CC BY
14
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ Том 7 N 4 2017
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICO-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY
Оригинальная статья / Original article
УДК 577.359: 577.151
DOI: 10.21285/2227-2925-2017-7-4-44-50
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В КРОВИ IN VITRO
© Н.В. Диденко, А.Г. Соловьева, П.В. Перетягин
Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр Минздрава России, Российская Федерация, 603155, г. Нижний Новгород, Верхнее-Волжская набережная, 18/1.
Изучено влияние различных концентраций динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) на активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и глутатионредуктазы (ГР) в условиях in vitro. Эксперимент проведен на консервированной крови, к которой добавляли свежеполученный водный раствор ДНКЖ (концентрация соединения - 5 ммоль/л) в соотношении 1:150, 1:100, 1:50 и 1:25. Синтез ДНКЖ производили по методике А.Ф. Ванина с соавт. (2005). Выявлено разнонаправленное и дозозависимое влияние ДНКЖ на активность антиоксидантных ферментов донорской крови. Под влиянием ДНКЖ в соотношении 1:150, 1:100 и 1:50 отмечено увеличение активности СОД. Присутствие ДНКЖ в донорской крови в соотношении 1:25 вызвало снижение общей и удельной активности СОД. Отмечено повышение как общей, так и удельной активности ГР при добавлении ДНКЖ в донорскую кровь во всех представленных соотношениях. Наблюдалось снижение общей и удельной активности каталазы при добавлении ДНКЖ в донорскую кровь в соотношении 1:150 на фоне роста общей активности фермента под влиянием ДНКЖ в больших концентрациях. Выявлено повышение удельной активности каталазы в присутствии ДНКЖ 1:100 и 1:50. Показано, что ДНКЖ обладают антиоксидантными свойствами, проявляющимися в повышении активности СОД, каталазы и ГР при внесении в донорскую кровь в условиях in vitro ДНКЖ в соотношениях 1:100 и 1:50.
Ключевые слова: динитрозильные комплексы железа, супероксиддисмутаза, каталаза, глутати-онредуктаза.
Формат цитирования: Диденко Н.В., Соловьева А.Г., Перетягин П.В. Влияние различных концентраций динитрозильных комплексов железа на активность антиоксидантных ферментов в крови in vitro // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2017. Т. 7, N 4. С. 44-50. DOI: 10.21285/22272925-2017-7-4-44-50
IN VITRO STUDY OF THE INFLUENCE OF VARIOUS CONCENTRATIONS OF DINITROSYL IRON COMPLEXES ON THE ACTIVITY OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN THE BLOOD
© N.V. Didenko, A.G. Soloveva, P.V. Peretyagin
Privolzhsky Federal Research Medical Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation, Russian Federation, 603155, Nizhny Novgorod, Verkhne-Volzhskaya Naberezhnaya, 18/1
The effect of various concentrations of dinitrosyl iron complexes (DNICs) on the activity of superoxide dis-mutase (SOD), catalase and glutathione reductase (GR) was studied under in vitro conditions. The experiment was carried out using preserved blood with a freshly pre-pared aqueous solution of DNICs added (concentration - 5 mmol /1) having a ratio of 1: 150, 1: 100, 1:50 and 1:25. Synthesis of DNICs was performed according to the method described by A.F. Vanina et al. (2005). A multidirectional and dose-dependent effect of DNICs on the activity of antioxidant enzymes of donor blood was revealed. Under the influence of DNICs with a ratio of 1: 150, 1: 100 and 1:50, an increase in SOD activity was observed. The pres-ence of DNICs in the donor blood at a ratio of 1:25 caused a decrease in the total and specific activity of SOD. An increase both in total and specific activities of GR with the addition of DNICs to donor blood in all presented ratios was
noted. A decrease in the total and specific catalase activity with the addition of DNICs to the donor blood in a ratio of 1: 150 was observed against the background of the growth of the total activity of the enzyme under the influence of DNICs at high concentrations. An increase in the specific activity of catalase in the presence of DNICs with ratio 1:100 and 1:50 was revealed. It has been shown that DNICs have antioxidant properties, manifesting through an increase in the activity of SOD, catalase, and GR when injected into donor blood under in vitro conditions in the ratios 1:100 and 1:50.
