ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 3-ФОРМИЛХРОМОНА IN VITRO НА АГРЕГАЦИЮ ЧАСТИЦ Р-АМИЛОИДА И АКТИВНОСТЬ ТИРОЗИНАЗЫ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.74-071.5 https://doi.org/10.29296/25877313-2021-01-02

© Коллектив авторов, 2021

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 3-ФОРМИЛХРОМОНА IN VITRO НА АГРЕГАЦИЮ ЧАСТИЦ В-АМИЛОИДА И АКТИВНОСТЬ ТИРОЗИНАЗЫ

Д.И. Поздняков

к.фарм.н., зав. лабораторией живых систем, доцент, кафедра фармакологии с курсом клинической фармакологии,

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ (г. Пятигорск)

E-mail: [email protected]

В.М. Руковицина

аспирант, кафедра органической химии,

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ (г. Пятигорск) E-mail: [email protected] М.В. Ларский

к.фарм.н., зав. кафедрой фармацевтической химии,

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ (г. Пятигорск) E-mail: [email protected]

Актуальность. Болезнь Альцгеймера - одна из самых распространенных терминальных форм деменции, характеризующаяся сложным патогенезом с формированием амилоидных включений в структурах мозга. В тоже время одним из новых и перспективных направлений терапии болезни Альцгеймера является воздействие на амилоидогенный каскад. Цель исследования. In vitro оценить влияние десяти производных 3-формилхромона на процессы формирования агрегатов р-амилоида и активность тирозиназы.

Материал и методы. Влияние исследуемых соединений на активность тирозиназы оценивали по методу Mapunya, используя в качестве субстрата L-тирозин, в качестве референта - койевую кислоту. Агрегацию амилоидных частиц изучали спектрофото-метрически в реакции с конго красным через три и шесть дней инкубации.

Результаты. В ряду изучаемых объектов наиболее существенными антитирозиназными свойствами обладало 6-ацетилза-мещенное производное 3-формилхромона, величина IC50 которого сопоставима с койевой кислотой (32±1,913 мкг/мл против 30,2±1,599 мкг/мл). Также данное соединение наиболее существенно ингибировало агрегацию амилоидных частиц на третий день инкубации - на 31,0% (р<0,05) и на шестой день - на 61% (р<0,05). Стоит отметить, что 3-формилхромон и оксим данного соединения значимого влияния на активность тирозиназы и амилоидогенез не оказали.

Выводы. Проведенное исследование позволяет предполагать актуальность дальнейшего изучения 6-ацетилзамещенного 3-формилхронома как потенциального средства патогенетической терапии болезни Альцгеймера. Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, производные хромона, тирозиназа, /3-амилоид.

Для цитирования: Поздняков Д.И., Руковицина В.М., Ларский М.В. Влияние производных 3-формилхромона in vitro на агрегацию частиц В-амилоида и активность тирозиназы. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2021;24(1):11-15. https://doi.org/10.29296/25877313-2021-01-02

Болезнь Альцгеймера (БА) - хроническое нейродегенеративное заболевание, являющееся основной причиной деменции, оно составляет порядка 80% всех случаев диагностированной деменции [1]. На сегодняшний день БА страдают порядка 46,8 млн человек, при этом к 2030 г. прогнозируется увеличение числа случаев БА до 131,5 млн. В период с 2000 по 2014 гг. смертность, ассоциированная с БА, только в США выросла на 89%. Кроме того, по различным оценкам прямые и косвенные затраты 18 крупнейших экономик мира на

лечение и поддержание должного уровня жизни пациентов, страдающих БА, составляют более 1 трлн долларов США ежегодно, с прогнозируемым их увеличением до 2 трлн к 2030 г. [2]. Патогенез БА определяют гистопатологические нарушения, связанные с внеклеточным отложением ß-амилоидов (Aß) и накоплением внутри нейронов гиперфосфорилированного may-белка, преимущественно в энторинальной коре и гиппокампе [3]. Известно, что Aß образуется при расщеплении белка предшественника ß-амилоида (Amyloid Pre-

