CC BY
43
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
с. к. БОГУС1, П. А. ГАЛЕНКО-ЯРОШЕВСКИЙ1, А. В. УВАРОВ1, К. Ф. СУЗДАЛЕВ2
влияние производного индола ss-68 на гладкомышечные клетки изолированной трахеи морских свинок
Кафедра фармакологии ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава РФ,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4; тел. (8612) 262-34-99. E-mail: kybfarma@rambler.ru;
2кафедра химии природных и высокомолекулярных соединений химического факультета ЮФУ,
Россия, 344090, г. Ростов-на-Дону, ул. Зорге, 7; тел. 8-918-856-71-00. E-mail: konsuz@gmail.com
Соединение SS-68 оказывает in vitro расслабляющее влияние на гладкие мышцы колец трахеи морской свинки. Такое действие является р2-адреноселективным, а характер его проявления зависит от способа стимуляции препарата трахеи. Продолжительность действия соединения SS-68 не так длительно (около 15 мин на восстановление тонуса после воздействия концентрации 10-7 М и около 60 мин после максимальной концентрации) по сравнению с суперселективным р2-адреномиметиком индакатерола малеатом (тонус колец трахеи после отмывания не восстанавливался). Амплитуда расслабления гладких мышц под влиянием соединения SS-68 в концентрации 10-7 М составила около 47% от амплитуды расслабления, вызываемого индакатерола малеатом.
Ключевые слова: соединение SS-68, гистамин, серотонин, ацетилхолин, изолированная трахея морских свинок, р2-адренорецепторы.
S. K. BOGUS1, P. A. GALENKO-YAROSHEVSKY1, A. V. UVAROV, K. F. SUzDALEV2
THE INFLUENCE OF INDOL DERIVATIVE SS-68 ON SMOOTH MUSCLE CELLS OF INSULATED
TRACHEA OF GUINEA PIGS
1 Department of pharmacology of the ISBEIHPE «Kuban state medical university» of the Ministry of health of the Russian Federation, Russia, 350063, Krasnodar, Sedin str., 4; tel. (8612) 262-34-99. E-mail: kybfarma@rambler.ru; 2department of chemistry of natural and macromolecular compounds of chemistry faculty of the SFU, Russia, 344090, Rostov-on-Don, Zorge str., 7; tel. 8-918-856-71-00. E-mail: konsuz@gmail.com
The substance SS-68 relaxes smooth muscles cells of tracheal rings of guinea pig in vitro. Such effect is selective for p2-adrenergic receptors, and type of this influence depends on method of stimulation on insulated trachea. The duration of effect substance SS-68 is not so long (about 15 min for toning after this exposure in concentration 10-7 M or about 60 min after maximum concentration in compare to super selective p2-adrenomimetic substance indacaterol maleate (the tonus of tracheal rings after washing away the substance SS-68 was not resorted. An amplitude of relaxation smooth-muscle cells on influence of the substance SS-68 in concentration 10-7 M is about 47% of the amplitude of relaxation witch has been maded by indacaterol maleate.
Key words: substance SS-68, histamine, serotonin, acetylcholine, insulated trachea of guinea pigs, p2-adrenergic receptors.
Введение Известно, что одним из побочных явлений
В ранее проведенных нами исследовани- р-адреноблокаторов является бронхоконстриктор-
ях было показано, что производное индола с ное действие, однако отдельные представители
лабораторным шифром SS-68 обладает вы- этой группы веществ, например целипролол, наря-
раженным антиаритмическим [3] и антианги- ду с р1-адреноблокирующим эффектом могут про-
нальным [2] действием, а также проявляет а- и являть р2-адреностимулирующие свойства, оказы-
р-адреноблокирующие свойства [1]. вая при этом бронхолитическое действие [4].
Цель исследования - выявление возможного ß2-адреномиметического действия соединения SS-68 в условиях моделирования бронхоспазма.
Материалы и методы исследования
Для проведения экспериментов была избрана трахея морских свинок, которая является наиболее адекватной моделью исследования сократительной активности мускулатуры дыхательных путей [6].
