составила от 290 мкм до 1500 мкм. Миграция фибробластов в толщу фибрина-30 была более затруднена по сравнению с фибрином-10 и фибрином-20, что может быть связано с более мелким размером пор фибрина-30 по сравнению с фибрином-10 и фибрином-20. Отмечается некоторое несо-
ORIGINAL STUDY
ответствие размера пор (по нашим данным, максимальные размеры пор для каждого варианта матриц 306-540 нм) и указанного в литературе диаметра фибробластов от 20 мкм [14]. С одной стороны, следует учитывать, что измерения были проведены на распластанной на плоской поверхности клетке [14] и не соответствует размерам прикрепленных и вытянутых вдоль волокон фибробластов (рис. 3). С другой стороны, кроме непротеолитической миграции через поры и вдоль волокон [15], фиброб-ласты способны секретировать растворимые и мембранные протеазы (включая мат-риксные металлопротеиназы, сериновые протеазы) вызывая деградацию внеклеточного матрикса (ВКМ) и последующую про-теолитическую инвазию тканей [16,17].
Имитация трех слоев (интимы, медии и адвентиции) является одним из важных требований к идеальному сосудистому протезу. Возможность и глубина миграции клеток в фибриновую матрицу определяют дальнейший способ формирования медии будущего фибринового сосудистого протеза. Клетки могут быть заселены на поверхность материала с дальнейшей миграцией вглубь, а также залиты непосредственно в толщу фибрина. Согласно нашим данным, слишком медленная и затрудненная миграция при высокой жизнеспособности клеток в толще фибрина делают заливку предпочтительным способом формирования срединного слоя. Следует отметить, что непосредственная заливка значительно ускоряет и облегчает процесс изготовления протеза, поскольку исключает этап культивирования, необходимый для миграции клеток. Другое преимущество заливки связано с клеточным синтезом белков ВКМ внутри матрицы, что предотвращает вымывание растворимых компонентов и стимулирует созревание ВКМ в короткие сроки.
Имитация интимы за счет формирования монослоя ЭК на внутренней поверхности протеза определяет атромбогенность конструкции после имплантации. Результаты МТТ-теста позволяют судить о метаболической и пролиферативной активности
клеток и далее спрогнозировать эффективность заселения поверхности фибринового протеза in vitro, а также in situ. Высокая метаболическая активность ЭК на фибрине-20 и фибрине-30 свидетельствует об их преимуществе по сравнению с фибрином 10 и белками внеклеточного матрикса фибро-нектином и коллагеном. Поэтому, для заселения эндотелием внутренней поверхности сосудистого протеза предпочтительным вариантом является фибрин с концентрацией фибриногена 20 и 30 мг/мл.
При использовании фибринового геля в тканевой инженерии необходимо учитывать его способность к усадке (ретракции) после отделения от каркаса [18]. Усадка без тромбоцитарного влияния происходит вследствие констрикции и сокращения расстояния между фибриновыми волокнами, а также в результате выхода значительного количества содержащейся в геле жидкости [8]. По данным литературы, после усадки фибрин теряет до 80% массы [8]. В своем исследовании мы изучили максимальную усадку фибрина не по массе, а по объему. В результате, наименьшее изменение объема зарегистрировано у фибрина-30, что выгодно отличало его от фибрина-10. Снизить процент усадки поможет наличие каркаса, дополнительное сшивания нитей фибрина биологическими или химическими агентами, воздействие пульсирующего потока на заселенную клетками фибриновую конструкцию [19].
Мы полагаем, что эффект усадки лежит в основе различий структуры на поверхности и в толще фибрина, зарегистрированных нами на СЭМ (рис. 1, А-В). Так, на поверхности фибрина определяется однородная структура со слабо контури-рующими волокнами, редкими и мелкими порами, при этом в толще волокна и поры фибрина визуализируются хорошо. Эта особенность не является препятствием для создания сосудистых протезов. ЭК располагаются на внутренней поверхности и получают питание из циркулирующей крови, поэтому мелкий размер пор не окажет значимого влияния на их жизнедеятельность
и будет способствовать формированию эндотелиального монослоя. Напротив, слишком большие поры не позволят сформировать плотные межклеточные контакты и снизят удержание монослоя ЭК в условиях кровотока. По нашим данным поверхность фибрина-20 и фибрина-30 более благоприятна для жизнедеятельности ЭК, при этом толща поддерживает высокую жизнеспособность клеток соединительной ткани. Сочетание этих свойств способствует иерархическому распределению клеток с формированием интимы и медии, позволит быстро и эффективно заселить фибрин и сформировать компактный внутренний состав на основе белков внеклеточного матрикса, синтезируемого клетками срединного слоя.
