CC BY
103
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2009. - Вип. 17, т. 1. - С. 3-9. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2009. - Vol. 17, N 1. - P. 3-9.
УДК 58l.l32:577.l52.l
Д. Р. Алиева1, Г. Г. Бабаев1, 2, И. В. Азизов1, 2
‘Институт ботаники НАНА, Баку, Азербайджан 2Бакинский филиал Днепропетровского национального университета, Баку, Азербайджан
ВЛИЯНИЕ ПОВЫШЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ NaCl НА ФОТОСИНТЕЗ И АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ КЛЕТОК DUNALIELLA SAUNA
Досліджено вплив підвищення концентрації NaCl (від 0,5 до 4,0 М) на пігментний склад, кисневий обмін і активність каталази клітин зеленої водорості Dunaliella salina. Встановлено оптимальну концентрацію NaCl (2,0 М), за якої відмічено інтенсивний біосинтез зелених пігментів і функціонування фотосинтетичного апарату. При підвищених концентраціях NaCl (3,0 та 4,0 М) зростає активність каталази у 5,8 раза у перерахунку на l мг білка порівняно з контролем, що становило 0,5703 мкмоль/хв. на мг білка. Активність каталази може бути використана як показник стійкості клітин водорості до умов сольового стресу.
D. R. Aliyeva, H. G. Babayev, I. V. Azizov
‘Institute of Botany of Azerbaijan National Academy of Sciences, Azerbaijan 2Baku Branch of the Dnipropetrovsk National University, Azerbaijan
EFFECT OF ELEVATED NaCl CONCENTRATION TO THE PHOTOSYNTHESIS AND ACTIVITY OF CATALASE IN DUNALIELLA SALINA CELLS
The effect of elevated NaCl concentration (from 0.5 to 4.0 M) to the pigment content, O2 exchange and activities of some oxidative stress enzymes in the green alga Dunaliella salina was investigated. The optimum NaCl concentration (2.0 M) for the intensive biosynthesis of green pigments and function of the photosynthetic apparatus were established. The catalase activity increased up to 5.8 times and reached 0.5703 ^mol min-lmg-lprotein after 7 days of exposure to high salt concentration (3.0 and 4.0 M). The activity of catalase can be used as an indicator of alga cells’ resistance to salinity stress.
Введение
Увеличение содержания соли в среде вызывает значительные изменения большинства физиологических процессов у растений: изменяется ионный состав клеток, перестраиваются гормональная и ферментная системы, в большинстве случаев снижается суммарный фотосинтез. Приспособление организма к неблагоприятным условиям достигается за счет специальных механизмов.
При избыточном содержании солей в почве у растений развивается солевой стресс. На этом фоне повышение активности супероксиддисмутазы (СОД) является защитным механизмом, предотвращающим отрицательный эффект избыточного накопления свободных радикалов в клетках с образованием Н2О2. В ликвидацию Н2О2 включен комплекс ферментов: каталаза, аскорбатпероксидаза и глутатионредуктаза [15; 17]. Каталаза (КАТ, КФ 1.11.1.6) играет важную роль в аскорбат-глутатионовом цикле, регулирующем окислительно-восстановительное равновесие. Регулируя содержание пе-
© Д. Р. Алиева, Г. Г. Бабаев, И. В. Азизов, 2009
роксида водорода и супероксидного радикала, можно контролировать скорость биоде-градативных процессов.
Одноклеточные зеленые водоросли рода Dunaliella являются наиболее солеустойчивыми среди эукариотических фотосинтезирующих организмов, которые способны к выживанию в крайне различающихся соленостях (0,05-5 М NaCl). С увеличением солености окружающей среды в клетках Dunaliella происходит перестройка пигментного аппарата, дыхательного и фотосинтетического метаболизма, а также нуклеинового обмена. По последним данным, при повышении концентрации NaCl от 0,5 М до 3,0 М в клетках Dunaliella salina обнаруживаются 76 солеиндуцируемых белков [9]. Методами двумерного гель-электрофореза и масс спектрометрии (MS) 80 % из этих белков было полностью идентифицировано, определена их локализация и функции. К ним относятся ферменты центральных метаболических путей, таких как ферменты фотосинтеза, производства энергии, синтеза и деградации белка, биосинтеза аминокислот, шапероны, антиоксиданты и др. Ранее некоторыми авторами было показано, что увеличение концентрации NaCl вызывает смену активности многих ферментов в клетках D. salina. Эти данные говорят о том, что D. salina обладает множеством метаболических путей, которые хорошо сопряжены, лабильны и тесно связаны с функционированием фотосинтетического аппарата [5].
