CC BY
69
Ю. В. Родионов, А. Н. Федин
ВЛИЯНИЕ ПРЕДНИЗОЛОНА НА СОКРАТИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЛАДКОЙ МЫШЦЫ ТРАХЕИ И БРОНХОВ МОРСКОЙ СВИНКИ Введение
Лекарственная терапия на сегодняшний день остается наиболее эффективным методом лечения многих легочных заболеваний [1]. Среди использующихся препаратов особое место занимают глюкокортикостероиды (глюкокортикоиды), которые оказывают противовоспалительное и бронхолитическое действие. Противовоспалительное действие глюкокортикоидов хорошо изучено и заключается в воздействии на генетический аппарат клетки и активацию противовоспалительных генов или уменьшение транскрипции определенных генов [1-3]. Бронхолитические механизмы действия глю-кокортикоидов в настоящее время мало исследованы. Встречаются отдельные работы, в которых показано, что они могут взаимодействовать с бета-адренорецепторами [4] или мускариновыми холинорецепторами [5]. Кроме того, показано, что в терапевтических дозах глюкокортикоиды могут действовать через трахеобронхиальные рецепторы, главным образом, через афферентные окончания капсаицин-чувствительных С-волокон [6]. Учитывая, что иннервация разных отделов респираторного тракта неодинакова, можно предположить, что глюкокортикоиды оказывают разное действие на трахею и бронхи. В данной работе рассматривалось влияние преднизолона на трахею и бронхи морской свинки, для гладкой мышцы которых характерна разная афферентная и эфферентная иннервация.
Методы исследования
Объектом исследования послужили 16 морских свинок обоих полов с массой тела 250-500 г. Эвтаназию производили путем помещения животного в камеру с углекислым газом.
Для опыта использовали сегменты длиной около 5 мм грудной части трахеи и бронхов 2-6-го порядка с обязательным наличием места бифуркации (это связано с нахождением в области бифуркаций интрамуральных ганглиев). Выделенные сегменты трахеи и бронхов помещали в экспериментальные камеры с проточным аэрированным физиологическим раствором Кребса—Хензелайта. Температура раствора с помощью ультратермостата поддерживалась в пределах 37 ± 0,5 °С. Скорость протока физиологического раствора составляла 0,6 мл/мин. Объем экспериментальной камеры был равен 2,5 мл.
Продольно разрезанные с вентральной стороны сегменты трахеи и бронхов одной стороной прикалывали вольфрамовыми иголками к основанию камеры, а другой с помощью вольфрамового крючка и нити присоединяли к электромеханическому датчику, связанному с АЦП компьютера. Начальное натяжение препаратов составляло 500 мг. До начала проведения эксперимента препараты выдерживались в камере в течение одного часа.
© Ю. В. Родионов, А. Н. Федин, 2011
Раздражение преганглионарных нервных волокон электрическим полем осуществляли с помощью электростимулятора. Частота стимулов составляла 8 стим/с, длительность — 0,5 мс, амплитуда 20 В, продолжительность стимуляции — 10 с. Время между стимуляциями составляло 2,5 мин. Серебряные электроды располагались вдоль продольной стенки ванночки по обе стороны препарата.
Регистрация сократительной активности гладкой мышцы в изометрическом режиме (анализировалось изменение тонического напряжения мышцы) проводилась с помощью электромеханического датчика, электрический сигнал с которого подавался на АЦП и дальше поступал на ЭВМ для регистрации и дальнейшей обработки.
В работе использовали глюкокортикостероид преднизолон в концентрации 5,0 мкг/мл и объеме 0,2 мл (1,0 мкг), вводили в ванночку за одну минуту до начала 1, 4 и 7-й опытными стимуляциями, а местный анестетик новокаин перфузировали в ванночку с помощью перистальтического насоса в концентрации 1,0 мкг/мл (3,7 мкМ) в течение 22,5 мин. После этого производили отмывание препаратов физиологическим раствором в течение 30 мин.
Опыты были разбиты на два этапа. На первом этапе сначала изучали изменение сокращений гладкой мышцы трахеи и бронхов в физиологическом растворе, вызванные стимуляцией электрическим полем, затем исследовали влияние 3,7 • 10-6 М новокаина на сокращения гладкой мышцы. На втором этапе исследовали влияние 1,0 мкг пред-низолона на сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов, вызванные стимуляцией электрическим полем, затем — влияние преднизолона на фоне 3,7 • 10-6 М новокаина.
Средняя величина ответа на первые три стимуляции рассматривалась как контрольный ответ. После каждого воздействия вещества препарат раздражали три раза, и эффект определяли как среднюю величину ответов на эти три стимуляции. Всего за один опыт применялось 12 стимуляций. Таким образом, в каждой серии опытов в обработке результатов участвовали одна контрольная и три опытных стимуляции.