Основной проблемой фибриновой матрицы, является ее низкая механическая прочность. По данным литературы, увеличение концентрации фибриногена в диапазоне от 5 до 20 мг/мл снижает размер пор и повышает ее прочность и жесткость [6,10]. В выбранном нами диапазоне концентраций фибриногена (10-30 мг/мл) снижение размера пор не оказало значимого влияния на механическую прочность и жесткость образцов, которые были в 10 и более раз ниже А. mammaria. В настоящее время ведутся активные поиски и предлагаются
Литература
1. Best C., Strouse R., Hor K., et al. Toward a patient-specific tissue engineered vascular graft // Journal of Tissue Engineering. 2018. Vol. 9. doi:10.1177/ 2041731418764709
2. Антонова Л.В., Севостьянова В.В., Сейфалиан А.М., и др. Сравнительное тестирование in vitro биодеградируемых сосудистых имплантов для оценки перспективы использования в тканевой инженерии // Комплексные проблемы сердечнососудистых заболеваний. 2015. №4. C. 34-41.
3. Ravi S., Chaikof E.L. Biomaterials for vascular tissue engineering // Regenerative Medicine. 2010. Vol. 5, №1. P. 107-120. doi:10.2217/rme.09.77
4. Park C.H., Woo K.M. Fibrin-Based Biomaterial Applications in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. In: Noh I., editor. Biomimetic Medical Materials From Nanotechnology to 3D Bioprinting. Advances in Experimental Medicine
ORIGINAL STUDY
различные варианты улучшения физико-механических свойств фибрина (дополнительное сшивание и уплотнение волокон фибрина [8], создание каркаса из различных полимеров [20], заселение клетками с последующей стимуляцией синтеза ВКМ [21] и т.д.). К сожалению, пока не найдено идеального варианта повышения прочностных характеристик фибрина, что делает весьма актуальными исследования в данном направлении.
Заключение Фибрин с концентрацией фибриногена 20 и 30 мг/мл является клеточным носителем, который поддерживает высокую метаболическую и пролиферативную активность эндотелиальных клеток на поверхности, а в толще высокую жизнеспособность клеток соединительной ткани. Предпочтительным способом формирования срединного слоя для фибрина с концентрацией фибриногена 20 и 30 мг/мл является заливка клеток непосредственно в толщу. Высокая доступность, простота получения, наличие ряда благоприятных свойств делают фибрин перспективным материалом для тканевой сосудистой инженерии. Однако, недостаточная механическая прочность матриц потребует проведения дальнейших экспериментов по выбору способов улучшения прочностных характеристик.
