CC BY
81
УДК 577
Авдеева Ю.А., Медведева О.А., Королев В.А., Калуцкий А.П.
Курский государственный медицинский университет Е-mail: juliana16.12@mail.ru ; olgafrida@rambler.ru ; medecol1@yandex.ru
ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИКОВ БАКТИСТАТИН И НОРМОБАКТ НА СОСТАВ МИКРОБИОЦЕНОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБИОЗЕ
Изменение качественного и количественного состава микробиоценоза толстого кишечника -дисбиоз является фоновым состоянием для развития большого спектра заболеваний, а также -фактором ослабления иммунной системы организма.
Изучено влияние лекарственных препаратов с выраженным пробиотическим эффектом бак-тистатин и нормобакт на состав микрофлоры толстого кишечника в условиях экспериментального гентамицинового дисбиоза. При коррекции гентамицинового дисбиоза пробиотиками бактистатин и нормобакт отмечено изменение количественного и качественного состава представителей му-козного микробиоценоза толстого кишечника. При этом применение бактиститина и нормобакта приводило к нормализации содержания 12 из 13 и 9 из 13 микроорганизмов, соответственно, определяемых в составе мукозной микрофлоры толстого кишечника. Более выраженный эффект коррекции количественного и качественного состава кишечной микрофлоры наблюдается при применении препарата бактистатин.
По нашему мнению, выявленные различия в нормализации микробиоты толстого кишечника, связаны с видовым составом микроорганизмов использованных пробиотиков. Это позволяет рекомендовать в клинической практике применение данных препаратов для избирательной коррекции дисбиоза после исследования качественного и количественного состава микробиоценоза толстого кишечника.
Ключевые слова: мукозная микрофлора толстого кишечника, дисбиоз, бактистатин, нормо-бакт.
Введение
Нормальную микрофлору организма человека в настоящее время рассматривают как первичную мишень приложения любого внешнего воздействия, попадающего в организм человека. Нормофлора вовлекается в переработку, трансформацию естественных и чужеродных субстанций, как орган, на котором происходит первичная адсорбция и через который транс-лоцируются полезные и потенциально вредные агенты. Нормальная микрофлора - тот барьер, после прорыва которого включаются неспецифические механизмы защиты [1], [2].
Изменение качественного и количественного состава микробиоценоза толстого кишечника - дисбиоз является фоновым состоянием для развития большого спектра заболеваний, а также - фактором ослабления иммунной системы организма [6], [7].
Среди основных причин развития дисбио-за кишечника выделяют стрессы, неблагоприятное воздействие окружающей среды, прием лекарственных препаратов (антибактериальных, гормональных, цитостатиков), заболевания га-строинтестинального тракта, нерациональное питание, нарушения иммунитета, оперативные вмешательства [3]-[5].
Терапия больных с дисбиозом включает лечение основного заболевания (этиологическое лечение) и восстановление нормального состава кишечных бактерий. Для целенаправленной коррекции микробиоты кишечника применяют про-, пребиотики и синбиотические препараты
[3], [8].
Пробиотики - это живые микроорганизмы, которые оказывают прямое антагонистическое действие на патогенную и условно-патогенную микрофлору. Они стимулируют рост облигат-ной микрофлоры, повышают колонизационную резистентность слизистых оболочек, способствуют регенерации, росту кишечного эпителия и нормализации функций слизистой оболочки кишечника, улучшению пищеварения и синтеза витаминов [5], [9], [10].
Цель исследования: изучить влияние пробиотиков бактистатин и нормобакт на качественный и количественный состав мукозной микрофлоры толстого кишечника при экспериментальном дисбиозе у мышей.
Материалы и методы
Исследование проведено на 80 мышах линии BALB/c массой 18-20 грамм, которых содержали на обычном пищевом рационе в усло-
виях вивария. Все животные были разделены на четыре группы по 20 особей в каждой. Первая (контрольная) группа состояла из интактных мышей. Во вторую группу входили животные, у которых моделировали лекарственный дисбиоз путём внутрибрюшинного введения в течение 5 дней раствора гентамицина в концентрации 80 мкг/мл в пересчёте на массу тела животного (0,02 мл) [11]. Мышам третьей группы по окончанию введения антибиотика интрагастрально вводили пробиотик бактистатин по 0,02 мл в течение 21 дня. Мыши четвёртой группы после формирования дисбиоза интрагастрально получали пробиотик нормобакт по 0,06 мл в течение 21 дня. Исследования проводили с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).
