CC BY
58
haemoblock for local topical use haemoblock in different surgical situations. Multicenter clinical trials. Vestnik sovremennoy klinicheskoy meditsiny. 2015; 8 (1): 56—61. (In Russ.)]
3. Пфафф В.Ф. Опыт клинического применения нового гемостатического средства Гемоблок в хирургической практике. — М., 2014. — 56 с. [Pfaff V.F. Opyt klinicheskogo primeneniya novogo gemostaticheskogo sredstva Gemoblok v khirurgicheskoy praktike. (Clinical experience of using «haemoblock» hemostatic in surgery.)
Moscow. 2014; 56 p. (In Russ.)]
4. Якупов А.Ф., Сангаджиев С.Б., Мустафин Р.Р., Анисимов А.Ю. Сравнительная оценка эффективности диагностики и хирургического лечения больных портальной гипертензией // Вестн. соврем. клин. мед. — 2013. — Т. 6, № 5. — С. 11-17. [Yakupov A.F., Sangadzhiyev S.B., Mustafin R.R., Anisimov A.Y. Comparative evaluation of diagnosis and surgical treatment of portal hypertension. Vestnik sovremennoy klinicheskoy meditsiny. 2013; 6 (5): 11-17. (In Russ.)]
УДК 612.115.3: 612.085.2: 616.151.5: 616.12-009.72: 615.273.53
ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ КАМФЕНА НА ПРОЦЕССЫ СВЁРТЫВАНИЯ
КРОВИ
Адэля Анваровна Рахматуллина12*, Рамиль Габдельхакович Тураев23, Сергей Васильевич Киселёв1, Лилия Евгеньевна Никитина1, Андрей Вениаминович Бодров1
1Казанский государственный медицинский университет, г. Казань, Россия; 2Республиканский центр крови, г. Казань, Россия; 3Казанская государственная медицинская академия, г. Казань, Россия;
Реферат DOI: 10.17750/KMJ2015-455
Цель. Определить влияние синтезированных серосодержащих производных камфена на функциональную активность тромбоцитов и коагуляционную способность плазмы крови человека в условиях in vitro.
Методы. Реакцией электрофильного присоединения тиолов получили сульфид и сульфон камфена. Структуры полученных соединений устанавливали при помощи данных ядерно-магнитного резонанса на ядрах 'Н и 13С, хроматомасс-спектрометрии и рентгеноструктурного анализа. Гемокоагуляционную активность синтезированных соединений оценивали по определению спонтанной агрегации тромбоцитов и коагуляционной активности плазмы, полученной из венозной крови пациентов с ишемической болезнью сердца, а индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали на плазме, полученной от здоровых доноров.
Результаты. Полученные соединения показали антиагрегационную и антикоагуляционную способность: подавляли спонтанную и индуцированную агрегацию тромбоцитов, а также снижали коагуляционные свойства плазмы крови человека. Как камфеновый сульфон, так и в большей степени камфеновый сульфид (в отличие от ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела) полностью ингибировали активацию тромбоцитов, индуцированную адреналином, аденозиндифосфатом, коллагеном, арахидоновой кислотой, и снижали воздействие ристоцетина. Антикоагулянтная активность полученных веществ обусловлена их свойством ингибировать активацию тромбоцитов и подавлять каталитическую способность фосфолипидной поверхности, участвующей в формировании коа-гуляционных комплексов факторов свёртывания.
Вывод. Низкая токсичность терпеноидов и выявленная антиагрегационная и антикоагуляционная способность серосодержащих соединений камфена делает их весьма перспективными веществами с возможностью создания на их основе новых лекарственных средств для лечения и профилактики тромбофилии различной этиологии.
Ключевые слова: сульфид и сульфон камфена, тромбоциты, антиагрегационная и антикоагуляционная активность.
CLOTTING ACTIVITY OF CAMPHENE DERIVATIVES
A.A. Rakhmatullina1-2, R.G. Turaev2,3, S.V. Kiselev1, L.E. Nikitina1, A.V. Bodrov1
Kazan State Medical University, Kazan, Russia;
2Republican Blood Centre, Kazan, Russia;
3Kazan State Medical Academy, Kazan, Russia
Aim. To study of the influence of new synthetized sulfur-containing derivatives of camphene on the thrombocytes aggregating ability and clotting activity of human blood plasma in vitro.
Methods. Sulfides and sulphones of camphene were synthesized by thiols electrophilic addition reaction. The structures of the synthetized compounds were clarified by using of 'H and 13C nuclear magnetic resonance, chromato-mass spectrometry and X-ray analysis. Clotting activity of the synthetized compounds was assessed by studying the spontaneous platelet aggregation and plasma coagulating activity of the venous blood of patients with ischemic heart disease. The induced platelets aggregation was studied on plasma obtained from healthy donors.
