CC BY
81
УДК 599:539.1.047 В.Ю. Сафонова, В.А. Сафонова
ВЛИЯНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ В НИЗКОЙ ДОЗЕ И ЭРАКОНДА НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ, КЛИНИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ И ГЕМОПОЭЗ ПОВТОРНО ОБЛУЧЕННЫХ ЛЕТАЛЬНОЙ ДОЗОЙ ЖИВОТНЫХ
В эксперименте на крысах установлено раздельное, а затем совместное ра-диозащитное действие предварительного Y-излучения в низкой дозе и экстракта люцерны посевной под названием «эраконд». Последовательное применение физического и биологического фактора давало более выраженный радиозащитный эффект, оцениваемый выживаемостью, средней продолжительностью жизни, клинической картиной и показателями гемопоэза. Для этого однократно за 30 дней до воздействия Y-излучения в ЛДшо крыс предварительно облучали в дозе 0,75 Гр, а в течение 5-10 дней до летального облучения ежедневно задавали им 10%-й раствор эраконда с питьевой водой и кормом в расчете 7-10 мл/кг массы животного.
К настоящему времени накоплен экспериментальный материал, указывающий на возможность повышения радиорезистентности организма путем применения различных химических и биологических средств [1-2]. Одновременно с этим показана необходимость проведения дальнейших работ в перспективном направлении по составлению рецептур из комбинации двух или нескольких радиопротекторов, позволяющих снижать токсичность одного препарата с помощью другого [3-5]. Это положение было взято во внимание во время исследований: для повышения радиорезистентности организма крыс изучалось сочетание энергии Y-излучения и биологического препарата, для чего использовалось предварительное общее однократное внешнее облучение в низкой дозе и фитопрепарат эраконд. Выбор предварительного облучения в небольших дозах обусловлен тем, что в последнее время уделяется много внимания феномену адаптивного ответа (АО). Известны работы, где авторы изучали предварительное облучение в малых дозах, при этом одни наблюдали АО [6-7], а другие нет [8-9]. Формирование радиорезистентности у животных отмечено после хронического воздействия ионизирующего излучения при накоплении суммарной дозы 40-8 сГр [10]. Известно, что многие препараты природного происхождения, обладающие способностью стимулировать уровень эндогенного фона радиорезистентности организма, активировать антиокислительные и репаративные процессы систем, мобилизовать противолучевые и общебиологические защитные ресурсы организма, являются наиболее признанными радиозащитными и радиотерапевтическими средствами. Ко всему они более доступны и, как правило, нетоксичны [1; 11].
К нетоксичным препаратам природного происхождения можно отнести и эраконд. В работе [12] показано, что назначение эраконда более активно восстанавливает иммунную систему у больных инфекционным ринотрахеитом телят. Активирует клеточное звено иммунитета, обладает индуктоинтерфероноген-ным действием. Препарат имеет важные для иммуномодулятора свойства: естественное происхождение, способность легко метаболизироваться и выводиться из организма, хорошую совместимость с другими лекарственными средствами, отсутствие сенсибилизации и индуцирования иммунопатологических реакций, возможность орального метода введения. Ко всему этому эраконд обладает противовирусной активностью, ингибируя репродукцию вируса гриппа у зараженных животных, «in vivo» обладает способностью индуцировать выработку эндогенного интерферона [13]. Эраконд нашел широкое применение для повышения продуктивности животных и общей сопротивляемости их организма к неблагоприятным фактором окружающей среды [14-16]. Повышение радиорезистентности лейкоцитов при воздействии ионизирующего излучения у
крыс на фоне применения эраконда отмечено в работе [17]. Что касается применения предварительного облучения в малых дозах и эраконда для повышения радиорезистентности организма, то такие исследования проводятся впервые.
Учитывая вышеизложенное, целью настоящей работы явилось изучение влияния предварительного воздействия радиации в низкой дозе и эраконда на выживаемость, клиническое состояние и гемопоэз у повторно облученных летальной дозой лабораторных животных.