У мышей контрольной группы, а также экспериментальных групп после окончания введения гентамицина (вторая группа) или про-биотиков (третья и четвёртая группы) производили изучение состава мукозной микрофлоры толстого кишечника. Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводилось по методике Л.И. Кафарской и В.М. Коршунова [12]. Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника освобождались от химуса и взвешивались в асептических условиях. После этого материал помещался в стерильный раствор фосфатного буфера в соотношении 1:10 и выдерживался в нём 2 часа для разжижения муцина. Затем готовились разведения материала до концентраций 10-2-10-4. По 0,1 мл каждого разведения взвеси засевали газоном на поверхность питательных сред (Эндо, Сабуро, SSA-агар, ЦПХ-агар, кровяной агар, желточно-солевой агар, висмут-сульфит агар, лактоагар, бифидоагар) и инкубировали при температуре 37 0С в аэробных и анаэробных условиях. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью микробиологического анализатора «Multiskan-Ascent» с использованием тест-систем ЭНТЕРОтест-16, СТАФИтест-16, Стрептотест-16, Эн-КОККУСтест-16; API 50 CHL - для идентификации лактобацилл и би-фидобактерий. Количество микроорганизмов в 1 грамме материала рассчитывали исходя из
числа выросших колоний микроорганизмов -колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве из максимального разведения, где отмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объём посевного материала. Для расчёта использовали формулу:
К=Е/к-у-п,
где К - колониеобразующая единица, Е - общее количество бактерий, к - количество внесённого материала, v - количество чашек Петри, n - разведение. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали в lg КОЕ/г массы биологического материала [13] [15].
Статистическую значимость различий средних величин вычисляли по t-критерию Стьюдента после проверки нормальности распределения изучаемых параметров с помощью программы Statistica 6.0 [16].
Результаты исследования
При исследовании количественного и качественного состава мукозной микрофлоры толстого кишечника интактных животных установлено, что в ее составе доминировали бифидобактерии lgKOE=(8,10±1,05), кишечные палочки c нормальной ферментативной активностью lgKOE=(6,58±0,75) и лактобактерии lg КОЕ= (6,48±0,66) (таблица 1).
Кроме того, в муциновом слое толстого кишечника были идентифицированы представители рода Salmonella lgKOE=(5,07±0,63), бактерии родов Enterococcus lgKOE=(3,85±0,90) и Citrobacter lgKOE=(3,74±0,72), кишечные палочки со сниженной ферментативной активностью lgKOE=(3,48±0,57) и бактерии рода Enterobacter lgKOE=(3,01±0,47). Несколько ниже была численность коагулазоотрицатель-ных стафилококков lgKOE=(2,54±0,67), грибов рода Candida lgKOE=(2,38±0,49) и бактерий рода Streptococcus lgKOE=(2,14±0,55). Следует отметить, что в составе мукозной микрофлоры интактных мышей не выявлены золотистый стафилококк и микроорганизмы рода Proteus.
Введение гентамицина привело к уменьшению численности доминантных представителей микрофлоры здоровых животных. Содержание бифидобактерий снизилось в 1,7 раза, а лак-тобактерий и кишечных палочек с нормаль-
Авдеева Ю.А. и др.
Влияние пробиотиков бактистатини нормобактна состав..
ной ферментативной активностью - в 1,8 раза и в 2,1 раза, соответственно. При этом число стрептококков увеличилось в 3,1 раза, коагу-лазотрицательных стафилококков - в 2,3 раза, микроорганизмов рода Enterobacter - в 1,7 раза по отношению к значениям определяемого показателя контрольной группы. В составе кишечного биоценоза данной экспериментальной группы не выявлены микроорганизмы родов Citrobacter и Enterococcus, тогда как отмечалось появление золотистых стафилококков и бактерий рода Proteus (lgKOE=(5,87±1,48) и lgKOE=(3,12±0,45), соответственно). На фоне применения гентамицина в составе микробиоценоза толстого кишечника мышей количество грибов рода Candida увеличилось в 2,3 раза.
