CC BY
116
УДК 577.121.7
© А.А. Торопова, С.В. Лемза, Ю.Э. Макушкина, Я.Г. Разуваева, А.Г. Мондодоев
ВЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА «АРКОСИТЕЛ» НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ ПОЧЕК БЕЛЫХ КРЫС ПРИ ИШЕМИИ/РЕПЕРФУЗИИ
Экспериментально установлено, что комплексное растительное средство «Аркосител» повышает содержание внутриклеточного АТФ при ишемии/реперфузии почек и сдвигает отношение лактат/пируват до физиологической нормы (10/1), что косвенным образом указывает на процесс частичного восстановления окислительного фосфорилирования.
Ключевые слова: «Аркосител», почки, ишемия/реперфузия, АТФ, молочная кислота, пировиноградная кислота, пируваткиназа, дыхание митохондрий.
A.A. Toropova, S.V. Lemza, Yu.E. Makushkina, Ya.G. Razuvaeva, A.G. Mondodoev
INFLUENCE OF PLANT REMEDY «ARKOSITEL» ON THE RENAL ENERGY METABOLISM At WHITE RATs IN ISCHEMIA/REPERFUSION
It has been experimental identified that the complex plant remedy «Arkositel» increases the content of intracellular ATP at kidneys ischemia/reperfusion and shifts lactate/pyruvate ratio to the physiological norm (10/1) that indirectly points at the process of partial restoration of oxidative phosphorilation.
Keywords: «Arkositel», kidneys, ischemia/reperfusion, ATP, lactate, pyruvic acid, pyruvate kinase, mitochondrial resperation.
Функциональные нарушения почек могут быть различного генеза, среди которых не последнее место занимают ишемические повреждения, сопровождающиеся изменением биоэнергетических процессов, сниженной продукцией АТФ, нарушением кальциевого гомеостаза, повышенной генерацией свободных радикалов, окислительным стрессом и инициацией апопто-тических процессов. Накапливается все больше данных о роли дисфункции митохондрий в патофизиологии и лечении широкого спектра заболеваний. Таким образом, митохондрии в настоящее время рассматриваются как мишень для терапевтического вмешательства с целью восстановления их функций [7]. Возникло даже отдельное направление в медицине - биоэнергетическая фармакология [5], направленная на лечение и предупреждение поражения различных органов и тканей, связанных с митохондриаль-ной дисфункцией.
Причинами прогрессирования хронических заболеваний почек может быть неконтролируемое употребление синтетических лекарственных препаратов, оказывающих нефротоксическое действие. По сравнению с ними средства растительного происхождения обладают низкой токсичностью, практически отсутствием побочных реакций при их длительном применении. Кроме того, фитосредства, содержащие целый комплекс биологически активных веществ, могут действовать на различные звенья патологического процесса, в том числе и на те, которые за-
трагивают энергетический метаболизм клеток. В связи с этим наблюдается повышенный интерес к использованию средств растительного происхождения в профилактике и комплексной терапии почечной патологии.
Цель настоящей работы - изучение влияния комплексного растительного средства «Аркосител» на энергетический метаболизм почек при их ишемии/реперфузии.
Материалы и методы. Объектом исследования послужило комплексное растительное средство, условно названное «Аркосител», состоящее из сухих экстрактов корней Scutellaria baicalensis Georgi, надземной части Arnica montana L., листьев Orthosiphon stamineus Benth., корней Comarum palustre L., корней Arctium lappa L. в соотношении 2:2:3:1:2. Технология получения экстрактов сухих заключалась в измельчении отдельных компонентов, экстракции спиртом этиловым (70% -S. baicalensis; 60% - A. montana, - O. stamineus, -C. palustre; 50% - A. lappa L.) с последующим концентрированием и вакуумной сушкой.
Исследования проведены на 40 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 180-200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом эксперимента животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом пола, воз-
А.А. Торопова и др. Влияние растительного средства «Аркосител» на энергетический метаболизм почек белых крыс при ишемии/реперфузии
раста, массы и принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986).
