Влияние природы подложки на механизм сорбции пероксидазы редьки черной Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ

Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 25 (64). 2012. № 4. С. 239-247.

УДК 577.152.193+544.723.23

ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ ПОДЛОЖКИ НА МЕХАНИЗМ СОРБЦИИ ПЕРОКСИДАЗЫ РЕДЬКИ ЧЕРНОЙ

Вяткина О.В.

Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, Симферополь, Украина

E-mail: oksana_vyatkina@list. ru

В статье приведены результаты сорбционных исследований в системах бентонит-пероксидаза, силикагель-пероксидаза. Установлены количественные параметры сорбционных процессов и механизм связывания фермент-подложка. Показано каталитическое действие полученных материалов. Ключевые слова: пероксидаза, редька черная, сорбция, бентонит, силикагель.

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день ферменты составляют неотъемлемую часть современных промышленных технологий, широко применяются в аналитических и медицинских целях. Существенным ограничителем масштабного использования ферментов является высокая цена коммерческих препаратов, что обусловлено сложностью их извлечения из природного сырья и очистки.

Обычно извлечение ферментов осуществляется с помощью молекулярных сит. Этот процесс в ряде случаев долгий, малоэффективный и дорогой. Практически не используются методы концентрирования и извлечения ферментов из природных материалов с использованием неорганических сорбентов. Это связано с тем, что большинство известных неорганических сорбентов либо вообще не концентрируют ферменты, либо обладает по отношению к ферментам небольшой емкостью [1-3]. Однако исследования в данном направлении не являются на сегодняшний день исчерпывающими из-за большого разнообразия структур и как следствие вариабельности сорбционных свойств природных и синтетических минеральных сорбентов. Поэтому целью работы являлось изучение механизмов сорбции пероксидазы редьки черной на природном бентоните и на силикагелях, синтезированных в кислой среде.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлась пероксидаза корнеплодов редьки черной, экстрагированная фосфатным буфером (рН=6,8) из измельченного растительного сырья [4]. В качестве подложки для иммобилизации фермента были использованы силикагели, синтезированные из силикатного клея при взаимодействии с 6М и 3М соляной кислотой. Далее маркированные как (СГ-А и СГ-Б), и природный бентонит Асканит (Грузия). Количество активных кислотных и основных гидроксилов (адсорбционных центров) на поверхности подложек определяли методом потенциометрического титрования растворами NaOH и HCl. Иммобилизацию ферментного препарата, выделенного из корнеплода редьки черной, на подложках проводили методом сорбции. Сорбцию фермента изучали в статических условиях при температуре 25°С, рН=6,8. Объёмную концентрацию ферментного препарата варьировал от 5 до 50%, время эксперимента варьировали от 1/6 до 24 часов. Остаточные концентрации фермента контролировали фотоколориметрически при ^=400 нм. После чего рассчитывали степень связывания фермента с твёрдой фазой N:

N (%) = D ~ D кон . 100 % ; (1)

D нач

Где: N (%) - степень связывания фермента на подложке,

DHm., Dkoh.- начальная и конечная оптические плотности.

Для изучения обратимости сорбции фермента фермента в водных системах брали навески высушенного силикагеля, модифицированного пероксидазой, и заливали их дистиллированной водой. Через сутки определяли концентрацию фермента в водной фазе. Для уточнения природы активных центров поверхности носителей и механизмов связывания фермента с ними использовали метод ИК-спектроскопии (ИКС).

Определение средней пероксидазной активности нативных и иммобилизованных ферментных препаратов проводили в системах 1-3 при pH=6,8, t=25°C, т=10 мин.

Система (1): С(Н2О2)= 0,02 моль/л, С(С6ЩОН)2) = 0,0001-0,001 моль/л, V (ферментного препарата)=5 мл.

Система (2): С(Н2О2)= 0,02 моль/л, С(С6Н4(ОН)2) = 0,0001-0,001 моль/л, иммобилизованная на силикагеле пероксидаза m=1 г.

Система (3): С(Н2О2)= 0,02 моль/л, С(С6ЩОН)2) = 0,0001 - 0,001 моль/л, иммобилизованная на бентоните пероксидаза m=1 г.

Активность определяли по начальной скорости реакции пероксидазного окисления гидрохинона (т=10 мин). Изменение концентрации гидрохинона в исследуемых системах контролировали фотоколориметрическим методом по реакции с о-фенантролином в присутствии ионов Fe3+ [5]. За единицу активности принимали количество окисленного субстрата (мкмоль), катализированное 1 мл ферментного препарата в течение 1 мин.

Активность рассчитывали по формуле (2):

А (активн0сть)= С(гидрохинона) • V(реакционной • смеси, л) ; (2)

V(фермента, мл) • ^мин)

. мкмоль(субстрата)

1--=1е.а.