Материал и методика исследований. В опытах было использовано 100 белых нелинейных крыс-самцов с массой тела 190-200 г. Животных подвергали общему воздействию Y-излучения на установке для дистанционной Y-терапии «Агат-С» (60Со) в условиях, исключающих взаимную экранизацию, при мощности дозы 0,6 Гр/мин, расстоянии 75 см от источника излучения. Все крысы были разбиты на группы по 10 штук в каждой: первая (9,0 Гр - облученный контроль ); вторая (0,75 Гр + 9,0 Гр); третья ( эраконд + 9,0 Гр); четвертая (0,75 Гр + эраконд + 9,0 Гр ); пятая - биологический контроль. Выбор дозы 0,75 Гр обусловлен нашими предварительными исследованиями по установлению радиозащитной эффективности малых доз в диапазоне 0,25-1,0 Гр.
Во второй и четвертой группах разрыв между первым и вторым облучением составлял 30 суток. В течение 7-10 суток до воздействия Y-излучения в ЛД90/30 крысы третьей и четвертой групп ежедневно получали 10%-й раствор эраконда с питьевой водой и кормом в расчете 7-10 мл/кг. Эраконд представляет собой экстракт люцерны посевной (МЫюадо sativa), полученный при гидробарометрической обработке наземной части растения с добавлением определенного набора микроэлементов. Препарат разработан в ТОО НВП «АПТ-Экология» (Екатеринбург). Густой экстракт люцерны, приготовленный в соответствии с ТУ 9337-004-12334249-97, представляет собой пластическую стерильную субстанцию темно-коричневого цвета, которая при высушивании твердеет. Вкус горьковатый. Хорошо растворим в воде (допускается появление незначительного осадка).
Животных всех групп содержали в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе при неограниченном доступе воды. О радиозащитной эффективности предварительного облучения в низкой дозе, эраконда и последовательного их применения судили по состоянию внешнего вида животных, реакции на внешние раздражители, проявлению кишечного и геморрагического синдромов, показателю выживаемости и средней продолжительности жизни (СПЖ) в 30-суточный период наблюдения. Учитывали содержание лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови, общее количество клеток костного мозга и их разновидности. Кровь для исследования брали при декапитации крыс под эфирным наркозом. Показатели картины крови, средней продолжительности жизни опытных животных изучали общепринятыми методами. Общее количество клеток в бедренной кости крыс и их разновидности изучали по методике, описанной в работе [18]. Статистическую обработку результатов осуществляли по Стъюденту.
Результаты и их обсуждение. В результате исследований установлено, что у большинства крыс 1-й группы, которая являлась контролем облучения, на 3-5-е сутки отмечалась диарея, животные отказывались от корма, неадекватно реагировали на внешние раздражители, были вялыми и неподвижными. К 7-м суткам вокруг глаз и носовых отверстий образовывались коричневые корочки, что свидетельствовало о выраженном развитии геморрагического синдрома. Г ибель крыс начиналась с 8-х суток и составила 90% при средней продолжительности жизни 9,6±2,3 сут. При патологоанатомическом вскрытии трупов павших животных обнаруживались множественные мелкоточечные и разлитые кровоизлияния в легких, селезенке, печени, почках и на всем протяжении тонкого отдела кишечника, что свидетельствовало об острой лучевой болезни тяжелой и крайне тяжелой степени. Как следует из представленной таблицы, у животных группы облученного контроля (1-я группа) с первых дней после воздействия Y-излучения в дозе 9,0 Гр резко снижалось количество лейкоцитов в крови. На 5-е сутки их количество достигало наименьших значений и насчитывало 0,6±0,07 -109/л. Поэтому этот срок исследования лейкоцитов мы сочли наиболее информативным.
У животных, предварительно облученных в дозе 0,75 Гр (2-я группа) без введения эраконда, на 5-е сутки после повторного воздействия Y-излучения в дозе 9,0 Гр количество лейкоцитов понижалось до
1,2±0,07 -109/л, но на 50% было выше облученного контроля. В этот период вялость крыс чередовалась с адекватной реакцией на внешние раздражители. Признаки диареи присутствовали, но непродолжительное время, признаки геморрагического синдрома были единичными. Выживаемость крыс данной группы составила 40% при средней продолжительности жизни 17,2±2,6 сут. Гибель животных отмечалась с 12 суток.