cursor Protein, АРР), который расположен на нейрональной мембране и включает 40-42 аминокислоты ферментами группы секретаз (а,(3 и у-сек-ретазой), причем для развития Б А определяющую роль играет нарушение функционирования у-сек-ретазного комплекса [4]. Также в образовании А(3 важную роль играет повышение активности тиро-зиназы, которая может катализировать распад ли-пидных мембранных рафтов [5]. Агрегаты А(3 имеют аномальную структуру и практически не выводятся из мозговой ткани. Обнаружено, что А(3 непосредственно связывается с фибриногеном с константой диссоциации (КД) < 7 нм, что, возможно, изменяет его третичную структуру и способствует росту тромбов. Более длинные фрагменты А(3 гидрофобны и связаны с повышенным риском развития БА. Так, A(3i-42 наиболее широко изучен в силу его широкого распространения у пациентов, предрасположенных к БА; он более токсичен как в клетках, так и у экспериментальных животных [6]. В связи с этим представляется актуальным изучение влияния фармакологически активных субстанций на процессы агрегации амилоидных частиц и активность тирозиназы как одних из основных патогенетических механизмов развития БА. В ранее проведенных исследованиях было установлено, что производные 3-формил-хромона обладают потенциальными нейротроп-ными свойствами, на основании чего данный класс веществ включен в структуру настоящего исследования.

Цель работы - оценить влияние производных 3-формилхромона на изменение активности тирозиназы и процесс агрегации амилоидных частиц in vitro.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследуемые производные 3-формилхромона получены на кафедре органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института под руководством профессора Э.Т. Оганесяна. Структуры исследуемых соединения подтверждены методом ЯМР-спектроскопии (табл. 1).

Влияние изучаемых соединений на изменение активности тирозиназы исследовали по методу, описанному Mapunya et al. [7]. Исследуемые соединения растворяли в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 20 мг/мл. Данный маточный раствор затем разбавляли калий-фосфатным буфером (рН 6,5) до содержания изучаемых веществ - 600 мкг/мл.

Таблица 1. Структуры исследуемых соединений

Структурная формула Лабораторный шифр

о FC-1

О FC-2

V^VS lAJUo О FC-3

FC-4

о FC-5

9 ГТ Т СНз о FC-6

сг он о FC-7

F^^^ 11 ^^ ОН о FC-8

о FC-9

о FC-10

Далее готовили восемь серийных двукратных разведений. Койевая кислота в аналогичных концентрациях использовалась в качестве контроля. В 96-луночный планшет вносили по 70мкл каждого серийного разведения и добавляли 30 мкл тирози-назы (333 ед/мл в фосфатном буфере с рН 6,5). После инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин в анализируемую среду вносили 110 мкл субстрата (L-тирозин 2 мМ). Оптическую плотность реакционной смеси регистрировали при 492 нм с помощью планшетного ридера Infinite F50 («Тесап», Австрия). Тесты выполнялись в триплет-ном варианте. Тирозиназа была получена от «Sigma-Aldrich» (Германия). Койевая кислота предоставлена «Warrant Pharmaceuticals» (КНР) [7].

Процесс агрегации амилоидных частиц оценивали в реакции взаимодействия А(3 с конго красным. 25 мкл раствора исследуемых соединений в диметилсульфоксиде (конечная концентрация - 20 мг/мл) смешивали с 225 мкл 20 мМ раствора конго красного в PBS. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре. Далее регистрировали оптическую плотность образцов при длинах волн 540 и 405 нм через три и шесть дней инкубации. Количество агрегатов А(3 рассчитывали по формуле

Ар = _ _ A405CR/8620, 4780 6830 '

где ACR405 - оптическая плотность раствора конго красного при длине волны 405 нм; А540 и А405 - оптическая плотность раствора, содержащего исследуемые вещества при длинах волн 540 и 405 нм соответственно [8]. Фрагмент A(3i-4o был получен от «Sigma-Aldrich» (Германия).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением программного пакет STATISTICA 6.0 («StatSoft», США). Данные выражали в виде М (среднее значение) ±SEM (стандартная ошибка среднего). Статистические различия между группами оценивали методом од-нофакторного дисперсионного анализа с посттестом Ньюмена-Кейсла при /><0,05. Показатель IC50 рассчитывали методом пробит-анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты оценки антитирозиназной активности производных 3-формилхромона представлены в табл. 2. Как видно из полученных данных, наиболее выраженную ингибирующую активность по отношению к тирозиназе оказали соединения под шифрами FC-9 и FC-10, показатель IC50 которых был сопоставим с референтом - койевой кислотой в аналогичной концентрации. Остальные изучаемые вещества проявляли значительно меньший уровень фармакологической активности (IC50 статистически значимо был выше такового у койевой кислоты).