Животные подвергались эвтаназии путём дека-питации с последующим обескровливанием. Выделенная трахея переносилась в буферный раствор Кребса следующего состава (в мМ): 133 NaCl, 16,3 NaHCO3, 4,7 KCl, 1,05 MgCl2 х 6Н2О, 1,38 NaH2PO4, 2,75 CaCl2, 7,82 глюкоза, 10 HEP ES (рН 7,4), при комнатной температуре. Кольцевые препараты с гладкомышечными полосами были получены в процессе препарирования трахеи под визуальным микроскопическим (МБС-2) контролем.
Полученные кольца трахеи размещались на крючках в проточной термостатированной при 35° С камере. Для получения оптимальных условий сокращения препаратам придавалось изначальное натяжение, составляющее около 2 г. Предварительно препараты на протяжении 1 часа подвергались подготовительной «раскачке» в виде 3 циклов сокращения/расслабления, вызванных гистамином, серотонином или ацетилхолином.
Регистрацию сократительной активности изолированных колец трахеи производили при помощи емкостных датчиков напряжения («Danish Myo Technology», «Aarhus», Дания), сигнал от которых усиливался и фильтровался, далее преобразовывался в аналогово-цифровом преобразователе «LabTrax 4/16», записывался и обрабатывался при помощи компьютерной программы «DataTrax2» («World Precision Instruments, Inc.», США).
Бронхолитическое действие оценивали по степени расслабления предварительно сокращенных препаратов, выраженной в процентах. В качестве
стимулирующих агентов использовались гиста-мин (30 мкМ), серотонин (10 мкМ) и ацетилхолин (10 мкМ). В качестве дополнительных подтверждений участия в2-адренорецепторов в реализации бронхорасслабляющего действия исследуемого вещества были применены современные суперселективные антагонист (бутоксамин) и агонист (индакатерола малеат) в2-адренорецепторов в концентрациях 0,1 и 1 мкМ.
В исследованиях были использованы ацетил-холин, бутоксамин, серотонин, гистамин, HEPES (все «Sigma Chemicals Co. St. Lois, MO», США), индакатерола малеат («Novartis International AG», Швейцария).
Полученные данные подвергались статистической обработке при помощи программ «Origin 6.1» («OriginLab Corporation», США) и «EXEL 5.0» (Microsoft, США).
Результаты и обсуждение
Существует множество способов стимуляции гладких мышц дыхательных путей в зависимости от целей исследований и поставленных задач. Наши испытания соединения SS-68 были проведены в трех сериях опытов с различными видами стимуляции (гистамином, серотонином, ацетилхолином). Такой выбор обусловлен наиболее частым повышением уровня этих агентов при развитии патологических состояний, сопровождающихся бронхоспазмом.
Результаты исследований представлены в таблице и на рисунке.
Гистаминовая стимуляция. На фоне сокращения, вызванного аппликацией 30 мкМ гис-тамина, ступенчатое повышение концентрации соединения SS-68 в концентрациях 10-9-10"5 М приводило к последовательному расслаблению препаратов трахеи. Следует отметить проявление двухфазного характера релаксирующего влияния, а именно: быстрое расслабление с последующим частичным восстановлением тонуса. Такая реакция начинала регистрироваться уже
Влияние соединения SS-68 на тонус гладкомышечных клеток трахеи морской свинки, предварительно сокращенных гистамином, серотонином и ацетилхолином
Констриктор Концентрация соединения SS-68, М
10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
Гистамин, 30 мкМ 10,21±4,110 20,28±4,256 33,215±4,190 37,23±3,573 53,01±4,380
Серотонин, 10 мкМ 20,17±3,190 31,18±3,120 41,04±2,330 44,45±4,250 73,40±2,960
Ацетилхолин, 10 мкМ 33,2±4,300 37,11±3,359 38,60±3,420 18,11±4,493 21,11±4,850
Примечание: результаты представлены как % расслабления гладкомышечных клеток от уровня их сокращения, вызванного констриктором.
Кривые «доза - эффект» для релаксирующего действия соединения SS-68, полученные на изолированных препаратах гладких мышц колец трахеи морских свинок на фоне различных способов
их предварительной активации
во время воздействия соединения SS-68 в концентрации 10-8 М, возрастала с увеличением его концентрации и может быть истолкована как проявление феномена десенситизации.
Стимуляция серотонином. Реакции гладко-мышечных клеток колец трахеи на расслабляющее влияние соединения SS-68 на фоне стимуляции серотонином (10 мкМ) были наиболее показательными (и наиболее легко интерпретируемыми).