мл(фермент) • мин

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оба полученных образца ксерогелей кремниевой кислоты имели белый цвет и были непрозрачны. Установлено, что с уменьшением концентрации растворов, соляной кислоты ксерогели получаются более хрупкими, что свидетельствует о различии их структуры. Результаты ИКС-исследования силикагеля (СГ-А) представлены на рис. 2 и в табл. 1.

Рис. 2. ИК-спектр силикагеля СГ-А.

Таблица 1

Положение полос поглощения в ИК-спектре силикагеля и силикагеля с

Частота колебаний (см-1) Тип колебаний Атомная группа

силикагель силикагель+пероксидаза

3720 3720 v -ОН-основная (Н-связанная)

3520 v -ОН-кислотная (Н-связанная)

3560 3560 v Н2О (хемосорбированная)

3350 3350 v Н2О (адс)

3280 v К-Н (амид А)

3067 5

1670-1640 5 Н2О (адс)

1630 v С=О (амид I)

1521 5 К-Н в плоскости (амид II)

1075 1080 vas 81-0-81

950 950 v 81-ОН

800 800 обертон 2vs 81-0

На ИК-спектре силикагеля СГ-А были идентифицированы полосы, отвечающие следующим видам колебаний поверхностных гидроксилов: 3720 см-1 - и-колебания ОН-основная (Н-связанная), 3520 см-1 — и-колебания 81-0-И -кислотная (Н-связанная). Наличие в спектре колебаний соответствующих основным гидроксилам закономерно, так как синтез силикагелей проводили при рН ниже изоэлектрической точки (ИЭТ), что сделало возможной перезарядку поверхности материала. Результаты определения количества активных силанольных групп и других сорбционных центров на поверхности ксерогелей представлены в табл. 2.

Таблица 2

Количество активных ОН-групп и другие характеристики поверхности

СГ-А СГ-Б

п(-ОН), ммоль-экв/г

потенциометрическое титрование NaOH (0,1 М) 0,10±0,007 0,08±0,004

потенциометрическое титрование НС1 (0,1 М) 0,06±0,002 0,10±0,001

Таким образом было установлено, что понижение величины рН при синтезе в области ниже ИЭТ силикагеля приводит к увеличению количества сорбционных центров, представленных кислотными гидроксилами и уменьшению количества основных гидроксилов поверхности.

Результаты, полученные при исследовании динамики процесса сорбции пероксидазы из фосфатно-буферных растворов с объёмной концентрацией пероксидазы 20% на силикагеле показали (рис. 3), что максимальная степень связывания фермента с подложкой наблюдается при времени контакта 2 часа и составляет 62%. Ранее было установлено, что в системе с бентонитом за 1,5 часа с поверхностью связывается 70% фермента.

70 -eso -SO -JO -

Рис. 3. Динамика сорбции пероксидазы на силикагеле из фосфатно-буферного раствора (Соб=20%, V=20 мл, т(СГ-А)=0,5г)

Проводить сорбцию более 2 часов оказалось не целесообразно, так как в системе на свету образуются неактивные продукты взаимодействия компонентов фосфатно-буферных растворов между собой, с компонентами подложки и кислородом, о чём свидетельствует окрашивание раствора в бурый цвет.

При изучении сорбции пероксидазы на силикагеле основную проблему составляла трудность определения массовых концентраций фермента в фосфатно-буферных экстрактах. Его количество оценивали по поглощению растворов при ^=400 нм, характерному для гем-содержащих белков. Поэтому для выявления характера сорбции строили графики, представленные на рис. 4.

0,16 -1

0,14 -

0,12 -

0,1 -

0.08 -

0.06 -

0.04 -

0.02 -

О -■ О

Рис. 4. Адсорбция пероксидазы редьки черной из фосфатно-буферных растворов на силикагеле: I - СГ-А; II - СГ-Б (т =120 мин.)

Как видно из рисунка, изменение концентрации в растворах при контакте с различными силикагелями практически идентично не смотря на различное количество силанольных групп на них и пористости, что говорит именно об адсорбции молекул фермента. Горизонтальный ход полученных кривых в интервале концентраций 10-30%, указывает на формирование монослоя пероксидазы на поверхности силикагеля в данном концентрационном диапазоне.

Ранее было установлено отсутствие линейного участка, параллельного оси концентраций на изотермах сорбции пероксидазы на бентоните, что, очевидно, связано с сорбцией фермента в первичных и вторичных порах минерала, размер которых соизмерим с размером молекулы пероксидазы.