Применение бактистатина оказало положительное воздействие на количественное содержание 12 из 13 микроорганизмов, определяемых в составе мукозной микрофлоры толстого кишечника. При этом использование пробиотика привело к увеличению численности бифидобак-терий, лактобактерий, эшерихий с нормальной ферментативной активностью, восстановлению качественных и количественных характеристик представителей родов Citrobacter и Enterococcus.
Количественные значения определяемого показателя для сальмонелл, стрептококков, коагула-зоотрицательных стафилококков и грибов рода Candida на фоне терапии достоверно снизились по отношению к группе животных с дисбиозом. При этом в составе мукозной микрофлоры не выявлены золотистый стафилококк и микроорганизмы рода Proteus.
В группе животных, получавших пробио-тик нормобакт, достоверно изменились значения lgKOE 9 из 13 микроорганизмов, определяемых в составе мукозной микрофлоры толстого кишечника. Количество эшерихий с нормальной ферментативной активностью и лактобактерий увеличилось и достигло достоверных значений группы интактных животных, а содержание стрептококков и коагулазоотрица-тельных стафилококков снизилось. При этом в составе мукозной микрофлоры не выявлены золотистый стафилококк, микроорганизмы родов Proteus и Enterococcus. Микроорганизмы рода Citrobacter, отсутствовавшие в группе дисбиоз, определялись в количестве lgKOE=(3,14±0,72), что является сопоставимым результатом со значением определяемого показателя контрольной группы. Достоверных изменений содержания
Таблица 1. Влияние пробиотиков бактистатин и нормобакт на состав мукозной микрофлоры толстого
кишечника мышей
Выделенные микроорганизмы Количество микроорганизмов, lg KOE/г (M±m)
Группы животных
1 2 3 4
Контроль (интактные мыши) Дисбиоз Применение бактистатина Применение нормобакта
E. coli c нормальной ферментативной активностью 6,58±0,75 3,18±0,46*** 6,63±0,58ххх 6,35±0,73ххх
E. coli m сниженной ферментативной активностью 3,48±0,57 5,22±0,73 3,76±0,46 3,31±0,90
Enterobacter spp. 3,01±0,47 5,08±0,48** 5,85±0,78 5,61±0,78
Salmonella spp. 5,07±0,63 6,14±0,76 3,04±0,68хх 4,79±0,69
Citrobacter spp. 3,74±0,72 0±0*** 4,27±0,68ххх 3,14±0,72ххх
Enterococcus spp. 3,85±0,90 0±0*** 5,85±0,71ххх 0±0ххх
Streptococcus spp. 2,14±0,55 6,64±0,78*** 3,21±0,51ххх 4,34±0,68х
Staphylococcus (коагулазоотрицательные) 2,54±0,67 5,87±0,94** 3,14±0,66х 2,90±0,64х
Staphylococcus aureus 0 5,87±1,48*** 0±0ххх 0±0ххх
Proteus spp. 0 3,12±0,45*** 0±0ххх 0±0ххх
Candida spp. 2,38±0,49 5,43±0,90** 1,25±0,55ххх 2,34±0,75хх
Lactobacillus spp. 6,48±0,66 3,60±0,82* 6,43±0,85х 6,81±0,79хх
Bifidobacterium spp. 8,10±1,05 4,76±0,94* 8,60±1,02хх 7,78±1,22
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой, ** - р<0,01 по сравнению с контрольной группой, *** - р<0,001 по сравнению с контрольной группой; х - р<0,05 по сравнению с группой дисбиоз, хх - р<0,01 по сравнению с группой дис-биоз, ххх - р<0,001 по сравнению с группой дисбиоз.
эшерихий со сниженной ферментативной активностью, бактерий рода Enterobacter, сальмонелл и бифидобактерий не выявлено.