and Biology. Seoul, South Korea: Springer Nature Singapore Pte Ltd.; 2018. Vol. 1064. P. 253-261. doi:10.1007/978-981-13-0445-3_16
5. Barsotti M.C., Magera A., Armani C., et al. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells // Cell Proliferation. 2011. Vol. 44, №1. P. 33-48. doi:10.1111/ j.1365-2184.2010.00715.x
6. Chiu C.L., Hecht V., Duong H., et al. Permeability of three-dimensional fibrin constructs corresponds to fibrinogen and thrombin concentrations // Bio Research Open Access. 2012. Vol. 1, №1. P. 34-40. doi:10.1089/biores.2012.0211
7. Li W., Sigley J., Pieters M., et al. Fibrin Fiber Stiffness Is Strongly Affected by Fiber Diameter, but Not by Fibrinogen Glycation // Biophysical Journal. 2016. Vol. 110, №6. P. 1400-1410. doi:10.1016/j.bpj.2016.02.021
ORIGINAL STUDY
8. Aper T., Wilhelmi M., Gebhardt C., et al. Novel method for the generation of tissue-engineered vascular grafts based on a highly compacted fibrin matrix // Acta Biomaterialia. 2016. Vol. 29. P. 21-32. doi:10.1016/j.actbio.2015.10.012
9. Матвеева В.Г., Ханова М.Ю., Великанова Е.А., и др. Возможность получения и характеристика колониеформирующих эндотелиальных клеток из периферической крови пациентов с ишемиче-ской болезнью сердца // Цитология. 2018. Т. 60, №8. C. 598-608. doi:10.31116/tsitol.2018.08.03
10. Weisel J.W., Litvinov R.I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications // Blood. 2013. Vol. 121, №10. P. 1712-1719. doi:10.1182/ blood-2012-09-306639
11. Profumo A., Turci M., Damonte G., et al. Kinetics of fibrinopeptide release by thrombin as a function of CaCl2 concentration: different susceptibility of FPA and FPB and evidence for a fibrinogen iso-form-specific effect at physiological Ca2+ concentration // Biochemistry. 2003. Vol. 42, №42. P. 12335-12348. doi:10.1021/bi034411e
12. Chen H., Kassab G.S. Microstructure-based biome-chanics of coronary arteries in health and disease // Journal of Biomechanics. 2016. Vol. 49, №12. P. 2548-2559. doi:10.1016/j.jbiomech.2016.03.023
13. Aper T., Teebken O.E., Steinhoff G., et al. Use of a fibrin preparation in the engineering of a vascular graft model // European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 2004. Vol. 28, №3. P. 296302. doi:10.1016/j.ejvs.2004.05.016
14. Kim D.-H., Han K., Gupta K., et al. Mechano-sensitivity of fibroblast cell shape and movement to anisotropic substratum topography gradients // Biomaterials. 2009. Vol. 30, №29. P. 5433-5444. doi:10.1016/j.biomaterials.2009.06.042
15. Leon-Valdivieso C.Y., Wedgwood J., Lallana E., et al. Fibroblast migration correlates with matrix softness. A study in knob-hole engineered fibrin // APL Bioengineering. 2018. Vol. 2, №3. P. 036102. doi:10.1063/1.5022841
16. Sternlicht M.D., Werb Z. How matrix metallo-proteinases regulate cell behavior // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2001. Vol. 17. P. 463-516. doi:10.1146/annurev.cellbio. 17.1.463
17. Raeber G.P., Lutolf M.P., Hubbell J.A. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration // Biophysical Journal. 2005. Vol. 89, №2. P. 1374-1388. doi:10.1529/biophysj. 104.050682
18. Li Y., Meng H., Liu Y., et al. Fibrin Gel as an Injectable Biodegradable Scaffold and Cell Carrier for Tissue Engineering // The Scientific World Journal. 2015. Vol. 2015. P. 685690. doi:10.1155/ 2015/685690
19. Moreira R., Neusser C., Kruse M., et al. Tissue-Engineered Fibrin-Based Heart Valve with Bio-Inspired Textile Reinforcement // Advanced Healthcare Materials. 2016. Vol. 5, №16. P. 2113-
2121. doi:10.1002/adhm.201600300
20. Tschoeke B., Flanagan T.C., Cornelissen A., et al. Development of a composite degradable/non-degradable tissue-engineered vascular graft // Artificial Organs. 2008. Vol. 32, №10. P. 800-809. doi:10.1111/j.1525-1594.2008.00601.x
21. Flanagan T.C., Cornelissen C., Koch S., et al. The in vitro development of autologous fibrin-based tissue-engineered heart valves through optimised dynamic conditioning // Biomaterials. 2007. Vol. 28, №23. P. 3388-3397. doi:10.1016/j.biomaterials. 2007.04.012
References
1. Best C, Strouse R, Hor K, et al. Toward a patient-specific tissue engineered vascular graft. Journal of Tissue Engineering. 2018;9. doi:10.1177/2041731 418764709
2. Antonova LV, Sevostyanova VV, Seifalian AM, et al. Comparative in vitro testing of biodegradable vascular grafts for tissue engineering applications. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2015; (4):34-41. (In Russ).