Показатели картины крови, выживаемости и средней продолжительности жизни крыс
Группа Показатель
Лейкоциты, 109/л (5-е сут.) Эритроциты, 1012/л (7-е сут.) Тромбоциты, 109/л (7-е сут.) Выживае- мость, сут. Средняя продолжительность жизни, сут.
1-я 0,60±0,07* 3,70±0,18* 96±4 10 9,6±2,3
2-я 1,20±0,07** 4,57±0,23** 104±3 40 17,2±2,6
3-я 2,56±0,07** 4,62±0,16** 106±4 40 17,8±4,5
4-я 3,30±0,15** 4,82±0,23** 120±3** 60 22,5±3,2**
5-я б.к. 8,98±0,15 6,56±0,08 410±17 100 -
* Различия достоверны по сравнению с биологическим контролем при р<0,05. ** Различия достоверны по сравнению с контролем облучения при р<0,05.
У животных, получавших только эраконд (3-я группа) в объеме 7-10 мл/кг, в течение 5-10 суток до облучения в дозе 9,0 Гр количество лейкоцитов на 5-е сутки было достоверно выше по сравнению с крысами группы облученного контроля и составляло в среднем 2,56±0,07'109/л. Клинические признаки были схожи с таковыми у животных группы предварительно облученных в дозе 0,75 Гр. Выживаемость составила 40% при средней продолжительности жизни 17,8±4,5 сут.
У крыс 4-й группы, которые были предварительно облучены в дозе 0,75 Гр, а затем в течение 10 суток до летального воздействия радиации получали с питьевой водой и кормом эраконд в дозе 7-10 мл/кг, клиническое проявление острой лучевой болезни было выражено на уровне средней и легкой степени тяжести. Животные в большинстве оставались чистыми, адекватно реагировали на внешние раздражители, охотно поедали корм. Случаи диареи были единичными и непродолжительными. Количество лейкоцитов на 5-е сутки после летального облучения находилось в пределах 3,3±0,15 109/л. При патологоанатомическом исследовании павших животных кровоизлияния в органах и тканях регистрировались значительно в меньшей степени, чем у крыс группы облученного контроля. Выживаемость составила 60% при средней продолжительности жизни 22,5±3,2 сут.
Учитывая то, что убыль эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови у облученных животных происходит несколько позднее, чем лейкоцитов, и связана с разгаром болезни, то результаты исследования этих показателей через 7 суток после облучения, приведенные в таблице, являются вполне информативными. Из таблицы видно, что содержание эритроцитов у крыс 2-4-й опытных групп было ниже физиологической нормы, но достоверно выше облученного контроля на 23,5, 24,8 и 30,2% соответственно. Выраженность тромбоцитопении в опытных группах была ниже по сравнению с животными группы облученного контроля с достоверной разницей в 4-й группе. Приведенные данные свидетельствуют о радиорезистентном состоянии гемопоэза у животных данной группы к повторному летальному воздействию Y-излучения в ЛД90/30. Диагностическая ценность гематологических нарушений, регистрируемых в различные сроки после облучения, начиная с первичной реакции на облучение, широко используется для оценки как степени поражения системы крови, так и для оценки радиозащитных средств, применяемых для профилактики и терапии острой лучевой патологии. Наиболее информативными показателями эффективности примененных радио-защитных средств наряду с клинико-гематологическими показателями и выживаемостью будут являться показатели гемопоэза в красном костном мозге. Клетки красного костного мозга считаются «критической» популяцией при воздействии ионизирующего излучения [18] .
На рис. 1-4 представлены результаты влияния предварительного облучения и эраконда на показатели гемопоэза в бедренной кости крыс на 2-е и 8-е сутки после облучения. Вторые сутки характеризуют первичную реакцию на облучение, а восьмые считаются периодом, когда начинаются восстановительные процессы в костном мозге облученных радиацией животных [18-19].
140
120
100
80
60
40
20
0
□ б.к.
■ 1-я группа \~ И 2-я группа
■ 3-я группа ЕЭ 4-я группа
3 сут.