Цель настоящего исследования - оценить влияние повышенной концентрации NaCl в культивируемой среде на пигментный состав, кислородный обмен и активность каталазы клеток зеленой водоросли D. salina.
Материал и методы исследований
Объектом исследования служила одноклеточная зеленая водоросль Dunaliella salina (штамм 1). Водоросли выращивали в плоскодонных колбах на качалке в жидкой питательной среде при круглосуточном освещении 20 Вт/м2 и температуре воздуха +23±1 °С. Клетки выращивали в среде, содержащей 0,5 М NaCl, затем их переносили в среду, содержащую 1, 2, 3 и 4 М NaCl, соответственно.
Для получения ферментного экстракта культуру клеток центрифугировали 15 минут при 6000 g и +4 °С. Клетки гомогенизировали в 5 мл охлажденного 100 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 2 мМ ЭДТА, 1 % РУР (Sigma-Aldrich, Германия) и 1 мМ PMSF (Serva, Германия). Гомогенат центрифугировали 20 мин при 16000 g и +4 °С. Супернатант использовали для определения активности фермента.
Содержание Н2О2 определяли по методу Великова и др. [21]. Оптическую плотность супернатанта определяли спектрофотометрически при длине волны 390 нм на спектрофотометре Ultrospec 3300 Pro ("Amersham Biosciences", США).
Активность КАТ определяли спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 240 нм в результате разложения Н2О2 (Е = 45,2 мМ_1см_1), согласно [16]. Реакционная среда содержала 60 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,0), 15 мМ Н2О2 и 100 мкл ферментного экстракта. Реакцию начинали добавлением Н2О2. Измерение оптической плотности проводили в течение 1 мин.
Качественное изменение активности КАТ исследовали путем электрофореза в нативном полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лаеммли [11] с некоторыми модификациями. Для электрофореза использовали 7 % ПААГ. Электрофорез был проведен при +4 °С, 3 часа при стабильном токе 30 мА, используя прибор SE 250 (Amersham Biosciences, США). Для визуализации линий КАТ гель окрашивали в растворе, содержащем 0,1 % K3[Fe(CN)6] и 0,1 % FeCl3 [6].
Количество клеток в суспензии определяли прямым подсчетом числа клеток под микроскопом в счетной камере Горяева. Содержание хлорофиллов и каротиноидов в общей смеси пигментов определяли в 80 % ацетоновом экстракте [20]. Содержание белка в ферментном экстракте определяли по методу Лоури [14]. В качестве стандарта использовали БСА (SERVA, Германия). Фотосинтетическую активность клеток измеряли полярографическим методом в замкнутой амперометрической ячейке с платиновым электродом по выделению кислорода при освещенности 300 Вт/м2. Дыхание определяли в темноте, по поглощению кислорода [2].
Данные по определению пигментов и ферментативной активности представлены как средние арифметические и их стандартные отклонения из двух независимых опытов, выполненных в трех биологических повторностях.
Результаты и их обсуждение
Повышение концентрации NaCl в культивируемой среде вызывает деструктивные изменения у водорослей: угнетение фотосинтеза, перестройку пигментного аппарата, замедление роста и развития клеток, образование в клетках организма избытка Н2О2, приводящего к изменению проницаемости биомембран, что может вызвать гибель клеток. Клетки, адаптированные к 0,5 М и 2,0 М NaCl, были перенесены в среду, содержащую 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 и 4,0 М NaCl соответственно. Через 7 суток измеряли некоторые биохимические параметры. Темп изменения режима выращивания оказывал значительное влияние на выживаемость клеток. Клетки, выращенные в среде, содержащей 2,0 М NaCl, а затем перенесенные в среду, содержащую 3,0 и 4,0 М NaCl, не меняли окраску и оставались зелеными во время адаптации. Но клетки, выращенные в среде, содержащей 0,5 М NaCl, а затем перенесенные в среду, содержащую 4,0 М NaCl, через 5-б дней обретали желто-бурую окраску.
Ростовые кривые для клеток D. salina, культивируемых при пяти различных концентрациях NaCl, представлены на рисунке 1. Основными различиями между культурами являются продолжительность лаг-периода и конечная плотность клеток. В течение 18 дней непрерывного культивирования плотность суспензии постоянно увеличивалась. На 18-й день культивирования плотность суспензии вышла на стационарный уровень, после чего плотность культуры начинала постепенно снижаться. Предполагается, что данное явление наблюдалось из-за лимитирования в образовавшихся условиях биогенных элементов. Замедление роста D. salina при повышении концентрации NaCl в среде описывалось ранее [3; 12]. Полученные данные свидетельствуют о том, что повышение концентрации соли в среде культивирования вызывает замедление и даже прекращение деления клеток D. salina. Анализ кривых роста водорослей показал, что оптимальной концентрацией NaCl в среде для роста и развития D. salina является 2,0 М.