Results. The synthetized compounds demonstrated anti-aggregating and anti-coagulating activity: they inhibited spontaneous and induced thrombocyte aggregation as well as reduced coagulating ability of human plasma. Both camphene sulphone and mainly camphene sulfide (in contrast with acetylsalicylic acid and clopidogrel) totally inhibited thrombocytes aggregation induced by adrenaline, adenosine diphosphate, collagen and arachidonic acid, and decreased the influence of ristocetin. Anticoagulant activity of the synthetized substances is associated to their potential to inhibit thrombocyte activation and to reduce the catalyst activity of phospholipid surface participating in coagulating complexes and clotting factors formation.
Conclusion. Low toxicity of terpenoids together with discovered anticoagulant activity of sulfur-containing derivatives
Адрес для переписки: adelina_vau@inbox.ru
of camphene revealing the promising potential of these drugs for further development of novel medical treatments for treating and prevention of different types of thrombophilia.
Keywords: camphene sulphone, camphene sulfide, platelets, antiplatelet activity, anticoagulant activity.
Сердечно-сосудистые заболевания остаются основной причиной смертности во всём мире. Развитие этих заболеваний определяется ате-росклеротическим поражением кровеносных сосудов, приводящим к образованию тромба и прекращению кровотока в жизненно важных органах. Артериальный тромбоз обусловлен адгезией, агрегацией тромбоцитов и последующей активацией коагуляционного гемостаза. именно поэтому идёт активное изучение препаратов, угнетающих активность тромбоцитов.
Нами было сделано предположение, что подобными свойствами могут обладать соединения, полученные на основе терпенов. В качестве исходного соединения был выбран монотерпен — камфен.
Терпены представляют собой обширный класс веществ, содержащихся во всех живых организмах. Одна из функций терпеновых соединений — придание механической стойкости клеточным мембранам [6]. известно, что поверхность клеток, контактирующих с кровью, атромбогенна, но при действии различных физиологических и патологических агентов она приобретает способность связывать и активировать факторы свёртывания. Эти индукторы, воздействуя на специфические клеточные рецепторы или просто повреждая клетки, приводят к трансформации поверхности мембраны, и она приобретет тромбогенные свойства [1, 2]. использование полученных представлений позволило провести целенаправленный синтез соединений, обладающих способностью повлиять на эти процессы.
Цель исследования — определить влияние синтезированных серосодержащих производных камфена на функциональную активность тромбоцитов и коагуляционную способность плазмы крови человека в условиях in vitro.
Реакцией электрофильного присоединения тиолов получали сульфид и сульфон монотерпена — камфена. Структуры полученных соединений устанавливали при помощи данных ядерно-магнитного резонанса на ядрах 'Н и 13С, хроматомасс-спектрометрии и рентгенострук-турного анализа.
Синтез тиоловых терпенов обусловлен тем, что сера относится к биогенным элементам, а сульфиды, сульфоксиды и сульфоны природных углеводородов зачастую обладают фармакологической активностью, поэтому объединение в одной молекуле двух фармакофорных фрагментов — терпенового скелета и серосодержащей функции — является предпосылкой для получения новых биологически активных соединений с низкой токсичностью.
Возможность применения полученных веществ для коррекции гемостаза определяли в условиях in vitro, используя кровь человека. Кровь 456
получали путём пункции кубитальной вены и стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия. Затем центрифугированием выделяли богатую и бедную тромбоцитами плазму.
для оценки гемокоагуляционной активности полученных веществ определяли скорость агрегации тромбоцитов и проводили поверхностно-зависимые стандартные коагуляционные тесты: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое и тромбиновое время. агрегационную способность тромбоцитов устанавливали с помощью анализатора «Chrono-Log Corporation» (США) по методу G. Born [5]. Коагуляционную активность определяли на коагулометре «минилаб-7001» (Россия).
Гемокоагуляционную активность синтезированных соединений устанавливали путём определения спонтанной агрегации тромбоцитов и коагуляционной активности плазмы, полученной из венозной крови пациентов с ишемической болезнью сердца (иБС) и выраженными изменениями в системе гемостаза, а индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали на плазме, полученной от здоровых доноров.
С этой целью к 0,45 мл плазмы добавляли 0,05 мл раствора, содержащего 36 мм препарата в растворе этилового спирта, и инкубировали полученную смесь в течение 5 мин при температуре 37 °С. В контрольных опытах к плазме добавляли растворитель, используемый для приготовления препарата (30% водный раствор этилового спирта). для индукции агрегации тромбоцитов применяли растворы аденозиндифосфата (АдФ, 5 мкм), эпинефри-на (адреналина, 10 мкм), коллагена (2 мкг/мл), арахидоновой кислоты (0,5 мм) и ристомицина (1 мг/мл).