3. Ravi S, Chaikof EL. Biomaterials for vascular tissue engineering. Regenerative Medicine. 2010;5(1): 107-20. doi:10.2217/rme.09.77
4. Park CH, Woo KM. Fibrin-Based Biomaterial Applications in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. In: Noh I., editor. Biomimetic Medical Materials From Nanotechnology to 3D Bioprinting. Advances in Experimental Medicine and Biology. Seoul, South Korea: Springer Nature Singapore Pte Ltd.; 2018. Vol. 1064. P. 253-61. doi:10.1007/978-981-13-0445-3_16
5. Barsotti MC, Magera A, Armani C, et al. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Proliferation. 2011; 44(1):33-48. doi:10.1111/j.1365-2184.2010.00715.x
6. Chiu CL, Hecht V, Duong H, et al. Permeability of three-dimensional fibrin constructs corresponds to fibrinogen and thrombin concentrations. BioRe-search Open Access. 2012;1(1):34-40. doi:10.1089/ biores.2012.0211
7. Li W, Sigley J, Pieters M, et al. Fibrin Fiber Stiffness Is Strongly Affected by Fiber Diameter, but Not by Fibrinogen Glycation. Biophysical Journal. 2016;110(6):1400-10. doi:10.1016/j.bpj.2016.02.021
8. Aper T, Wilhelmi M, Gebhardt C, et al. Novel method for the generation of tissue-engineered vascular grafts based on a highly compacted fibrin matrix. Acta Biomaterialia. 2016;29:21-32. doi:10.1016/j.actbio.2015.10.012
9. Matveeva VG, Khanova MYu, Velikanova EA, et al. Isolation and characteristics of colony-forming endothelial cells from peripheral blood in patients with ischemic heart disease. Tsitologiya. 2018;60(8): 598-608. (In Russ). doi:10.31116/tsitol.2018.08.03
10. Weisel JW, Litvinov RI. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 2013;
DOI:10.23888/PAVLOVJ202129121-34 ORIGINAL STUDY
121(10): 1712-9. doi:10.1182/blood-2012-09-306639
11. Profumo A, Turci M, Damonte G, et al. Kinetics of fibrinopeptide release by thrombin as a function of CaCl2 concentration: different susceptibility of FPA and FPB and evidence for a fibrinogen iso-form-specific effect at physiological Ca2+ concentration. Biochemistry. 2003;42(42):12335-48. doi:10.1021/bi034411e
12. Chen H, Kassab GS. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. Journal of Biomechanics. 2016;49(12):2548-59. doi:10.1016/j.jbiomech.2016.03.023
13. Aper T, Teebken OE, Steinhoff G, et al. Use of a fibrin preparation in the engineering of a vascular graft model. European Journal of Vascular and Endo-vascular Surgery. 2004;28(3):296-302. doi:10.1016/ j.ejvs.2004.05.016
14. Kim DH, Han K, Gupta K, et al. Mechano-sensitivity of fibroblast cell shape and movement to anisotropic substratum topography gradients. Biomaterials. 2009;30(29):5433-44. doi:10.1016/j.bio-materials.2009.06.042
15. Leon-Valdivieso CY, Wedgwood J, Lallana E, et al. Fibroblast migration correlates with matrix softness. A study in knob-hole engineered fibrin. APL Bioengineering. 2018;2(3):036102. doi:10.1063/1.5022841
16. Sternlicht MD, Werb Z. How matrix metallo-
proteinases regulate cell behavior. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2001;17:463-516. doi:10.1146/annurev.cellbio. 17.1.463
17. Raeber GP, Lutolf MP, Hubbell JA. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration. Biophysical Journal. 2005;89(2):1374-88. doi:10.1529/ biophysj.104.050682
18. Li Y, Meng H, Liu Y, et al. Fibrin Gel as an Injectable Biodegradable Scaffold and Cell Carrier for Tissue Engineering. The Scientific World Journal. 2015;2015:685690. doi:10.1155/2015/685690
19. Moreira R, Neusser C, Kruse M, et al. Tissue-Engineered Fibrin-Based Heart Valve with Bio-Inspired Textile Reinforcement. Advanced Healthcare Materials. 2016;5(16):2113-21. doi:10.1002/ adhm.201600300
20. Tschoeke B, Flanagan TC, Cornelissen A, et al. Development of a composite degradable/nonde-gradable tissue-engineered vascular graft. Artificial Organs. 2008;32(10):800-9. doi:10.1111/j.1525-1594.2008.00601.x
21. Flanagan TC, Cornelissen C, Koch S, et al. The in vitro development of autologous fibrin-based tissue-engineered heart valves through optimised dynamic conditioning. Biomaterials. 2007;28(23): 3388-97. doi:10.1016/j.biomaterials.2007.04.012
Дополнительная информация [Additional Info]
Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0546-2019-0002 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов». [Financing of study. The work was performed with support of complex fundamental research program of SB RAS within the fundamental topic of SRI CPCVD №»0546-2019-0002 «Pathogenetic Justification of Development of Implants for Cardiovascular Surgery on the Basis of Biocompatible Material with Realization of Patient-Oriented Approach with Use of Mathematical Modeling, Ti ssue Engineering and Genome Predictors».]