Keywords: dinitrosyl iron complexes, superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase
For citation: Didenko N.V., Soloveva A.G., Peretyagin P.V. In vitro study of the influence of various concentrations of dinitrosyl iron complexes on the activity of antioxidant enzymes in the blood. Izvestia Vuzov. Prichladnaya Chimia I Biotechnologia. [Proceedings of Universitets. Applied chemistry and biotechnology]. 2017, vol. 7, no. 4, pp. 44-50 (in Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2017-7-4-44-50
ВВЕДЕНИЕ
Хорошо известно, что такое соединение, как оксид азота (NO) является важной внутри-и межклеточной сигнальной молекулой. Он служит нейромедиатором, вазодилататором, регулирующим тонус сосудов, способен также оказывать антиоксидантное действие, перехватывая кислородные радикалы и нейтрализуя вторичные продукты перекисного окисления липидов. Причем обусловленные им эффекты могут быть весьма многообразны, а зачастую противоположны для разных концентраций, типов клеток и других параметров. В настоящее время все большее число исследователей приходят к пониманию регуляторной функции оксида азота посредством стабильных ДНКЖ [4, 5]. Исследование механизмов действия таких комплексов, содержащих NO в депонированной форме, представляет собой актуальную научную проблему, так как накопление NO и перенос его к мишеням осуществляют именно стабилизированные комплексы NO [8]. Также известно, что ДНКЖ, являясь природными формами связывания NO, обладают собственной метаболической активностью и проявляют собственные антиоксидант-ные свойства. В связи с чем большой интерес представляет влияние ДНКЖ на активность именно ферментов антиоксидантной защиты.
Цель работы - изучить влияние различных концентраций динитрозильных комплексов железа на активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы донорской крови в условиях in vitro.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Эксперимент был проведен на консервированной крови от пациентов-доноров (n=25). В пробирки, содержащие по 5 мл консервированной крови, добавляли свежеполученный водный раствор ДНКЖ в соотношении 1:150, 1:100, 1:50 и 1:25. Синтез ДНКЖ производили по методике А.Ф. Ванина с соавт. [1]. Концентрация водного раствора ДНКЖ, взятого в эксперимент, составляла 5 ммоль/л (определя-
лась спектрофотометрически по известным молекулярным экстинкциям при длинах волн 310 и 360 нм). Активность СОД измеряли по ингибированию образования продукта ауто-окисления адреналина [3]. Активность каталазы оценивали спектрофотометрическим методом, основанным на определении скорости разложения перекиси водорода каталазой исследуемого образца с образованием воды и кислорода [2]. Активность ГР исследовали методом, основанным на изменении абсорбции раствора при образовании окисленной формы НАД+ [2]. Результаты исследований подвергали статистической обработке с использованием ^критерия Стьюдента.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Динитрозильные комплексы железа являются потенциальными источниками депонированной формы такого высокореактивного соединения, как оксид азота [7]. Сам N0 представляет собой свободный радикал и при неблагоприятных условиях метаболизма способен вызвать, так называемый, нитрозилирую-щий стресс [9]. Исследование влияния ДНКЖ на активность ферментов антиоксиданой системы организма человека показало, что добавление к донорской крови малых количеств водного раствора ДНКЖ (в соотношении 1:150 и 1:100) увеличивает общую активность СОД на 28,51% (р = 0,032) и 24,11% (р=0,029) (таблица), а удельную - на 21,81% (р = 0,034) и 23,58% (р = 0,036) (рис. 1), соответственно, по сравнению с контролем.
Присутствие ДНКЖ в донорской крови в соотношении 1:50 вызвало увеличение общей активности СОД лишь на 13,76% (р=0,022) по сравнению с контролем. Однако добавление большего количества ДНКЖ в соотношении 1:25 привело к ингибированию как общей, так и удельной активности фермента на 14,13% (р=0,018) и 21,45% (р=0,031), соответственно, по сравнению с контролем (рис.1).
Кроме того, нами была прослежена обратная зависимость между концентрацией
Общая активность супероксидисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы в донорской крови при добавлении в нее динитрозильных комплексов железа
в условиях in vitro
General activity of superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase in donor blood on addition of dinitrosyl iron complex under in vitro conditions
Условия Активность СОД, Активность каталазы, Активность ГР,
эксперимента усл.ед./мин усл.ед./мин нмоль/мин
Контроль 52,51±3,21 0,00116±0,00009 12,31±0,32
1:150 67,48±4,26* 0,00107±0,00007 13,13±0,38*
1:100 65,17±4,08* 0,00128±0,00011** 13,21±0,39*
1:50 59,74±3,15*/** 0,00147±0,00015*/** 15,41±0,44*/**
1:25 45,09±3,02*/** 0,00134±0,00012** 14,32±0,41*/**
*Различия статистически значимы по сравнению с контролем (р< 0,05); **различия статистически значимы по сравнению с активностью фермента при добавлении к донорской крови ДНКЖ в соотношении 1:150 (р< 0,05).