Полученные вещества по химической природе не имеют аналогов среди антиагрегацион-ных препаратов, поэтому для сравнения выбрали ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел (плавикс) как наиболее клинически значимые лекарственные средства. для этого использовали плазму крови больных иБС, которые получали соответствующие лекарственные препараты.
Результаты исследования обработаны с помощью пакета статистических программ Microsoft Excel. Статистическую значимость различий параметров определяли регрессионным и вариационным анализами по критерию Стьюдента при уровне значимости менее 0,05.
Полученные данные показали, что у синтезированных на основе камфена соединений обнаружена высокая антиагрегационная активность: спонтанная скорость и показатель агрегации значительно уменьшались и достигали нормальных значений (не более 0,05 отн.ед./мин и
Примечание: АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время; n — количество измерений; *p <0,05 по сравнению с показателями без препарата.
Таблица 2
Влияние производных камфена на индуцированную in vitro агрегацию тромбоцитов по сравнению с ацетилсалициловой кислотой и клопидогрелом
Таблица 1
Влияние производных тиотерпеноидов камфенового ряда на агрегацию тромбоцитов и показатели коагуляционного гемостаза in vitro у пациентов с ишемической болезнью сердца
Плазма Скорость агрегации, отн.ед./мин Показатель агрегации, отн.ед. АЧТВ, с Протромбиновое время, с Тромбиновое время, с
Без препарата 0,265±0,185 2,01±0,6 24,4±0,44 8,95±0,26 15,5±0,3
Сульфид, n=10 0,012±0,02* 1,27±0,02* 28,5±2,4* 9,93±0,74* 15,3±0,4
Сульфон, n=10 0,053±0,02* 1,41±0,24* 27,9±2,25* 9,85±0,68* 14,9±0,2
Препарат-индуктор Контроль, % Сульфид, % Сульфон, % Ацетилсалициловая кислота, % Клопидогрел, %
Аденозиндифосфат 54,41±1,56 0* 20±5,6* 46,3±9,1* 35,1±3,2*
Эпинефрин (адреналин) 66,5±2,50 0* 0* 36,3±3,1* 51,3±0,7*
Арахидоновая кислота 65,5±3,50 0* 0* 24,6±2,4* 64,6±2,8*
Коллаген 63,33±10,21 0* 10±4,2* 38,4±14,6* 33,1±10,7*
Ристомицин 66,66±6,31 40±10,2* 20±6,4* 48,2±19,1* 56,4±9,8*
Примечание: контроль — плазма без препаратов, количество измерений в каждом случае соответствовало 5; *р <0,05 по отношению к показателям без препарата.
1,35 отн.ед./мин соответственно, табл. 1).
Кроме того, они также снижали и коагуляци-онную активность плазмы: нормализовали АЧТВ и увеличивали протромбиновое время. Однако при этом исследуемые соединения не влияли на активность тромбина (тромбиновое время не изменялось). Следовательно, полученные вещества ингибируют активацию как тромбоцитов, так и коагуляционных факторов, и эта способность при сравнении сульфида и сульфона различалась незначительно (р >0,05). Таким образом, изменение состава серосодержащих групп камфена существенным образом не сказывалось на наблюдаемых показателях.
Активация тромбоцитов индуцируется посредством специфических рецепторов при воздействии различных физиологических или патологических факторов — коллагена, адреналина, АДФ и др. [4]. Наше исследование показало, что как камфеновый сульфон, так и в большей степени камфеновый сульфид (в отличие от ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела) обладают значительной ингибирующей способностью: практически полностью подавляют индуцированную адреналином, АДФ, коллагеном, арахи-доновой кислотой агрегацию тромбоцитов и снижают воздействие ристоцетина (табл. 2).
Из полученных данных следует, что особенность синтезированных соединений — их способность подавлять активацию тромбоцитов путём ингибирования рецепторов, которые отвечают за передачу импульса, запускающего внутриклеточные процессы. Эти процессы приводят к изменению структуры клеточной мембраны тромбоцитов, и они приобретают как способность к адгезии и агрегации, так и тромбогенные
свойства, что в свою очередь приводит к активации плазменного гемостаза.