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить в связи с публикацией данной статьи. [Conflict of interests. The authors declare no actual and potential conflict of interests which should be stated in connection with publication of the article.]
Участие авторов. Матвеева В.Г. - научное руководство исследованием, моделирование и проведение экспериментов, написание текста статьи, Ханова М.Ю. - проведение экспериментов, статистическая обработка результатов, Глушкова Т.В. - проведение экспериментов касающихся физико-механических свойств материалов и сканирующей электронной микроскопии, статистическая обработка результатов, Антонова Л.В. - руководство исследованием, редактирование статьи. [Participation of authors. V.G. Matveevа - supervisor, modeling and conducting experiments, writing articles, M.Y. Khanova - experiments, statistical processing of the results, T.V. Glushkova - experiments concerning the physical-mechanical properties of materials microscopy and scanning electron microscopy, statistical analysis of the results, L.V. Antonova - guide to the study and editing of the article.]
Информация об авторах [Authors Info]
*Матвеева Вера Геннадьевна - к.м.н., с.н.с. лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной медицины, ФГБНУ Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия. [Vera G. Matveeva - MD, PhD, Senior Researcher of the Cell Technology Laboratory of the Experimental Medicine Department, Scientific Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.]
SPIN: 9914-3705, ORCID ID: 0000-0002-4146-3373, Researcher ID: I-9475-2017. E-mail: matveeva_vg@mail.ru
Ханова Марьям Юрисовна - м.н.с. лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной медицины, ФГБНУ Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия. [Maryam Yu. Khanova - Junior Researcher of the Cell Technology Laboratory of the Experimental Medicine Department, Scientific Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.]
SPIN: 5923-0432, ORCID ID: 0000-0002-8826-9244, Researcher ID: AAR-7341-2020.
ORIGINAL STUDY DOI:10.23888/PAVLOVJ202129121-34
Глушкова Татьяна Владимировна - к.б.н., н.с. лаборатории новых биоматериалов отдела экспериментальной медицины, ФГБНУ Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия. [Tatyana V. Glushkova - PhD in Biological sciences, Researcher of the New Biomaterials Laboratory of the Experimental Medicine Department, Scientific Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.] SPIN: 3151-6002, ORCID ID: 0000-0003-4890-0393, Researcher ID: H-7659-2017.
Антонова Лариса Валерьевна - д.м.н., зав. лабораторией клеточных технологий отдела экспериментальной медицины, ФГБНУ Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия. [Larisa V. Antonova - MD, PhD, Head of the Cell Technology Laboratory of the Experimental Medicine Department, Scientific Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.]
SPIN: 8634-3286, ORCID ID: 0000-0002-8874-0788, Researcher ID: I-8624-2017.
Цитировать: Матвеева В.Г., Ханова М.Ю., Глушкова Т.В., Антонова Л.В. Влияние различных концентраций фибриногена на свойства фибриновой матрицы для тканевой сосудистой инженерии // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2021. Т. 29, №1. С. 21-34. doi:10.23888/PAVLOVJ202129121-34
To cite this article: Matveeva VG, Khanova MYu, Glushkova TV, Antonova LV. Influence of different concentrations of fibrinogen on the properties of a fibrin matrix for vascular tissue engineering. I.P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2021;29(1):21-34. doi:10.23888/ PAVLOVJ202129121-34
Поступила/Received: 03.07.2020 Принята в печать/Accepted: 01.03.2021