Рис.1. Удельная активность супероксиддисмутазы (усл.ед./мин*мг b) в донорской крови при воздействии на нее оксида азота в условиях in vitro: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (р< 0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению с активностью фермента при добавлении к донорской крови ДНКЖ в соотношении 1:150 (р< 0,05); 1 - контроль; 2 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:150; 3 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:100; 4 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:50; 5 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:25
Fig. 1. Specific activity of superoxide dismutase (conv. units/min-mg b) in donor blood under in vitro action of nitric oxide: * - difference is statistically significant as compared to control (р< 0,05); **- difference is statistically significant as compared to enzymatic activity when dinitrosyl iron complex was added in 1:150 ratio (р< 0,05); 1 - control; 2 - addition of dinitrosyl iron complex in 1:150 ratio; 3 - of dinitrosyl iron complex in 1:100 ratio; 4 - of dinitrosyl iron complex in 1:50 ratio;
5 - of dinitrosyl iron complex in 1:25 ratio
ДНКЖ в донорской крови и активностью СОД.
Так, при добавлении к донорской крови ДНКЖ
в соотношении 1:50 и 1:25 общая активность фермента упала на 11,47% (р=0,023) и 33,18% (р=0,019) соответственно, а удельная активность снизилась на 16,07% (р=0,034) и 35,52% (р=0,031) соответственно по сравнению с активностью фермента при добавлении в консервированную кровь ДНКЖ в соотношении 1:150.
Отмечено, что добавление ДНКЖ в донорскую кровь в соотношении 1:50 привело к увеличению общей и удельной активности ка-талазы на 26,72% (р=0,009) (табл. 1) и на 9,15% (р=0,011) (рис. 2), соответственно, по сравнению с контролем.
Добавление ДНКЖ в консервированную кровь в соотношениях 1:100, 1:50, 1:25 увеличило общую активность каталазы на 19,63% (р=0,013), 37,38% (р=0,015) и 25,23% (р=0,012)
соответственно по сравнению с активностью фермента при добавлении в консервированную кровь ДНКЖ в соотношении 1:150. Удельная активность фермента также увеличилась на 12,83% (р=0,009) и 17,76% (р=0,012) при добавлении ДНКЖ в донорскую кровь в соотношении 1:50 и 1:25 соответственно.
Отмечено, повышение как общей, так и удельной активности ГР при добавлении ДНКЖ в донорскую кровь во всех представленных соотношениях. Так, добавление ДНКЖ в соотношении 1:150 в донорскую кровь вызвало увеличение общей активности фермента на 6,66% (р=0,016), в соотношении 1:100 на 7,31% (р=0,015), в соотношении 1:50 на 25,18% (р=0,018), а в соот ношении 1:25 на 16,33% (р=0,015) соответственно по сравнению с контролем.
Рис.2. Удельная активность каталазы (усл.ед./мин*мг b) в донорской крови при воздействии на нее разных концентраций оксида азота в условиях in vitro. Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (р< 0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению с активностью фермента при добавлении к донорской крови ДНКЖ в соотношении 1:150 (р< 0,05); 1 - контроль; 2 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:150; 3 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:100; 4 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:50; 5 - добавление ДНКЖ
в соотношении 1:25.
Fig. 2. Specific activity of catalase (conv. units/minmg b) in donor blood under in vitro action of nitric oxide: * - difference is statistically significant as compared to control (р< 0,05); **- difference is statistically significant as compared to enzymatic activity when dinitrosyl iron complex was added in 1:150 ratio (р< 0,05); 1 - control; 2 - addition of dinitrosyl iron complex in 1:150 ratio; 3 - of dinitrosyl iron complex in 1:100 ratio; 4 - of dinitrosyl iron complex in 1:50 ratio;
5 - of dinitrosyl iron complex in 1:25 ratio
Рис.3. Удельная активность глутатионредуктазы (нмоль/мин*мг b) в донорской крови при воздействии на нее концентраций оксида азота в условиях in vitro: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (р< 0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению с активностью фермента
при добавлении к донорской крови ДНКЖ в соотношении 1:150 (р< 0,05); 1 - контроль; 2 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:150; 3 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:100; 4 - добавление ДНКЖ в соотношении 1:50; 5 - добавление ДНКЖ
в соотношении 1:25.