В результате при иммобилизации пероксидазы редьки черной на силикагеле (СГ-А) и бентоните методом сорбции нами были получены материалы, содержание фермента в 1 г которого соответствует его содержанию в 5 мл нативного ферментного препарата, которые использовали в дальнейших исследованиях.

После выдерживания полученных препаратов в дистиллированной воде в течение 24 часов в водной фазе системы с силикагелем был обнаружен фермент, причем его количество составило около 70% от адсорбированного, тогда как сорбция пероксидазы на бентоните в данных условиях оказалась полностью

необратимой. Указанные механизмы сорбции изучаемого фермента на подложках подтвердились данными ИК-спектроскопии (рис. 5).

Рис. 5. ИК-спектр силикагеля (СГ-А), модифицированного пероксидазой.

Как видно из рис. 5 и таблицы 1, на ИК-спектре после адсорбции пероксидазы проявляются характерные для белков полосы амид I и амид II (1500-1700 см-1), а так же амид А (3280 см-1). Это позволяет заключить, что при адсорбции не происходит существенных изменений вторичной структуры белковой молекулы и, следовательно, ковалентное связывание фермента с функциональными группами поверхности отсутствует и возможна его десорбция в водную фазу. Однако при иммобилизации пероксидазы на силикагеле в ИК-спектре появляются изменения в области валентных колебаний связанных водородной связью кислотных и основных гидроксилов поверхности силикагеля (водородных связей (3400-3750 см-1) и адсорбционной воды (1670-1640 см-1). Так значительно уменьшается интенсивность полосы 3720 см-1 и вовсе исчезает раздвоенная полоса 1670-1640 см-1 (8 Н2О (адс)), что очевидно связано с образованием некоторого количества водородных связей белковой части фермента с поверхностью подложки, частично удерживающих пероксидазу от десорбции.

Данные, полученные с помощью ИК-спектроскопии бентонита, используемого в качестве подложки для иммобилизации пероксидазы и фермент - бентонитового комплекса представлены на рис. 6, 7 и в табл. 3 .

1\ см 1

Рис. 6. ИК-спектр исследуемого бентонита.

Таблица 3

Положение полос поглощения в ИК-спектре бентонита [7, 9, 10]_

Частота колебаний (см-1) Тип колебаний Атомная группа

Бентонит Бентонит+пероксидаза

3710, 3640 3600 V -ОН (структурн.)

3400 3400 V Н2О (адсорбц.)

2320 V Н2О

1640 8 Н2О

1630 V С=О (амид I)

1500 8 К-Ы в плоскости (амид II)

1450 8 -ОН

1040 1030 V 81-О- 81

680 8 О=С-К в плоскости (амид IV)

525 520 8 смешанные 81-О-А1 и Mg-O

470 470 8 81-О

430 430 V Ре(Ш)-О

Присутствие в ИК-спектре бентонита, контактировавшего с раствором фермента, полос, характерных для колебаний амидных групп белков (1630 - (у)С=О (амид I), 1500 - (8)К-Ы в плоскости (амид II), мы их на спектре обозначим 680 - (8) О=С-К в плоскости (амид IV)) подтверждает сорбционное связывание пероксидазы на подложке. Сдвиг и уменьшение интенсивности полос поглощения Амид-1 с 1640 до 1630 и Амид-11 с 1520 в 1500 обычно обусловлен изменениями СК конформации белковой молекулы. Этот факт наряду с отсутствием полос поглощения характерных для валентных колебаний групп С-К (амид А, В) - 33003100 см-1 и значительными изменениями спектра в области валентных колебаний свободных гидроксилов поверхности бентонита и адсорбированной воды свидетельствуют об образовании прочных химических связей молекул пероксидазы с бентонитом и подтверждают необратимость сорбции иммобилизованной

пероксидазы в воде. Причем вероятнее всего связывание идет вследствие взаимодействия основных гидроксилов поверхности бентонита, удельное количество которых составляет 0,43±0,007 ммоль-экв/г, и на порядок превышает количество кислотных центров — 0,04±0,001 ммоль-экв/г и карбоксильных групп белковой части фермента. Аналогичный тип связывания ранее был доказан в системе бентонит-желатин [11].

Результаты определения каталитической активности пероксидазы в системах 13 показали, что активность нативной пероксидазы отностительно гидрохинона в системе 1 составляет 0,1±0,01 е.а., а в системах с иммобилизованной на силикагеле пероксидазой (система 2) средняя ферментативная активность по отношению к гидрохинону увеличивается в 2 раза, а в системе с комплексом бентонит-пероксидаза (система 3) в 7 раз. Таким образом установили, что исследуемый фермент катализирует пероксидазное окисление гидрохинона как в нативной, так и в иммобилизованной на форме.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что понижение величины рН синтеза в области ниже ИЭТ силикагеля приводит к росту степени развитости поверхности, при этом количество сорбционных центров, представленных кислотных гидроксилов увеличивает, а основных падает.