Животным опытной группы вводили внут-рижелудочно «Аркосител» в дозе 200 мг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней, крысам контрольной группы - внутрижелудочно дистиллированную воду в эквивалентном объеме по аналогичной схеме. Препаратом сравнения служил канефрон (ВЮКОЫСА АО) в изоэффективной дозе 30 мг/кг. На 6-е сутки моделировали двустороннюю 40-минутную ишемию (I) с последующей часовой реперфузией (Я) почек по методу КашЬа1 й а1. [8]. Выделение митохондрий из коркового слоя почек различных групп животных проводили по методу А.В. Панова [2].
Об энергетическом состоянии почек судили по содержанию внутриклеточного АТФ, концентрации пировиноградной и молочной кислот [1] и активности фермента пируваткиназы (ПК) [3] в гомогенате почек, а также по интенсивности окислительного фосфорилирования в митохондриях почек.
Функциональное состояние митохондрий оценивали полярографическим методом (поля-рограф «Эксперт-001») по скорости потребления кислорода в разных метаболических состояниях. В качестве субстрата дыхания использовали сукцинат в конечной концентрации 15 мМ. Окислительное фосфорилирование инициировали добавлением 150 цМ АДФ в инкубационную смесь объемом 1,0 мл. Изменение скорости потребления кислорода определяли в состояниях У40, У3 и У41 (по Б. Чансу) цикла фосфорилиро-вания добавленного АДФ. Для оценки энергетического статуса митохондрий рассчитывали коэффициенты стимуляции дыхания (СД=У3/У40) и сопряженности окислительного фосфорилиро-вания (АДФ/О).
Статистическую обработку проводили с использованием 1>критерия Стьюдента с помощью пакета прикладных программ «Вю81а1 - 2006». Различия между группами считали статистически значимыми при Р<0,05.
Результаты и обсуждение. В таблице 1 представлены данные по влиянию «Аркоситела» на биохимические показатели, отражающие энергетический статус почек. Как следует из таблицы, при 1/Я происходит снижение содержания внутриклеточного АТФ на 48% по сравнению интактной группой животных. Одновременно отмечается повышение активности пиру-ваткиназы в контрольной группе животных, поскольку АТФ является аллостерическим ингибитором данного фермента [6]. С другой стороны, повышенная активность ПК в контрольной группе указывает на повышенную утилизацию глюкозы в гликолитическом пути. На фоне введения «Аркоситела» и препарата сравнения наблюдается снижение активности ПК, которая приближается к активности в интактной группе животных.
При профилактическом введении «Аркоси-тела» содержание АТФ в ишемизированных клетках повышается на 35% по сравнению с данными в контрольной группе. При введении канефрона содержание АТФ возрастало на 31% по сравнению контролем. Известно, что отношение лактат/пируват в норме не превышает 10/1 и указывает на баланс между анаэробным и аэробным дыханием [4]. Сдвиг этого отношения в сторону лактата (при разобщении окислительного фосфорилирования) говорит о переходе клеток ткани на анаэробный гликолиз, что характерно для гипоксических, ишемических состояний. Действительно, как видно из таблицы 1, при 1/Я почек содержание лактата возросло на 82%, а уровень пирувата снизился на 24% по сравнению с интактными значениями, при этом соотношение лактат/пируват в контрольной группе составило 24/1.
Таблица 1
Влияние «Аркоситела» на показатели энергетического состояния почек белых крыс при ишемии/реперфузии
Показатели Группы животных
Интактная п=10 Контрольная (1/Я+Н2О) п=10 Опытная 1 (1/Я+ «Аркосител») п=10 Опытная 2 (1/Я+ канефрон) п=10
АТФ, мкмоль/г ткани 1,31±0,04 0,68±0,03* 0,92±0,03** 0,89±0,04**
Лактат, 1,73±0,09 3,15±0,14* 1,92±0,08** 2,12±0,08**
мкмоль/г ткани
Пируват, мкмоль/г ткани 0,169±0,008 0,128±0,004* 0,175±0,007** 0,177±0,006**
Лактат/Пируват 10,24±0,32 24,6±0,43* 10,97±0,27** 11,98±0,36**
Активность ПК, мкмоль/мин/мг белка 2,23±0,10 2,81±0,12* 2,43±0,09** 2,52±0,08**
Примечание. Здесь и далее * - различия статистически значимы по сравнению с интактом; ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем при Р<0,05.