Обсуждение
При коррекции гентамицинового дисбио-за пробиотиками бактистатин и нормобакт отмечено изменение количественного и качественного состава представителей мукозно-го микробиоценоза толстого кишечника. При этом применение бактиститина и нормобакта приводило к нормализации содержания 12 из 13 и 9 из 13 микроорганизмов, соответственно, определяемых в составе мукозной микрофлоры
толстого кишечника. Более выраженный эффект коррекции количественного и качественного состава кишечной микрофлоры наблюдается при применении препарата бактистатин.
По нашему мнению, выявленные различия в нормализации микробиоты толстого кишечника, связаны с видовым составом микроорганизмов использованных пробиотиков. Это позволяет рекомендовать в клинической практике применение данных препаратов для избирательной коррекции дисбиоза после исследования качественного и количественного состава микробиоценоза толстого кишечника.
8.06.2016
Список литературы:
1. Крамарь В.С., Савченко Т.Н. и др. Микроэкология человека, коррекция дисбактериоза // Вестник ВолГМУ 2010. Выпуск 4 (36). С. 73-76.
2. Круглякова Л.В., Нарышкина С.В. и др. Клинико-лабораторные особенности хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с дисбактериозом кишечника // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2015. Выпуск 55. С. 27-34.
3. Костюкевич О.И. Влияние кишечной микрофлоры на здоровье человека. От патогенеза к современным методам коррекции дисбиоза // Русский медицинский журнал. 2011. Т. 19, №5. С. 304-308.
4. Минушкин О.Н. Дисбактериоз кишечника: современное состояние проблемы // Consilium medicum. 2009. Т.9, №7. С.59-64.
5. Яковенко Э.П., Иванов А.Н., Казарина А.В и соавт. Нарушение нормального состава кишечных бактерий: клиническое значение и вопросы терапии // Русский медицинский журнал. 2008. Т.10, №2. С. 41-46.
6. Сулима М.В., Солуянова И.П., Круглякова Л. В. Нарушение нормального состава кишечной микрофлоры при заболеваниях органа пищеварения (учебное пособие). - Благовещенск, 2014. - 104 с.
7. Агейченко А.В., Калуцкий П.В., Медведева О.А., Королев В.А. Изменение состава микробиоценоза толстого кишечника и антиоксидантных свойств колоноцитов в условиях экспериментального дисбиоза и профилактики эмоксипином // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии. 2015. №4. С. 84-88.
8. Шульпекова Ю.О. Патологические изменения состава кишечной микрофлоры: клинические варианты и возможности лечения // Справочник поликлинического врача. 2007. №12. С. 33-38.
9. Лоранская И.Д., Лаврентьева О.А. Функциональный анализ микробиоценоза желудочно-кишечного тракта // Русский медицинский журнал. Т. 19, 2011. С. 1057-1060.
10. Лазарева Т.С., Жвания Ф. Ф. Желудочно-кишечный тракт, микрофлора и иммунитет // Педиатрическая фармакология. 2009. Т.6, №1. С 46-50.
11. Кашкин К.П., Караев З.О. Иммунная реактивность организма и антибиотическая терапия. - Л.: Медицина, 1984. - 200 с.
12. Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Современные методы оценки качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища // Журнал микробиологии. 2002. №4. С 72-78.
13. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника крыс // Журнал микробиологии. 2005. №3. С 61-65.
14. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс // Журнал микробиологии. 2005. №6. С 3-7.
15. Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Зверев В.В., Воробьев А.А. Микробиоценоз пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс с индуцированным дисбиозом // Журнал микробиологии. 2007. №3. С 57-60.
16. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica. - М.: МедиаСфера, 2006. - 312 с.
Сведения об авторах:
Авдеева Юлиана Александровна, ООО «Курскхимволокно», аспирант кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета, е-mail: juliana16.12@mail.ru;
305008 г Курск, ул. Верхняя Луговая, 424.
Медведева Ольга Анатольевна, доцент кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии Курского государственного медицинского университета, доктор биологических наук, доцент
E-mail: olgafrida@rambler.ru;
Королев Владимир Анатольевич, завуч кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, доктор биологических наук, доцент, профессор
E-mail: medecol1@yandex.ru Калуцкий Алексей Павлович, аспирант кафедры хирургических болезней Курского государственного медицинского университета, е-mail: lexxx91@mail.ru 305041, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3