Fig. 3. Specific activity of glutathione reductase (nmol/min-mg b) in donor blood under in vitro action of nitric oxide: * - difference is statistically significant as compared to control (p(p< 0,05); **- difference is statistically significant as compared to enzymatic activity when dinitrosyl iron complex was added in 1:150 ratio (p< 0,05); 1 - control; 2 - addition of dinitrosyl iron complex in 1:150 ratio; 3 - of dinitrosyl iron complex in 1:100 ratio; 4 - of dinitrosyl iron complex in 1:50 ratio;
5 - of dinitrosyl iron complex in 1:25 ratio
Аналогичная тенденция наблюдалась и для удельной активности ГР, так, добавление ДНКЖ в соотношении 1:150; 1:100; 1:50; 1:25 увеличивало активность фермента на 57,92% (р=0,032), 85,96% (р=0,034), 95,12 (р=0,037) и 63,29% (р=0,033) соответственно по сравнению с контролем (рис. 3).
Показано, что при добавлении ДНКЖ в консервированную кровь в соотношениях 1:50 и 1:25 общая активность ГР возросла на 17,36% (р=0,017) и 9,06% (р=0,015) соответственно по сравнению с активностью фермента при добавлении в консервированную кровь ДНКЖ в соотношении 1:150. Удельная активность энзима также увеличилась при добавлении ДНКЖ в кровь в соотношениях 1:100 и 1:50 на 17,76% (р=0,039) и 23,55%(р=0,041) соответственно по сравнению с активностью ГР в
крови с добавлением ДНКЖ в соотношении 1:150.
В ходе проведенного исследования выявлен дозозависимый эффект воздействия динитрозильных комплексов железа на активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы донорской крови в условиях in vitro.
Предполагается, что одним из механизмов антиоксидантного действия ДНКЖ является связывание свободных ионов железа в составе нитрозильных комплексов. При этом ингиби-руются реакции свободно-радикального окисления, катализируемые редокс-активными ионами железа. Перекисное окисление липи-дов ингибируется благодаря взаимодействию ДНКЖ с алкилпероксильными и алкоксильны-ми радикалами. Оксид азота может защищать
другие биологические молекулы от окислительной модификации, нитрозилируя гемм и восстанавливая оксоферрилформы гемпроте-идов [6, 10].
ВЫВОДЫ
Таким образом, показано, что ДНКЖ обладают антиоксидантными свойствами, прояв-
ляющимися в повышении активности СОД, каталазы и ГР при внесении в донорскую кровь в условиях in vitro ДНКЖ в соотношениях 1:100 и 1:50. При добавлении ДНКЖ в соотношении 1:25 наблюдался спад активности ферментов антиоксидантной системы, особенно проявившийся в снижении как общей, так и удельной активности СОД.
Благодарность: Исследование проведено в рамках государственного задания по теме «Исследование молекулярных эффектов действия биорадикалов и экспериментально-клиническая разработка технологии их использования в регенеративной медицине».
Acknowledgement.: The study was conducted in the framework of the state assignment of the topic«The study of the molecular effects of the actions of bioradicals and experimentally-clinical development of the technology for their use in regenerative medicine».
1. Пат. № 2291880, РФ. Полимерная композиция для создания стабилизированной формы динитрозильного комплекса железа и метод синтеза этой формы / А.Ф. Ванин, В.И. Лозинский, В.И. Капелько. от 01.12.2005 г.
2. Сибгатуллина Г.В., Хаертдинова Л.Р., Гумерова Е.А. Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений: учебно-методическое пособие, Казань: Казанский (Приволжский) Федеральный Университет, 2011. 61 с.
3. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. Т 45, N 3. С.109-116.
4. Тимошин А.А., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Фармакокинетика и распределение динитрозильных комплексов железа в тканях органов крыс // Биофизика. 2012. Т.57, N 2. С. 331-337.
5. Ткачев Н.А. Влияние динитрозильных комплексов железа на индуцированный эндо-метриоз у крыс. Автореф. дис. к.б.н., Москва. 2015, 23 с.
КИЙ СПИСОК
6. Caranto J.D., Weitz A., Giri N, Hendrich M.P., Kurtz D.M. A diferrous-dinitrosyl intermediate in the N2O-generating pathway of a defla-vinated flavor-diron protein // Biochemistry. 2014. V. 53 (35) .P. 5631-5637.
7. Diers A.R., Broniovska K.A., Darley-Usmar V.M., Hogg N. Differential regulation of metabolism by nitric oxide and S-nitrosothiols in endothelial cells // Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol. 2011. V. 301, N 3. P. 1803-1812.
8. Mikula I., Durocher S., Martasek P., Mutus
B., Slama-Scwork A. Isoform-specific differences in the nitrite reductase activity of nitric oxide synthases under hypoxia // Biochem.J. 2009. V.418, N 3. P. 673-682.