При обработке экспериментальных данных рассчитывали средние амплитуды сокращения и расслабления, скорость сокращения, латентный период ответа и их ошибки. Для этого использовали статистические программы Excel. Достоверность различий двух средних величин определяли по критерию Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
Стимуляция преганглионарных нервных волокон вызывала двухфазное изменение ответа гладкой мышцы трахеи морской свинки (рис. 1). Первая фаза ответа была представлена сокращением (напряжением) и составляла 505,46 ± 53,5 мг, вторая фаза — расслаблением и равнялась 132,3 ± 18,3 мг. В бронхах величина сокращения гладкой мышцы составляла 164,0 ± 29,5 мг, а расслабления — 8,2 ± 1,8 мг.
Аппликация в ванночку преднизолона в дозе 1 мкг уменьшала амплитуду сокращения гладкой мышцы трахеи, вызванного стимуляцией преганглионарных нервов, до 90,2 ± 2,2% (р < 0,05; n = 6) (рис. 2), скорость сокращения уменьшалась до 78,6 + 2,6%, а латентный период ответа увеличивался до 114,0 + 4,8%. 1,0 мкг преднизолона снижал амплитуду сокращения бронхов до 71,2 ± 3,1% (р < 0,05; n = 7), скорость сокращения — до 65,2 + 7,3% и увеличивал латентный период ответа до 164,7 + 15,1%. Наибольший эффект наблюдался после второй аппликации преднизолона в ванночку с препаратами дыхательных путей.
Рис. 1. Сокращение трахеи (а) и бронхов (б), вызванное стимуляцией преганглионарных нервов
1 — амплитуда сокращения, 2 — амплитуда расслабления.
После первой и второй аппликации 1 мкг преднизолона уменьшал амплитуду расслабления гладкой мышцы трахеи, вызванную стимуляцией нервов, с 95,5 + 7,0 мг до 58,1 + 12,7 мг, после третьей аппликации величина расслабления мышцы практически восстанавливалась до исходной величины (см. рис. 2). На препаратах бронхов преднизолон постепенно увеличивал расслабление гладкой мышцы с 8,2 ± 1,8 мг до 15,1 ± 4,3 мг.
Рис. 2. Влияние 1 мкг преднизолона на сокращения (а) и расслабление (б) трахеи и бронхов, вызванные стимуляцией преганглионарных нервов
По осям абсцисс — номер последовательных стимуляций; по осям ординат: а — изменение сокращений (в %), б — изменения расслабления (в мг). За 100% принят ответ на контрольную стимуляцию. * и ** — достоверное (р < 0,05 и р < 0,01 соответственно) отличие изменения сокращения от контроля.
Таким образом, преднизолон снижал сокращение гладкой мышцы трахеи и бронхов, вызванное стимуляцией преганглионарных нервов и задерживал начало ответа. При этом влияние на гладкую мышцу бронхов проявлялось сильнее, чем на мышцу трахеи. Кроме того, глюкокортикоид оказывал противоположное влияние на фазу расслабления трахеи и бронхов. Возможно, это различие в действии глюкокортикоида связано
с неодинаковой афферентной иннервации разных частей респираторного тракта у морской свинки. Показано [7], что в трахее по сравнению с бронхами больше быстро и медленно адаптирующихся рецепторов, а в бронхах афферентных окончаний С-волокон. Взаимодействие преднизолона с трахеобронхиальными рецепторами показано на изолированных препаратах респираторного тракта крыс с легочными болезнями [8]. Можно предположить, что и на препаратах трахеи и бронхов морской свинки действие преднизолона связано с рецепторами дыхательных путей. Для проверки этого предположения мы провели эксперименты с блокадой местным анестетиком, новокаином, рецепторов трахеи и бронхов.
Перфузия новокаина в концентрации (3,7 • 10-6 М) через ванночку с препаратами дыхательных путей постепенно уменьшала амплитуду сокращения гладкой мышцы трахеи, вызванного стимуляцией преганглионарных нервов, до 72,6 ± 2,6% (р < 0,05; п = 7) (рис. 3), скорость сокращения — до 66,8 + 4,2% и увеличивала латентный период ответа до 119,2 + 4,1%. Новокаин в данной концентрации снижал амплитуду сокращения гладкой мышцы бронхов до 78,7 ± 3,6% (р < 0,05; п = 6) (см. рис. 3), скорость
Трахея Бронхи
—0— предн ■ нов 10 ▲ предн + нов
Рис. 3. Влияние преднизолона и новокаина на амплитуду сокращения трахеи и бронхов, вызванного стимуляцией преганглионарных нервов
По оси абсцисс — номер последовательных стимуляций; по оси ординат — сокращение (в %). «предн» — действие 1 мкг преднизолона; «нов» — действие 3-10"6 М новокаин; «предн + нов» — действие преднизолона на фоне новокаина. *и ** — достоверное (р < 0,05 и р < 0,01 соответственно) отличие изменений сокращения трахеи и бронхов при совместном действии пред-низолона и новокаина от сокращения, вызванного одним преднизолоном.