8 сут.
Рис. 1. Динамика общего числа клеток бедренной кости подопытных крыс (п 106)
Общее количество клеток в бедренной кости необлученных крыс (биологический контроль) колебалось в пределах 131,0±2,7 -106. В период первичной реакции на облучение у крыс группы облученного контроля их количество достоверно уменьшалось до минимальных значений (рис.1). Во 2-4-й опытных группах общее количество клеток костного мозга было достоверно ниже по сравнению с биологическим, но достоверно выше по сравнению с облученным контролем. Обращают на себя внимание процессы, происходящие на 8-е сутки. Темп восстановления был более выражен в группах подопытных животных (0,75+9,0 Гр;
0,75+эраконд; 0,75+эраконд+9,0 Гр).
□ б.к.
Ш 1-я группа И 2-я группа ■ 3-я группа
□ 4-я группа
2 сут 8 сут
Рис. 2. Динамика общего количества эритроидных клеток в бедренной кости крыс (п •106)
Динамика популяции эритроидных клеток (рис. 2) примерно повторяла таковую, характеризующую общее количество клеток бедренной кости, как в период первичной реакции на облучение, так и на 8-е сутки.
Количество нейтрофильных клеток в бедренной кости крыс биологического контроля составляло порядка 62,8±2,2 -106. Спустя 2-е суток после облучения в группе облученного контроля их содержание уменьшалось в 7,7 раза по сравнению с аналогами биологического контроля (рис. 3). Животные 2-4-й групп сравнивались с облученным контролем. Так, во 2—3-й группах этот показатель превышал таковой 1-й группы примерно в 2 раза, а в 4-й — в 2,3 раза. На 8-е сутки процесс восстановления нейтрофильных клеток был более выражен у животных защищенных групп.
70
60
50
40
30
20
10
0
□ б.к.
Ш1-я группе)
НО 2-я группе)
■ 3-я группа
□ 4-я группа
2 сут.
8 сут.
Рис. 3. Динамика общего количества нейтрофильных клеток в бедренной кости крыс (п •106)
30
25
20
15
10
5
0
□ б.к.
§ 1-я группа Ш 2-я группа ■ 3-я группа ЕЗ 4-я группа
2 сут.
8 сут.
Рис. 4. Динамика общего количества лимфоидных клеток в бедренной кости крыс (п •106)
Общее количество лимфоидных клеток в бедренной кости интактных крыс насчитывалось порядка 26,8±1,5'106. На рис. 4 представлена динамика снижения этих клеток по отношению к биологическому контролю. Глубокое снижение общего числа лимфоидных клеток в бедренной кости крыс при воздействии дозой 9,0 Гр наблюдалось на 2-е сутки. Количество клеток при этом понижалось по сравнению с биологическим контролем в 22,3 раза. Степень защищенности этих клеток у животных 3-4-й группы по отношению к группе облученного контроля был соответственно выше в 2,8 и 4,6 раза. Восстановление лимфоидных клеток в целом происходило медленнее, чем эритроидных и нейтрофильных клеток (рис. 2-3). У животных 3-4-й группы процесс восстановления был интенсивнее по сравнению со своими аналогами группы облученного контроля.
Таким образом, результаты опытов на белых беспородных крысах показали, что предварительное воздействие Y-излучения в дозе 0,75 Гр за 30 суток до повторного облучения в дозе ЛД90/30 формирует АО, который характеризуется улучшением общего состояния животных, меньшим проявлением клинических признаков геморрагического синдрома, увеличением средней продолжительности жизни животных. Применение 10%-го эраконда в объеме 7-10 мл/кг с питьевой водой и кормом ежедневно за 5-10 дней до воздействия Y-излучения в дозе 9,0 Гр также увеличивает выживаемость крыс до 40% и переводит тяжелую степень лучевой болезни в среднюю. Последовательное применение предварительного воздействия Y-излучения и эраконда в указанных временных и дозовых диапазонах сохраняет 60% крыс, подвергнутых повторному воз-
действию радиации ЛД90/30, облегчает их общее состояние с проявлением клинических признаков, характерных для легкой степени острой лучевой болезни.