9. Roberts R.A., Smith R.A., Safe S., Szabo
C., Tjalkens R.B., Robertson F.M. Toxicological and pathophysiological roles of reactive oxygen and nitrogen species // Toxicology. 2010. V. 276. P. 85-94.
10. Sharma S.K., Kim H, Roqler P.J., Karlin K.D. Isocyanide or nitrosyl complexation to hemes with varying axial base ligand donors: synthesis and characterization // Journal of biological inorganic chemistry. 2016. V. 21. P. 729-743.
REFERENCES
1. Vanin A.F., Lozinskii V.l., Kapel'ko V.I. Po-limernaya kompozitsiya dlya sozdaniya stabiliziro-vannoi formy dinitrozil'nogo kompleksa zheleza i metod sinteza etoi formy [Polymeric composition to create stabilized form of dinitrosyl iron complex and method of synthesis]. Patent RF, no. 2291880, 2005.
2. Sibgatullina G.V., Khaertdinova L.R., Gumerova E.A. Metody opredeleniya redoks-statusa kul'tiviruemykh kletok rastenii [Methods for determination of redox-status of cultivated plant cells]. Kazan': Kazanskij (Privolzhskii) Federal'nyi Universitet Publ., 2011, 61 p. 3. Sirota T.V. New approach in adrenaline auto-oxidation study and its use to determine superoxide dismutase activity. Voprosy meditsinskoi khimii [Problems of Med-
ical Chemistry]. 1999, vol. 45, no. 3, pp. 109-116. (in Russian)
4. Timoshin A.A., Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Vanin A.F. Distribution and pharmacokinetics of dinitrosyl iron complexes in rat organs. Biofizika [Biophysics]. 2012, vol. 57, no. 2, pp. 331-337. (in Russian)
5. Tkachev N.A. Vliyanie dinitrozil'nykh kom-pleksov zheleza na indutsirovannyi endometrioz u krys. Avtoref. dis. kand. biol. nauk [Dinitrosyl iron complexes action on rat induced endometriosis. Author's abstract of Ph.D. thesis]. Moscow, 2015, 23 p. 6. Caranto J.D., Weitz A., Giri N, Hendrich M.P., Kurtz D.M. A diferrous-dinitrosyl intermediate in the N2O-generating pathway of a defla-
vinated flavor-diron protein. Biochemistry. 2014, vol. 53 (35), pp. 5631-5637.
7. Diers A.R., Broniovska K.A., Darley-Usmar V.M., Hogg N. Differential regulation of metabolism by nitric oxide and S-nitrosothiols in endothe-lial cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2011, vol. 301, no. 3, pp. 1803-1812.
8. Mikula I., Durocher S., Martasek P., Mutus B., Slama-Scwork A. Isoform-specific differences in the nitrite reductase activity of nitric oxide synthases under hypoxia. Biochem. J. 2009, vol. 418, no. 3, pp. 673-682.
Критерии авторства
Диденко Н.В., Соловьева А.Г., Перетягин П.В. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Андреев В.П., Плахотская Ж.В. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Наталья В. Диденко
Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр Минздрава России, М.н.с.
Natalika-NV@mail.ru Анна Г. Соловьева
Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, К.б.н., с.н.с. sannag5@mail.ru
Петр В. Перетягин
Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр Минздрава России М.н.с.
peretyagin pv@gmail.ru
Поступила 11.04.2017
9. Roberts R.A., Smith R.A., Safe S., Szabo C., Tjalkens R.B., Robertson F.M. Toxicological and pathophysiological roles of reactive oxygen and nitrogen species. Toxicology. 2010, vol. 276, pp. 85-94.
10. Sharma S.K., Kim H., Roqler P.J., Karlin K.D. Isocyanide or nitrosyl complexation to hemes with varying axial base ligand donors: synthesis and characterization. Journal of biological inorganic chemistry. 2016, vol. 21, pp. 729-743.
Contribution
Didenko N.V., Soloveva A.G., Peretyagin P.V. carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Andreev V.P., Plakhotskaya Zh.V. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
AUTHORS' INDEX Affiliations
Natalia V. Didenko
Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Traumatology and Orthopedic Russian Ministry of Health
Research Assistant Natalika-NV@mail.ru
Anna G. Soloveva
Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Traumatology and Orthopedic Russian Ministry of Health
Ph.D. (Biology), Senior Researcher sannag5@mail.ru
Petr V. Peretyagin
Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Traumatology and Orthopedic Russian Ministry of Health
Research Assistant pe retyag i n pv@gmail.ru
Received 11.04.2017