сокращения — до 73,2 + 11,2% и увеличивал латентный период ответа до 116,2 + 8,9%. Новокаин уже на 3-й минуте после поступления в ванночку уменьшал амплитуду расслабления гладкой мышцы трахеи с 70,4 ± 10,7 мг до 52,0 ± 9,0 мг (р < 0,05; п = 7), при более длительном действии новокаина эффект практически не менялся (рис. 4). На препаратах бронхов новокаин в данной концентрации снижал расслабление гладкой мышцы, вызванное электрической стимуляцией нервов с 12,3 + 2,9 мг до 3,7 + 1,3 мг (р < 0,05; п = 6) (см. рис. 4).
Можно отметить, что блокатор рецепторов новокаин действовал аналогично глю-кокортикоиду: снижал сокращение изолированных препаратов дыхательных путей
и расслабление гладкой мышцы трахеи, но в отличие от кортикостероида снижал амплитуду расслабления гладкой мышцы бронхов.
На фоне 3,7 • 10-6 М новокаина 1,0 мкг преднизолона не оказывал достоверного влияния на величину сокращения трахеи и бронхов (см. рис. 3). Амплитуда расслабления трахеи при совместном действии преднизолона и новокаина сначала достоверно снижалась с 56,7 + 10,2 мг до 33,1 + 6,0 мг, затем постепенно восстанавливалась до контрольного значения. Амплитуда расслабления гладкой мышцы бронхов при действии преднизолона на фоне новокаина увеличивалась с -6,7 ± 1,0 мг до -15,2 ± 3,6 мг (р < 0,05; п = 7) (см. рис. 4).
—0— предн --------■-- нов 10 ---▲--- предн + нов
Рис. 4. Влияние преднизолона и новокаина на амплитуду расслабления трахеи (а) и бронхов (б), вызванного стимуляцией преганглионарных нервов По осям абсцисс — номер последовательных стимуляций; по осям ординат — расслабление (в мг). Условные обозначения как на рис. 3.
Проведенное исследование показало, что терапевтические дозы преднизолона уменьшали амплитуду сокращения гладкой мышцы изолированных препаратов трахеи и бронхов морской свинки, вызванного стимуляцией преганглионарных нервов. При этом эффект на бронхах проявлялся сильнее, чем на трахее. Блокада трахеобронхиальных рецепторов новокаином практически снимала эффект преднизолона на фазу сокращения гладкой мышцы, вызванного стимуляцией нервов на препаратах трахеи и бронхов. В то же время новокаин уменьшал эффект преднизолона на фазу расслабления гладкой мышцы трахеи, но он не оказывал влияния на действие преднизолона на фазу расслабления гладкой мышцы бронхов.
Заключение
Действие преднизолона на фазу сокращения гладкой мышцы трахеи и бронхов связано с рецепторами дыхательных путей. Учитывая, что преднизолон взаимодействует с чувствительными окончаниями С-волокон [6], можно предположить, что количество этих волокон в бронхах морской свинки больше, чем в трахее. Действие преднизолона на фазу расслабления гладкой мышцы, по всей видимости, связано с другими механизмами.
1. Barnes P. J. Molecular mechanisms of antiasthma therapy //Ann. Med. 1995. Vol. 7, N 8. Р. 531— 535.
2. Dostert A., Heinzel T. Negative glucocorticoid receptor response elements and their role in glucocorticoid action // Curr. Pharm. Des. 2004. Vol. 10. Р. 2807-2816.
3. Glucocorticoid treatment increases inhibitory M2 muscarinic receptor expression and function in the airways / Jacoby D., Yost B., Kumaravel B., Chan-Li Y., Xiao H. Q., Kawashima K., Fryer A. //Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2001. Vol. 24. Р. 485-491.
4. Mak J., Nishikawa M., Barnes P. J. Glucocorticosteroids increase ß2-adrenergic receptor transcription in human lung //Am. J. Physiol. 1995. Vol. 268. Р. 41-46.
5. Undem B. J., Kollarik M. The Role of Vagal Afferent Nerves in Chronic Obstructive Pulmonary Disease // Proc. Am. Thorac. 2005. Vol. 2. Р. 355-360.
6. Особенности повреждения бронхов и региональной нервной системы легких ингаляционными оксидантами в эксперименте / Данилов Л. Н., Кузубова Н. А., Федин А. Н., Фионик А. М., Лебедева Е. С. // Болезни органов дыхания. 2007. № 1. С. 96-105.
7. Glucocorticoid Receptor Nuclear Translocation in Airway Cells after Inhaled Combination Therapy / Usmani O. S., Ito K., Maneechotesuwan K., Ito M., Johnson M., Barnes P. J., Adcock I. M. // Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2005. Vol. 172. Р. 704-712.
8. Влияние преднизолона на гладкую мышу трахеи нормальных крыс и крыс с фиброзиру-ющим альвеолитом / Федин А. Н., Некрасова Э. А., Фролова С. А., Данилов Л. Н., Лебедева Е. С., Илькович М. М. // Журн. эвол. биохим. физиол. 2007. Т. 43, № 4. С. 352-356.
Статья поступила в редакцию 17 марта 2011 г.