Антикоагуляционные свойства производных камфена, вероятно, обусловлены способностью терпенов стабилизировать клеточные мембраны за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий с их фосфолипидами [6]. Об этом свидетельствуют результаты изменения агрегации тромбоцитов, индуцированной арахидоновой кислотой. Ара-хидоновая кислота в отличие от других использованных индукторов не активирует тромбоциты через рецепторы, а непосредственно инициирует внутриклеточные процессы, проникая через плазматическую мембрану [4]. Следовательно, потеря этого свойства в присутствии камфено-вых производных обусловлена изменением проницаемости мембраны тромбоцитов за счёт образования дополнительных межмолекулярных взаимодействий. Очевидно, связывание серосодержащих производных камфена с модельными фосфолипидными поверхностями объясняет и изменение функционирования комплексов факторов свёртывания в поверхностно-зависимых стандартных коагуляционных тестах.
Всесторонние экотоксикологические исследования монотерпенов, включающие испытания на острую токсичность для человека, животных и растений, а также тесты на генотоксичность, тератогенную токсичность и влияние на репродуктивные функции организмов, показали, что терпены относятся к малотоксичным соединениям (LD50 от 2000 до 10000 мг/кг), не обладают мутагенными свойствами и не являются репродуктивными ядами [3]. Эти свойства и обнаруженные антиагрегационные и антикоагуляцион-ные способности серосодержащих производных
камфена делают их перспективными веществами с возможностью создания на их основе новых лекарственных средств для лечения и профилактики тромбофилии различной этиологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н. Функциональная концепция инициирования свёртывания крови клеточными мембранами // Гематол. и трансфузи-ол. — 1991. — Т. 36, №4. — С. 5-9. [Zubairov D.M., Timerbaev V.N. Functional conception of initiating the blood clotting by cell membranes. Gematologiya i transfuziologiya. 1991; 36 (4): 5-9. (In Russ.)]
2. Киселёв С.В., Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н. Взаимодействие фактора Х человека с тканевым тромбоплас-тином // Биомед. хим. — 2003. — Т. 49, №5. — С. 443450. [Kiselev S.V., Zubairov D.M., Timerbaev V.N. Human factor X interaction with thromboplastin. Biomeditsinskaya khimiya. 2003; 49 (5): 443-450. (In Russ.)]
3. Старцева В.А., Никитина Л.Е., Сиразиева Е.В. и др. Синтез и биологическая активность монотерпе-ноидов ментанового ряда // Химия в интересах устойчивого развития. — 2009. — Т. 17, №5. — С. 539-545. [Startseva V.A., Nikitina L.E., Sirazieva E.V. Synthesis and Biological activity of monoterpenoids of menthane series. Khimiya v interesakh ustoychivogo razvitiya. 2009; 17 (5): 539-545. (In Russ.)]
4. Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. — СПб.: Изд-во. СПб ГМУ, 2000. — 227 с. [Shitikova A.S. Trombotsitarnyy gemostaz. (Thrombocytic hemostasis.) Saint Petersburg: Publishing house of Saint Petersburg State Medical University. 2000; 227 p. (In Russ.)]
5. Born G. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. — 1962. — Vol. 194. — Р. 927-929.
6. Farzaneh M., Ahmadzadeh M., Hadian J. et al. Chemical composition and antifungal activity of the essential oils of three species of Artemisia on some soil-borne phytopathogens // Commun. Agric. Appl. Biol. Sci. — 2006. — Vol. 71, iss. 3. — P. 1327-1333.
Уважаемые читатели!
С1 сентября начинается подписка на 2016 год на «Казанский медицинский журнал»
Первоочередная задача «Казанского медицинского журнала», как и в предшествующие годы, — удовлетворение запросов врачей самых различных специальностей, научных работников и студентов. Актуальные статьи по терапии, хирургии, акушерству и гинекологии, педиатрии, рентгенологии и радиологии, невропатологии, оториноларингологии, офтальмологии, стоматологии, урологии, дерматовенерологии и другим дисциплинам представляют интерес для всех специалистов и врачей широкого профиля. Освещаются вопросы гигиены и организации здравоохранения, истории медицины. Помещаются обзоры и лекции на актуальные темы, информация о съездах и конференциях, новых лечебных методах и препаратах, новых книгах.С журналом сотрудничают крупнейшие учёные России. С 1996 г. «Казанский медицинский журнал» представлен в международной электронной информационной сети Интернет (адрес сайта: http://www.kazan-medjournal.ru). С 2002 г. все статьи нашего журнала представлены в научной электронной библиотеке: http://www.elibrary.ru.
Статьи от авторов принимаются только при наличии ксерокопий квитанций о подписке.
Подписные индексы журнала:
годовая подписка: 48073 - Агентство Роспечать, 83076 - Почта России.
подписка на полгода: 73205.