2. Доказано, что сорбция пероксидазы редьки черной на бентоните необратима при t=25 °С и нейтральном значении рН, а сорбция пероксидазы на силикагеле обратима на 70%.

3. Установлена оптимальная длительность сорбции пероксидазы редьки черной из 20% по объему водных растворов экстрактов фермента при t=25°C. На бентоните топт=1,5 часа, при этом степень связывания фермента - 70 об.%, а на силикагеле топт=2часа, максимальная степень связывания фермента с подложкой составляет 62%.

4. Выявлено, что иммобилизация пероксидазы редьки черной на бентоните и силикагеле увеличивает ее активность в реакции окисления гидрохинона.

Список литературы

1. Пат. №:2353652., РФ, МПК C12N9/02 Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена / Д. В. Бочков (РФ), Т. Г. Толстикова (РФ), А. О. Брызгалов (РФ), М. В. Хвостов (РФ). -№2007135916/13; Заявлено 27.09.2007.; Опубл. 27.04.2009.

2. Пат. №: 2130070. РФ, МПК C12N9/08 Способ получения пероксидазы / А.А. Гусев (РФ), В.Д. Борзионов (РФ), А.С. Красоткина (РФ). - №97119125/13; Заявлено 24.11.1997.; Опубл. 10.05.1999.

3. Пат. №: 2388819. РФ, МПК C12N9/08 Способ получения пероксидазы хрена / В.И. Суровцев (РФ), В.М. Борзенков (РФ), К.В. Детушев (РФ). - №2008125459/13; Заявлено 27.12.2009.; Опубл. 10.05.2010.

4. Селибер Г.Л. Большой практикум по микробиологии / Г.Л. Селибер. - М.: Мир, 1962. - 492 с.

5. Лурье Ю. Ю. Химический анализ производственных сточных вод / Ю. Ю. Лурье, А. И. Рыбников. - М.: Химия, 1974. - 395 с.

6. Накамото К. ИК-спектры и спектры КР неорганических и координационных соединений / К. Накамото; пер. с англ. - М.: Мир, 1991. - 536 с.

7. Волькенштейн М.В. Молекулярная биофизика / М.В. Волькенштейн. - М.: Наука, 1975. - 616 с.

8. Чукин Г.Д. Химия поверхности и строение дисперсного кремнезёма / Г.Д. Чукин. - М.: Типография Паладин, ООО «Принта», 2008. - 172 с.

9. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменов В.Ф. ИК спектроскопия для исследования комплекса инулаза - носитель / И.В.Шкутина, О.Ф.Стоянова, В.Ф. Селеменов // Вестник ВГУ. - 2004. - № 1. - С. 110-113.

10. Болдырев А.И. Инфракрасные спектры минералов / А.И. Болдырев. - М.: Недра, 1976. - 199 с.

11. Ботнарь О.С., Вяткина О.В., Толстенко Д.П. Изучение сорбционных взаимодействий в системе бентонит-желатин-галлотанин-Н2О / О.С. Ботнарь, О.В. Вяткина, Д.П. Толстенко // Дев'ята Всеукрашська конференщя студенев та астранив «Сучасш проблеми хiмil»:тези допов. - К., 2008. - С. 108.

Вяткша О.В. Вплив природи шдкладки на мехашзм сорбщ!" пероксидази чорно!" редьки / О.В. Вяткша // Вчеш записки Тавршського нащонального ушверситету iM. В.1. Вернадського. Сeрiя „Бюлопя, xiMi^'. - 2012. - Т. 25 (64) № 4. - С. 239-247.

У стата наведет результати сорбцшних дослiджень в системах бентотт-пероксидаза та силкагель-пероксидаза. Встановлет кiлькiснi параметри сорбцiйних процеЫв i механiзм зв'язування фермент-тдкладка. Показана каталiтична дiя отриманих матерiалiв, щодо гiдрохiнону. Ключовi слова: пероксидаза, чорна редька, сорбцiя, бентонiт, силжагель.

Vyatkina O.V. Effect of the nature of the substrate on the sorption mechanism peroxidase radish black / O.V. Vyatkina // Scientific Notes of Taurida V.Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2012. - Vol. 25 (64), No. 4. - P. 239-247.

The article presents the results of sorption studies in bentonite-peroxidase, silicagel-peroxidase systems. The quantitative parametres of the sorption processes and the mechanism of linkage enzyme-substrate are established. It is shown catalytic activity on of the received materials related hydroquinone. Keywords: peroxidase, radish black, sorption, bentonite, silicagel.

Поступила в редакцию 18.11.2012 г.