У животных, предварительно облученных малыми дозами внешней радиации, процессы кроветворения в период первичной реакции на облучение сохраняются в большей степени, чем у однократно облученных летальной дозой животных с положительной динамикой костномозгового кроветворения в восстановительный период. Различие в кроветворении выражается в более высоком содержании клеток эритроидного, гранулоцитарного и лимфоидного ряда в костном мозге бедренной кости крыс. Предварительное облучение и последующее применение эраконда оказывает более выраженный эффект на сохранение и восстановление кроветворных клеток у крыс, подвергнутых повторному облучению в летальной дозе.
Литература
1. Кудряшов Ю.Б., Гончаренко Е.Н. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1999. - Т.39. - № 2-3. - С. 197-210.
2. Ильин Л.А., Андрианова И.Е., Глушков В.А. [и др.] // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2004. - Т. 44. -№ 5. - С. 547-549.
3. Владимиров, В.Г. Радиозащитные рецептуры: Оптимизация состава и механизма действия / В.Г. Владимиров, Г.А. Поддубский, Г.И. Разоренов. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1988. - 186 с.
4. Грачев С.А., Свердлов А.Г., Никанорова Н.Г., Тимошенко С.И. // Радиац. биология. Радиоэкология. -1999. - Т.39. - № 2-3. - С. 261-263.
5. Гончаренко Е.Н., Кудряшов Ю.Б. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1996. - Т.36. - Вып.4. - С. 573-586.
6. Котеров А.Н., Никольский А.В. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1999. - Т.39. - № 6. - С. 648-662.
7. Булдаков, Л.А. Радиационное воздействие на организм: положительные эффекты / Л.А. Булдаков, В.С. Калистратова. - М.: Информ-Атом, 2005. - 246 с.
8. ФоменкоЛ.А., КожановскаяЯ.К., Газиев А.И. // Радиобиология. - 1991. - Т.31. - Вып. 5. - С. 709-715.
9. Ульянова Л.П., Будагов Р.С. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1997. - Т.37. - Вып.5. - С. 735-739.
10. Мирзоев Э.Б., Шевченко А.С. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1997. - Т.37. - Вып. 2. - С. 143-147.
11. Гончаренко, Е.Н. Гипотеза эндогенного фона радиорезистентности / Е.Н. Гончаренко, Е.Н. Кудряшов. -М.: Изд-во МГУ, 1980. - 176 с.
12. Гизатуллина, Ф.Г. Коррекция естественной резистентности животных при патологиях в экологически неблагополучных условиях Южного Урала / Ф.Г. Гизатуллина. - Троицк: Изд-во УГАВМ, 2006. - 196 с.
13. Слободенюк, А.В. Применение фитопрепарата эраконд для профилактики и лечения гриппа и других ОРЗ / А.В. Слободенюк, Ю.В. Григорьева // Питание и здоровье: мат-лы регион. науч.-практ. конф. -Екатеринбург, 1999. - С. 81-83.
14. Сунагатуллин Ф.А. // Ветеринария. - 1996. - №11. - С. 43-45.
15. Таирова А.Р. // Ветеринарный врач. - 2001. - № 2 (6). - С. 50-52.
16. Рахматуллин Э.К., Аникина Г.В., Гизатуллина Ф.Г. // Вестн. РАСХН. - 2002. - № 3. - С. 75-77.
17. Сафонова, В.А. Динамика общего числа лейкоцитов крови крыс при облучении на фоне применения эраконда / В.А. Сафонова, О.Н. Старых // Вестн. ветеринарии. - 2002. - Вып.5. - С. 187-189.
18. Горизонтов, П.Д. Стресс и система крови / П.Д. Горизонтов, О.И. Белоусова, М.И. Федотова. - М.: Медицина, 1983. - 240 с.
19. Дешевой Ю.Б., Мороз Б.Б., Лырщикова А.В., Лебедев В.Г. Нарушения в системе крови при воздействии ионизирующей радиации в низкой дозе в зависимости от длительности эмоционального стресса / Ю.Б. Дешевой [и др.] // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2002. - Т.42. - № 4. - С. 384-389.