Курсовое введение «Аркоситела» и канеф-рона способствовало снижению данного соотношения в ишемизированных органах до 11/1 и 12/1 соответственно. Это указывает на процесс частичного восстановления окислительного фосфорилирования в результате нормализации редокс-состояния клеток.
Для того чтобы подтвердить предположение о том, что «Аркосител» восстанавливает процессы окислительного фосфорилирования, нами проведена оценка окислительного фосфорили-рования в митохондриях почек в интактной, контрольной и опытных группах при 1/Я (таблица 2).
Таблица 2
Влияние «Аркоситела» на интенсивность окислительного фосфорилирования в митохондриях почек белых крыс при 1/Я
Группы животных
Параметры
дыхания митохондрий Интактная п=8 Контрольная (1/Я+Н2О) п=8 Опытная 1 (1/Я+ «Аркосител») п=8 Опытная 2 (1/Я+ канефрон) п=8
У3 12,05±0,33 7,14±0,22* 10,12±0,57** 9,42±0,15
У41 3,14±0,21 2,42±0,26 3,71±0,17** 2,71±0,11**
У4о 3,11±0,17 2,53±0,13 2,89±0,13** 2,57±0,10**
СД 3,87±0,26 2,82±0,14 3,50±0,11** 3,66±0,14**
АБР/О 1,66±0,10 0,97±0,07* 1,50±0,11** 1,19±0,17
Примечание. Размерности единиц скорости дыхания (У4п, Уз, У4о) - пто1 О2/мин/мг белка митохондрий.
Как следует из таблицы, 1/Я приводила к существенному снижению энергопродукции в митохондриях почек. Так, скорость дыхания в состоянии окислительного фосфорилирования У3 при окислении сукцината снижалась в 1,7 раза по сравнению с показателями у интактных животных. Скорость дыхания в состоянии У41 и У40 снижалась в среднем на 23%.
На фоне курсового введения «Аркоситела» скорость У3 повышалась на 42%, а при введении канефрона - на 32% по сравнению с контролем.
Индекс сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О) при 1/Я снижался на 42% по сравнению с интактом. При введении исследуемого фитосредства происходило повышение коэффициента сопряженности АДФ/О на 55%. Коэффициент стимуляции дыхания (СД=У3/У40) в контроле уменьшался на 27% по сравнению с интактом, а после курсового введения исследуемого средства и препарата сравне-
ния коэффициент стимуляции дыхания повышался на 24 и 30% соответственно (табл. 2).
Вероятнее всего восстановление окислительного фосфорилирования связано с нормализацией окислительно-восстановительного баланса клетки, обусловленного выраженными антиоксидантными свойствами исследуемого фитосредства. Не исключено, как показано в работе ТгитЬескайе й а1. [9], что биологически активные вещества могут непосредственно влиять на активность составляющих фосфорили-рующей системы, таких как Б^АТРаза и/или АТФ/АДФ транслокатор, а также активировать комплексы дыхательной цепи переноса электронов.
Суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что исследуемое фитосредство «Аркосител» обладает энергопротекторным действием и усиливает интенсивность дыхания митохондрий при 1/Я почек.
С.А. Чукаев. Оценка фармакотерапевтической эффективности мексидола в качестве средства коррекции гипоксических, ишемических и реоксигенационных повреждений
Литература
1. Методы биохимических исследований (ли-пидный и энергетический обмен): учеб. пособие / под ред. проф. М.И. Прохоровой. - Л., 1982. - 272 с.