При повышении концентрации NaCl в среде происходит заметное изменение содержания хлорофиллов a и b, каротиноидов в расчете на одну клетку (табл. 1). При повышении концентрации NaCl в среде от 0,5 до 2,0 М количество хлорофиллов a и b постепенно увеличивается и достигает своего максимума при 2,0 М. Результаты, полученные нами, согласуются с литературными данными, полученными ранее Масюк и Абдуллаевым [1; 3]. Авторы показали, что оптимальной концентрацией NaCl в среде для роста и развития Dunaliella в культуре является 2,0 М. При повышении концентрации NaCl от 2,0 до 4,0 М количество хлорофиллов a и b уменьшается. Как показали эксперименты, увеличение концентрации NaCl приводит к повышению содержания каротиноидов. Содержание каротиноидов увеличивается в 5,8 раза в расчете на одну клетку и в 1,8 раза - на 1 мл суспензии водорослей по сравнению с контролем (0,5 М NaCl).
Время (сутки)
Рис. 1. Ростовые кривые клеток Б. salina, культивируемых при различных концентрациях КаС1
Таблица 1
Содержание пигментов Б. salina, культивируемых в условиях различных концентраций ЫаС1
Концентрация МаС1 в среде, М Единица измерения Хлорофилл а Хлорофилл Ь Хлорофилл (а+Ь) Каротиноид^і
0,5 мг/клетка мг/мл 2,41 х 10-9 9,26 х 10-3 1,08 х 10-9 4,19 х 10-3 3,49 х 10-9 13,45 х 10-3 0,27 х 10-9 1,07 х 10-3
1,0 мг/клетка мг/мл 2,44 х 10-9 8,91 х 10-3 1,03 х 10-9 3,77 х 10-3 3,47 х 10-9 12,68 х 10-3 0,32 х 10-9 1,18 х 10-3
2,0 мг/клетка мг/мл 2,96 х 10-9 8,46 х 10-3 1,29 х 10-9 3,69 х 10-3 4,25 х 10-9 12,15 х 10-3 0,40 х 10-9 1,13 х 10-3
3,0 мг/клетка мг/мл 2,67 х 10-9 6,56 х 10-3 1,25 х 10-9 3,08 х 10-3 3,92 х 10-9 9,64 х 10-3 1,47 х 10-9 3,61 х 10-3
4,0 мг/клетка мг/мл 0,71 х 10-9 0,91 х 10-3 0,65 х 10-9 0,83 х 10-3 1,36 х 10-9 1,74 х 10-3 1,56 х 10-9 2,00 х 10-3
Таблица 2
Интенсивность выделения и поглощения кислорода клетками Б. salina в питательных средах с разным содержанием ^С1
Концентрация МаС1 в среде, М Единица измерения Выделение О2 на свету Поглощение О2 в темноте
0,5 мкмоль О2/час на мг хл 191 ± 7 14 ± 2
% к контролю 100 100
1,0 мкмоль О2/час на мг хл 281 ± 9 78 ± 2
% к контролю 147 530
2,0 мкмоль О2/час на мг хл 293 ± 11 81 ± 1
% к контролю 153 553
3,0 мкмоль О2/час на мг хл 184 ± 8 86 ± 2
% к контролю 97 585
4,0 мкмоль О2/час на мг хл 45 ± 5 38 ± 4
% к контролю 24 262
Предполагают, что каротиноиды осуществляют передачу энергии хлорофиллу, участвуют в транспорте электронов и кислорода, выполняют функции защиты клеток от фотоокисления [4]. Ранее было показано, что интенсивность фотосинтеза у D. salina снижается под влиянием высоких концентраций NaCl в результате уменьшения соотношения хлорофиллы/каротиноиды [3; 7]. Результаты опытов по влиянию высокой концентрации соли на интенсивность фотосинтеза и дыхания D. salina представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, при повышении содержания NaCl в культивируемой среде до 2,0 М интенсивность фотосинтеза достигает максимума. Дальнейшее увеличение концентрации соли до 3,0 и 4,0 М приводит к резкому подавлению фотосинтеза. Если поглощение кислорода в пределах 1,0-3,0 М NaCl остается практически без изменений, то при увеличении концентрации до 4,0 М приводит к более резкому подавлению как выделения, так и поглощения кислорода. Сравнивая динамику кислородного обмена с динамикой пигментов в зависимости от концентрации NaCl в среде, можно заключить, что имеется определенная связь между интенсивностью фотосинтеза и содержанием пигментов.