Ацетилхолиновое сокращение. Расслабление колец трахеи под влиянием соединения SS-68 на фоне ацетилхолиновой (10 мкМ) стимуляции было наиболее любопытным. Как и в случае с гистамином, реакция расслабления была двухфазной (сильное расслабление/восстановление), но степень восстановления тонуса, следующего за расслаблением, зачастую превышала базовый уровень стимуляции.
Для того чтобы убедиться в возможности участия в2-адренорецепторов в процессе расслабления и дать предварительную сравнительную оценку соединению SS-68, мы применили суперселективный р2-адреномиметик длительного действия индакатерола малеат в концентрациях 10-7 и 10-6 М.
Далее для подтверждения влияния соединения SS-68 на в2-адренорецепторы мы использовали селективный р2-адреноблокатор бутоксамин в концентрациях 0,1 и 1 мкМ.
Установлено, что релаксирующее действие соединения SS-68 на фоне блокады р2-адренорецепторов бутоксамином и стимуляции препаратов трахеи гистамином или ацетилхоли-
ном не регистрировалось. Полученные в этой серии опытов данные свидетельствуют о том, что релаксирующее влияние соединения SS-68 осуществляется посредством стимуляции ß2-адрено-рецепторов.
Значения pD2, рассчитанные для гистамина и серотонина, составили 6,71±0,17 и 7,32±0,21 М соответственно. Для ацетилхолинового сокращения pD2 не рассчитывалась.
В результате проведенных нами экспериментов были получены данные, представляющие как научный, так и практический интерес. Релаксирующее действие соединения SS-68 подтвердилось в трех сериях опытов с различными способами стимуляции колец трахеи морских свинок и оказалось дозозависимым. Характер проявления расслабляющего влияния соединения SS-68 был различным в каждой конкретной серии, что связано, очевидно, с различными механизмами активации сократительного аппарата гладких мышц. Так, в случае ацетилхолинового сокращения снижение тонуса в ответ на соединение SS-68 быстро сменялось восстановлением прежнего уровня или даже превышало его. Известно, что конформаци-онные изменения М3-холинорецепторов, посредством которых передается действие ацетилхолина в гладкомышечных клетках дыхательных путей, приводят к активации G-белков. Активированная а-субъединица гетеротримера Gq стимулирует мембраносвязанную фосфолипазу С, гидролизи-рующую фосфатидилинозитол 4,5-бифосфат на инозитол 1,4,5-трифосфат (IP3) и диацилглицерол (DAG). IP3 путь приводит к освобождению Са2+ из внутриклеточных запасников. Существуют также
сведения о возможности прямой стимуляции Са2+ каналов L-типа активированными М3-холинорецеп-торами, что также приводит к повышению уровня внутриклеточного кальция. DAG вызывает активацию протеинкиназы С, а ряд ее изоформ обладает способностью прямо фосфорилировать актин-свя-зывающие белки кальпонин, облегчая тем самым актомиозиновое взаимодействие или же влияя на актомиозиновое связывание через киназу легкой цепи миозина [7, 8]. Соединение SS-68, очевидно, оказывает влияние посредством комплекса реакций, связанных с ß2-адренорецепторами, а определяющими факторами расслабления гладких мышц трахеи являются его влияние на уровень внутриклеточного Са2+ и фосфорилирования кина-зы легкой цепи миозина.
Серотониновое сокращение стимулируется активацией 5-HT2a рецепторов, которые также считаются сопряженными с Gq-белком, и дальнейшим гидролизом фосфоинозитидного комплекса. Однако именно для гладкомышечных клеток трахеи морской свинки были показаны отсутствие связи 5-HT2a с гидролизом 4,5-бифосфата и непосредственное участие активированных 5-HT2A как в повышении внутриклеточного уровня Са2+, так и в стимуляции протеинкиназы С [7, 9]. Реакция на соединение SS-68 у гладкомышечных клеток колец трахеи, стимулированных серотонином, была наиболее ярко выраженной, а ее характер может быть следствием отсутствия дополнительных путей регуляции сокращения, кроме как общих для ß2-адрено- и 5-НТ2А-рецепторных структур.