Таблица 2. Результаты оценки антитирозиназной активности производных 3-формилхромона

Соединение FC-1 FC-2 FC-3 FC-4 FC-5 FC-6 FC-7 FC-8 FC-9 FC-10 КК

ICso±SEM, мкг/мл 105,4±2,127* 124,9±2,61* 56,3±1,515* 49,7±1,322* 76,9±1,95* 54,6±1,633* 97,9±1,23* 112,5±1,723* 32±1,913 38,3±1,317 30,2±1,599

Примечание: КК - койевая кислота; * - статистически значимо относительно койевой кислоты (р< 0,05, критерий Ньюмена-Кейсла)

В процессе оценки влияния исследуемых соединений на изменение процесса агрегации амилоидных частиц установлено, что в ряду исследуемых объектов через три дня экспозиции вещества под шифрами ГС-4, ГС-9, БС-Ю подавляли образование агрегатов на 25,7% (р<0,05), 31,0% (/;<(),05), 28,8% (/;<(),05) соответственно (рисунок). Спустя шесть дней инкубации соединения под лабораторными шифрами БС-З, ГС-4, ГС-5, БС-б, ГС-9, БС-Ю подавляли образование амилоидных

агрегатов на 36,9% (р<0,05), 53,5% (р<0,05), 44,7% (р<0,05), 45,2% (р<0,05), 61% (р<0,05) и 47,8% (/;<(),05) соответственно (рисунок). При этом на фоне внесения в анализируемую среду соединения ГС-9 агрегация амилоидных частиц подавлялась более значимо, нежели при добавлении вещества ¥С-\ - на 56,3% (р<0,05); ¥С-2 - 57,8% (р<0,05); ¥С-3 - 38,2% (р<0,05); БС-5 - 29,5% (р<0,05); ¥С-6 - 28,8% (р<0,05); БС-7 - 54,9% (р<0,05); БС-8 - 56,1% (р<0,05) и БС-Ю - на 25,3% ¿<0,05).

чО

День 3 День 6

□ Ар HFC-1 E3FC-2 01FC-3 HFC-4 BFC-5 BFC-б EJFC-7 DFC-8 EFC-9 SFC-10

Рисунок. Влияние исследуемых соединений на процесс агрегации амилоидных частиц в реакции с конго красным: Ар - контрольная проба, не содержащая исследуемые вещества; * - статистически значимо относительно контрольной пробы (р<0,05, критерий Ньюмена-Кейсла); # - статистически значимо относительно соединения РС-9 (р<0,05, критерий Ньюмена-Кейсла)

Болезнь Альцгеймера - нейродегенеративная патология, от которой в настоящее время страдают более 40 млн человек во всем мире и по прогнозам, в ближайшие десятилетия заболеваемость БА будет экспоненциально расти [9]. Одним из основных патогенетических механизмов развития БА является отложение амилоидных агрегатов. В свою очередь, амилоидогенез непосредственно связан с образованием липофусцина, синтез которого контролируется тирозиназой. Таким образом, можно предположить, что ингибирование тирози-назы позволит существенно уменьшить интенсивность образования |3-амилоида [10, 11].

ВЫВОДЫ

1. Проведено исследование, направленное на оценку антитирозиназных свойств и способности подавлять агрегирование А|3 у производных 3-формилхромона. В результате установлено, что наиболее выраженной фармакологической активностью обладает 6-ацетил-замещенное 3-формилхромона (шифр БС-9), которое ингибировало активность тирозиназы в сопоставимой степени с референтом (койе-вая кислота), а также более значимо по сравнению с остальными исследуемыми объектами подавляло процесс агрегации амилоидных частиц.

2. На основании проеденного исследования можно предположить, что 6-ацетилзамещенное производное 3-формилхромона (шифр БС-9)

является перспективными объектом для дальнейшего изучения на предмет возможности использования в качестве патогенетических средств терапии болезни Альцгеймера, в основе действия которого лежит подавление ами-лоидогенеза.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Talazawa С., Thompson P.L., van Walsem A., et al. Epidemiological and economic burden of Alzheimer's disease: a systematic literature review of data across Europe and the United States of America. J Alzheimers Dis. 2015; 43(4): 1271-84. 10.3233/.TAD-141134

2. Prince AL, Winio A.,Guerchet AL, Gemma Claire Ali, Yu-Tzii Wit, Matthew A. Prim. World Alzheimer Report 2015. Hie Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. 2015.