Замечательным свойством растений является их способность к индукции активности своих антиоксидантных систем в неблагоприятных условиях. Обычно это происходит за счет увеличения активности отдельных компонентов этой системы, но иногда индуцируется сразу несколькими компонентами. Нами исследовалось изменение активности и множественных молекулярных форм каталазы при различных концентрациях соли.
Большое количество Н2О2 генерировалось в клетках D. salina, выращенных в среде, содержащей 3,0 и 4,0 М NaCl (рис. 2). Предполагается, что Н2О2 выполняет в тканях растений роль вторичного мессенджера [13; 19]. В детоксикации Н2О2 важную роль играют КАТ и ферменты аскорбат-глутатионового цикла (АПО, АР и ГТР).
Рис. 2. Содержание Н202 клеток Б. salina, выращенных в условиях различной концентрации ЫаС1
0,5 1,0 2,0 3.0 4,0
[N30]. М
В результате стресса в клетках В. salina возрастала активность КАТ (рис. 3). В клетках, растущих в условиях 0,5 М ЫаС1, обнаруживается некоторая активность каталазы, но очень низкая (0,0972 мкмоль/мин в расчете на 1 мг белка), а в клетках, растущих в условиях 4,0 М концентрации ЫаС1, активность КАТ увеличивается более чем в 5,8 раза (0,5703 мкмоль/мин в расчете на 1 мг белка).
Повышение активности фермента в условиях засоления можно объяснить повышением содержания Н2О2. КАТ, осуществляя согласованный механизм детоксикации на клеточном уровне, разрушает в организмах избыточное количество И202. В этом процессе осуществляется важная защитная функция КАТ для живых организмов. Ранее в неко-
торых работах изучалось влияние засухи и солевого стресса на активность каталазы. Так, в условиях солевого стресса отмечено увеличение активности КАТ в листьях толерантного сорта ягоды (Могия 5Р-), в корнях и листьях риса (Отж яаґіуа), в митохондриях и периксисомах листьев толерантного сорта томатов (Ьуеоретоп реппеїііі) [10; 17; 18]. Таким образом, устойчивые растения имеют более эффективную систему защиты, что обеспечивает возможность функционирования в условиях стресса.
3,5 1.0 2.0 3.0 4.0
[№СП, и
Рис. 3. Изменение активности каталазы клеток Рис. 4. Электрофоретические спектры
Б. salina, выращенных в условиях различной каталазы клеток Б. salina, выращенных
концентрации ^С1 в условиях различной концентрации ^С1
По литературным и нашим данным, повышение концентрации соли в среде культивирования сопровождалось изменением не только активности ферментов, но и их электрофоретических спектров. По электрофоретическим спектрам каталазы клеток
В. salina выявлены три формы фермента (рис. 4). Анализ множественных форм КАТ показал, что повышение концентрации ЫаС1 в культивируемой среде приводит к уменьшению интенсивности линии КАТ 2, к усилению интенсивности линий КАТ 1 и КАТ 3. Высокая гетерогенность каталазы наблюдается при более высоких концентрациях ЫаС1. Это свидетельствует о том, что количественные и качественные изменения множественных молекулярных форм каталазы в клетках В. salina обеспечивают способность растительного организма сохранять жизненные функции даже в экстремальных условиях [8].
Выводы
Биохимические исследования позволили оценить энзиматическую активность КАТ в клетках, культивируемых при различных концентрациях №С1, сопоставить изменения этого показателя с физиологическими и морфологическими процессами. Каталаза играет важную роль в защите клеток от окислительных повреждений в условиях роста и развития растений, а также при действии неблагоприятных факторов окружающей среды. Значительная вариабельность в изменении активности КАТ в стрессовых условиях может быть использована в качестве «белковых маркеров» на стресс-устойчивость.
Библиографические ссылки
1. Абдуллаев А. А. Интенсивная культура Dunaliella salina Теой, некоторые ее физиологические характеристики / А. А. Абдуллаев, В. Е. Семененко // Физиол. растений. - 1974. - Т. 21, вып. 6. - С. 1145-1151.
2. Гришина Г. С. Биофизические методы в физиологии. - М. : Наука, 1971. - С. 38-43.