Гистаминовая стимуляция опосредуется влиянием на Н1-рецепторы, являющиеся также связанными с системой Gq-белка, и дальнейшим расщеплением 4,5-бифосфата [7]. Характер действия соединения SS-68 на серотониновое сокращение в определенной степени схож с реакцией при аце-тилхолиновой стимуляции, что объясняется общностью путей стимуляции, но в то же время он не так ярко выражен. Причиной этого может быть существование в гладких мышцах дыхательных путей гистаминовых Н3-рецепторов [5], стимуляция которых оказывает расслабляющее влияние.
Следует упомянуть наличие в гладкомышеч-ных клетках дыхательных путей киназы G-про-теинсвязанного рецептора, кратковременная стимуляция которой может приводить к эффекту, схожему с десенсибилизацией и к преходящему расслаблению.
Подтверждением влияния соединения SS-68 непосредственно на ß2-адренорецепторы послужило устранение каких-либо проявлений расслабления препаратов трахеи после воздействия селективного блокатора ß2-адренорецепторов бу-токсамина даже в малой концентрации (10-7 М).
Таким образом, соединение SS-68 оказывает in vitro расслабляющее влияние на гладкие мышцы
трахеи морской свинки. Такое действие является в2-адреноселективным, а характер его проявления зависит от способа стимуляции трахеи. Продолжительность действия соединения SS-68 не столь выражена (около 15 мин на восстановление тонуса после воздействия концентрации 10-7 М и около 60 мин после максимальной концентрации) по сравнению с суперселективным р2-адреномиметиком индакатерола малеатом (тонус колец трахеи после отмывания не восстанавливался). Амплитуда расслабления гладких мышц колец трахеи под влиянием соединения SS-68 в концентрации 10-7 М составила около 47% от амплитуды расслабления, вызываемого индакатерола малеатом.
Производное индола соединение SS-68 синтезировано в рамках государственного задания Министерства образования и науки Российской Федерации № 4.129.2014/К.
ЛИТЕРАТУРА
1. Богус С. К., Галенко-Ярошевский П. А., Духанин А. С., ШимановскийН. Л. Влияние производного индола SS-68, обладающего антиаритмическими и антиангинальными свойствами, на а,-, р,- и Р2-адренорецепторы // Новые технологии. - Майкоп, 2012. - Вып. 4. - С. 232-235.
2. Богус С. К., Галенко-Ярошевский П. А. Исследование антиангинальных свойств производного индола SS-68 // Новые технологии. - Майкоп, 2012. - Вып. 4. - С. 265-269.
3. Богус С. К., Галенко-Ярошевский П. А., Суздалев К. Ф. Антиаритмическая активность производного индола SS-68 при желудочковых и предсердных формах нарушений ритма сердца // Новые технологии. - Майкоп, 2012. - Вып. 4. - С. 274-279.
4. Машковский М. Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна: издатель Умеренков, 2010. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - 1216 с.
5. Cardell L. O., Edvinsson L. Characterizationof histamine receptors in guinea-pig lung: evidence for relaxant histamine H3 receptors in the trachea // Br. j. pharmacol. - 1994. -Vol. 111 (2). - P. 445-454.
6. Muccitelli R. M., Tucker S. S., Hay D. W. et al. Is the guinea pig trachea a good in vitro model of human large and central airways? Comparison on leukotriene-, methacholine-, histamine-and antigen-induced contractions // J. pharmacol. exp. ther. -1987. - Vol. 243 (2). - P. 467-473.
7. Peter J. Barnes, K. Fan Chung, Clive P. Page. Inflammatory mediators of asthma: An update // Pharmacological reviews. -1998 - Vol. 50 (4). - P. 515-582.
8. Roffel A. F., Meurs H., Elzinga C. R., Zaagsma J. Characterization of the muscarinic receptor subtype involved in phosphoinositide methabolism in bovine tracheal smooth muscle // Br. j. pharmacol. - 1990. - Vol. 99. - P. 293-296.
9. Watts S. W., Cox D. A., Johnson B. G. et al. Contractile serotonin-2A receptor signal transductionin guinea pig trachea: importance of protein kinase C and extracellular calcium but not phosphoinositide hydrolysis // J. pharmacol. exp. ther. - 1994. -Vol. 271 (2). - P. 832-844.
Поступила 25.05.2015