2. Влияние бычьего сывороточного альбумина на дыхательную активность митохондрий мозга и печени мышей и крыс / А.В. Панов, В. А. Вавилин, В.В. Ляхович, Б.Р. Брукс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149. -№ 2. - С. 146-149.
3. Практикум по биохимии / под ред. С.Е. Северина, Г. А. Соловьевой. - М., 1989. - 509 с.
4. Торшин В.А. Уровень лактата крови как показатель 8ТАТ-анализа // Лаборатория. - 2001. - № 4. - С. 17-19.
5. Хазанов В.А. Биоэнергетическая фармакология - новое направление в медицине // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Прил. 2. - С. 35-40.
6. Insulinotropic effect of cinnamaldehyde on transcriptional regulation of pyruvate kinase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, and GLUT4translocation in experimental diabetic rats / P. Anand et al. // Chemico-Biol. Interact. - 2010. - 186. - P. 72-81.
7. Hroudova J., Fisar Z. In vitro inhibition of mitochondrial respiratory rate by antydepressants // Toxicol. Lett. - 2012. - № 213. - P. 345-352.
8. Kaushal G.P., Singh A.B., Shah S.V. Identification of gene family of caspases in rat kidney and altered expression in ischemia-reperfusion injury // Am. J. of Physiology. - 1998. - Vol. 274, N 3. - P. 587594.
9. Achillea millefolium L. s.l. herb extract: Antioxidant activity and effect on the rat heart mitochondrial functions / S. Trumbeckaite et al. // Food Chemistry. - 2011. - Vol. 127, № 4. - P. 1540-1548.
Торопова Анюта Алексеевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 433713. E-mail: anyuta-tor@mail.ru.
Лемза Сергей Васильевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 433713.
Макушкина Юлия Эдуардовна - аспирант, ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 433713.
Разуваева Янина Геннадьевна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 433713.
Мондодоев Александр Гаврилович - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 433713.
Toropova Anyuta Alekseevna - candidate of biological sciences, scientific researcher, laboratory of safety of biologically active substances, Institute of General and Experimental Biology SB RAS. Tel. (3012) 433713; E-mail: anyuta-tor@mail.ru.
Lemza Sergey Vasilyevich - candidate of biological sciences, senior researcher, laboratory of experimental pharmacology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS. Tel. (3012) 433713.
Makushkina Yulia Eduardovna - postgraduate student, laboratory of experimental pharmacology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS. Tel. (3012) 433713.
Razuvaeva Yanina Gennadievna - doctor of biological sciences, senior researcher, laboratory of safety of biologically active substances, Institute of General and Experimental Biology SB RAS. Tel. (3012) 433713.
Mondodoev Alexander Gavrilovich - doctor of medical sciences, head of the laboratory of experimental pharmacology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS. Tel. (3012) 433713.
УДК 615.2 + 616-092.9 + 577.334
© С.А. Чукаев
ОЦЕНКА ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕКСИДОЛА В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА КОРРЕКЦИИ ГИПОКСИЧЕСКИХ, ИШЕМИЧЕСКИХ И РЕОКСИГЕНАЦИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ
В серии экспериментальных исследований на лабораторных животных проведена оценка фармакотерапевтической эффективности мексидола (3-окси-6-метил-2-этилпири-динсукцината) при гипоксии, ишемии и в период реоксигенации.
Ключевые слова: гипоксия, реоксигенационные повреждения, ишемия, мексидол.
S.A. Chukaev
EVALUATION OF MECSIDOL PHARMOCOTHERAPEUTICAL EFFICIENCY AS A REMEDY OF CORRECTION AT HYPOXIA, ISCHEMIA AND REOXIGENATION INJURY
The pharmacotherapeutical efficiency of the mecsidol (3-oxy-6-metyl-2-etylpiri-dinesuccinate) at hypoxia, ischemia and reoxigenation has been evaluated in the series of experimental researches on rats.