3. Масюк Н. П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. и перспективы его практического использования. - К. : Наукова думка, 1973.
4. Миронюк В. И. Особенности некоторых окислительно-восстановительных систем зеленой водоросли Dunaliella salina Teod. : Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - К., 1969.
5. Аbd El-Baky H. H. Production of antioxidant by the green alga Dunaliella salina. I H. H. Аbd El-Baky, F. K. El Baz, G. S. El-Baroty II Int. J. Agri. Biol. - 2004. - Vol. 6. - P. 49-57.
6. Anderson M. Changes in isozyme profiles of catalase, peroxidase and glytathione reductase during acclimation to chilling in mesocotyls of maize seedlings I M. Anderson, T. K. Prasad, C. R. Stewart II Plant Physiol. - 1995. - Vol. 109. - P. 1247-1257.
7. Cifuentes A. S. The effect of salinity on the growth and carotenogenesis in two Chilean strains of Dunaliella salina Teodoresco I A. S. Cifuentes, M. Gonzalez, O. Parra II Biol. Res. - 1996. -Vol. 29. - P. 227-236.
S. Drought controls on H2O2 accumulation, catalase (CAT) activity and CAT gene expression in wheat I
C. M. Luna, G. M. Pastori, S. Driscoll et al. II J. of Exp. Botany. - 2004. - Vol. 56. - P. 417-423.
9. Enhanced photosynthesis and redox energy production contribute to salinity tolerance in Dunaliella salina as revealed by homology-based proteomics I A. Liska, A. Shevchenko, U. Pick, A. Katz II Plant Physiol. - 2004. - Vol. 136. - P. 2806-2817.
10. Khan M. H. Changes in antioxidant levels in Oruza sativa L. roots subjected to NaCl-salinity stress I M. H. Khan, K. L. B. Singha, S. K. Panda II Acta Physiol. Plantarum. - 2002. - Vol. 24. - P. 145-148.
11. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 II Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
12. Nikookar K. Influance of salinity on the growth, pigmentation and ascorbate peroxidase activity of Dunaliella salina isolated from Maharlu salt lake in Shiraz I K. Nikookar, A. Moradshahi, M. Knarati II Iranian J. of Sci and Techn. - 2004. - Vol. 28. - P. 117-125.
13. Orozco-Cardenas M. L. Hydrogen peroxide acts as a second messenger for the induction of defence genes in tomato plants in response to wounding systemin and methyl jasmonate I M. L. Orozco-Cardenas, J. Narvaez-Vasquez, C. A. Ryan II Plant Cell. - 2001. - Vol. 13. - P. 179-191.
14. Protein measurement with the folin phenol reagent I O. H. Lowry, N. J. Roserbrough, A. J. Farr, R. J. Randall II J. Biol. Chem - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.
15. Relationships between antioxidant defence systems and salt tolerance in Solanum tuberosum I M. P. Benavides, P. L. Marconi, S. M. Gallego et al. II Aust. J. Plant Physiol. - 2000. - Vol. 27. -P. 273-278.
16. Rios-Gonzales K. The activity of antioxidant enzymes in maize and sunflower seedlings as affected by salinity and different nitrogen sources I K. Rios-Gonzales, L. Erdei, S. H. Lips II Plant Sci. - 2002. -Vol. 162. - P. 923-930.
17. Salinity effects of antioxidant enzymes in Mulberry cultivar I P. Harinasut, D. Poonsopa, K. Roengmongkol, R. Charoensataporn II Science-Asia. - 2003. - Vol. 29. - P. 109-113.
18. Salinity up-regulates the antioxidative systems in root mitochondria and peroxisomes of the wild salt-tolerant tomato species Lycopersion pennellii I V. Mittova, M. Guy, M. Tal, M. Volokita II J. of Exp. Botany. - 2004. - Vol. 55. - P. 1105-1113.
19. Shin R. Hydrogen peroxide mediates plant root cell response to nutrient deprivation I R. Shin,
D. P. Schachtman I PNAS. - 2004. - Vol. 101. - P. 8827-8832.
20. Sims D. A. Relationships between leaf pigment content and spectral reflectance across a wide range of speciec, leaf structures and developmental stages I D. A. Sims, Y. A. Gamon II Remote Sensing of Environment. - 2002. - Vol. 81. - P. 337-354.
21. Velikova V. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain - treated bean plants. Protective role of exogenous polyamines I V. Velikova, I. Yordanov, A. Edreva II Plant Sci. - 2000. -Vol. 151. - P. 59-66.
Надійшла до редколегії 12.04.2009