3. Kerr J.S., Adriaanse B.A., Greig N.H. et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends Neurosci. 2017;40(3): 151-166. doi:10.1016/j.tins.2017.01.002

4. ALattson ALP. Pathways towards and away from Alzheimer's disease. Nature. 2004;'430(7000):631-639.

5. Wang R., Tang P., Wang P., Boissy R.E., Zheng H. Regulation of tyrosinase trafficking and processing by presenilins: partial loss of function by familial Alzheimer's disease mutation. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(2):-353-358. doi:10.1073/pnas.0509822102

6. Arbor S.C., La Fontaine AL, Cnmbay AL Amyloid-beta Alzheimer targets - protein processing, lipid rafts, and amyloid-beta pores. Yale J. Biol. Med. 2016; 89(1):5-21.

7. ALapnnya M.B., Nikolova R.V., ball N. Melanogenesis and antityrosinase activity of selected South african plants. Evid. Based Complement Altemat. Med. 2012; 2012: 374017. doi: 10.1155/2012/374017

8. Wang W„ Zhao C„ Zhu D„ Gong G„ Du W. Inhibition of amyloid peptide fibril formation by gold-sulfur complexes. J Inorg. Biochem. 2017; 171:1-9. doi:10.1016/j.jinorgbio.2017.02.021

9. Esquerda-Canals G., Montoliu-Gaya L.,Guell-Bosch J., Villegas S. Mouse Models of Alzheimer's Disease. J. Alzheimersio Dis. 2017; 57(4): 1171-1183. doi:10.3233/JAD-170045

10. De Biase D., Costagliola A., Pagano T.B., et al. Amyloid precursor protein, lipofuscin accumulation and expression of

autophagy markers in aged bovine brain. BMC Vet. Res. 2017; 13(1):102. doi:10.1186/sl2917-017-1028-l 11. Ohm T.G., BraakH. The pigmented subpeduncular nucleus: a neuromelanin-containing nucleus in the human pontine tegmentum. Morphology and changes in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 1988; 77(l):26-32.

doi: 10.1007/BF00688239

Поступила 21 сентября 2020 г.

INFLUENCE 3-F0RMYLCHR0M0NE DERIVATIVES IN VITRO AT AGGREGATION OF B-AMYLOID PLAGUES AND TYROSINASE ACTIVITY

© Authors, 2021 D.I. Pozdnyakov

Ph.D. (Pharm.), Head of Living System Laboratory, Associate Professor,

Department of Pharmacology with Clinical Pharmacology Course, Pyatigorsk Medical-Pharmaceutical Institute E-mail: [email protected] V.M. Rukovitsyna Post-graduate Student,

Department of Organic Chemistry, Pyatigorsk Medical-Pharmaceutical Institute E-mail: [email protected] M.V. Larskij

Ph.D. (Pharm.), Head of Pharmaceutical Chemistry Department, Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute E-mail: [email protected]

Objectives. Alzheimer's disease is one of the most common terminal forms of dementia, characterized by a complex pathogenesis with the formation of amyloid plaques in the brain structures. At the same time, one of the new and promising areas of Alzheimer's disease therapy is the influence on the amyloidogenic cascade.

Aim of the study. In vitro to evaluate the effect of ten 3-formylchromone derivatives on the formation of (3-amyloid aggregates and tyrosinase activity.

Materials and methods. The effect of the studied compounds on tyrosinase activity was evaluated using the Mapunyamethod, using L-tyrosine as a substrate and kojic acid as a reference. Aggregation of amyloid plaqueswas studied spectrophotometrically in reaction with Congo red after three and six days of incubation.

Results. Among the test-objects, the most significant antithyrosinase properties were found in the 6-acetyl substituted derivative of 3-formylchromone, whose IC50 value was comparable to kojic acid (32±1.913 pg/ml versus 30.2±1.599 pg/ml). Also, this compound most significantly inhibited the aggregation of amyloid plaques on the third day of incubation-31.0% (p<0.05) and 61% (p<0.05) - on the sixth day. It should be noted that 3-formylchromone and oxime of this compound had no significant effect on tyrosinase activity and amyloidogenesis.

Conclusion. This study suggests the relevance of further study of 6-acetyl-substituted 3-formylchronome as a potential means of pathogenetic therapy of Alzheimer's disease.

Key words: Alzheimer's disease, chromone derivatives, tyrosinase, /3-amyloid.

For citation: Pozdnyakov D.I., Rukovitsyna V.M., Larskij M.V. Influence 3-formylchromone derivatives in vitro at aggregation of B-amyloid plagues and tyrosinase activity. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2021;24(1): 11-15. https://doi.org/10.29296/25877313-2021-01-02