CC BY
17УДК 582.28
ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ АВО ГРУПП И ЕЕ МОДИФИКАЦИЯ НА ГЕММАГЛЮТИНИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕКТИНОВ FUSARIUM SOLANI
1Риш.С. Мухаммадиев - аспирант, 1Рин.С. Мухаммадиев - аспирант; 1Т.В.Багаева - доктор биологических наук, профессор; 2Л.Р. Валиуллин - кандидат биологических наук, зав сектором;
2К.Х.Папуниди - доктор ветеринарных наук, профессор, замдиректора.
ФГБОУ ВО«Казанский (Приволжский) федеральный университет», г.Казань (420008, г.Казань, Кремлевская, 18, тел. +7(843) 233-71-09, e-mail:public.mail@kpfu.ru).
2ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научный городок-2, тел. +7 (843) 239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru).
Проведено исследование 18 изолятов грибов, принадлежащих к виду Fusarium solani, на способность синтезировать поверхностные лектины. Обнаружены существенные различия активности лектинов мицелия в зависимости от штамма гриба. Среди фитопатогенных и сапрофитных изолятов F.solani, 15 из них продуцируют соединения, относящиеся к агглютининам. Штаммы грибов F.solani и F.solani 6 отличались от остальных штаммов способностью образовывать лектины с более высокой гемагглютинирующей активностью (титр 64 и титр 128). Ферментативная обработка трипсином, проназой и нейраминидазой эритроцитов приводила к увеличению гемагглютинирующей способности лектинов микромицетов. Обработка эритроцитов трипсином усиливала степень связывания поверхностных лектинов с эритроцитами в 2-4 раза, в то время как нейраминидазная обработка повышала в 2-32 раза. Наибольшая чувствительность эритроцитов в реакции гемагглютинации с лектинами наблюдалось после обработки проназой. Гемагглютинирующая активность лектинов была в 2-64 раза выше с проназа-обработанными эритроцитами по сравнению с нативными. Данная модификация позволила дополнительно выявить активность агглютининов у изолятов микромицетов F.solani 9, F.solani 11 и F.solani 16. Значительной была обработка, как и в случае с обработкой нейраминидазой, для поверхностных агглютининов F.solani 1, F.solani 8 и F.solani 12.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: микромицеты, Fusarium solani, поверхностные лектины, активность.
Среди существенного числа исследуемых биообъектов, в последнее время низшие грибы представляют наибольший интерес для исследователей, в связи с тем, что многие из них способны синтезировать различные биологически активные соединения: гидролитические ферменты, аминокислоты, витамины, антибиотики, фитогормоны и токсины [1]. Потенциал микромицетов огромен, постоянно открываются новые соединения с уникальными свойствами. Отдельные микромицеты продуцируют метаболиты, которые другие организмы не способны синтезировать или синтезируют в незначительном количестве. К одной из групп таких соединений, продуцируемых микромицетами, относятся углевод-свя-зывающие белки, или лектины [2].
Лектины представляют собой моно-, мультива-лентные белки или гликопротеины, способные агглютинировать клетки и с высокой специфичностью распознавать и обратимо связывать разнообразные углеводные структуры, при этом не вызывая в них химических изменений [2]. Лектины привлекают внимание как вещества, которые обладают противови-
русным, антимикробным [3], противоопухолевым [4] и иммуностимулирующим действиями [5].
За счет своей способности избирательно взаимодействовать с углеводными структурами, они способны принимать участие в различных процессах, на разных уровнях живого организма, среди них: межклеточные взаимодействия, адгезия к поверхности клеток, регуляция внутриклеточного транспорта, контроль дифференциации тканей, как сигнальные молекулы при ответных реакциях [6]. Тем не менее, биологические функции большинства лектинов до сих пор остаются не изученными.
Лектины широко распространены в природе и выделены у представителей всех царств, включая вирусы, бактерии, грибы, актиномицеты, растения, беспозвоночных и позвоночных животных [7]. Среди микромицетов образование лектинов установлено для таких видов, как Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Aspergillus fumigatus, Arthrobotrys oligospora [8, 9, 10]. Известно, что лектины микроскопических грибов составляют до 35% от общего растворимого белка и принимают возможное участие в морфоге-
незе и развитие гриба, микропаразитизме и антагонизме [1, 9, 11].
Тем не менее, к настоящему времени информация об углевод-связывающих белках микромицетов весьма ограничена [2]. В литературе имеется лишь незначительное количество работ, связанных с изучением лектинов микромицетов рода Fusarium и отсутствуют данные о поверхностных агглютининах Fusarium solani. Однако данные микроорганизмы играют существенную роль в развитии наиболее значимых и распространенных заболеваний сельскохозяйственных растений, а лектины выступают первыми соединениями, участвующими в этом процессе.
В ранее осуществленных нами исследованиях был проведен скрининг микромицетов родов Botrytis, Bipolaris, Phytophthрora, Fusarium, Alternaría, Cephalosporium, Trichoderma на способность к синтезу внутриклеточных, мицелиальных лектинов [12].
Целью настоящей работы явилось исследование способности грибов Fusarium solani продуцировать поверхностные лектины мицелия.
Материалы и методы. В исследованиях использовались штаммы микромицетов Fusarium solani, которые были выделены из экологических ниш разных районов Республики Татарстан. Кроме того, в опытах использовали также музейные штаммы грибов данного вида кафедры биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университета. Фитопатогены F.solani 1 и F.solani 8 были выделены из клубней картофеля сорта Невский, остальные - из дерново-подзолистой почвы территории Республики Татарстан.
Мицелий исследуемых микромицетов получали выращиванием штаммов на картофельно-глюкоз-ной питательной среде при температуре 280С. Отбор проб мицелия производили на 7-е сут культивирования изолятов.
Извлечение поверхностных лектинов из мицелия грибов проводили по методике, предложенной в работе Сейалон-Делмас с соавторами [13].
Определение активности поверхностных лектинов осуществляли в реакции гемагглютинации (ГА) [11] на эритроцитах крови с помощью U-образных планшетов. В лунках планшета готовили серию последовательных двукратных разведений белкового экстракта лектинов по 25 мкл, в каждую лунку добавляли 25 мкл 2% суспензии эритроцитов и смесь инкубировали при 40С на 60 минут. Титр лектина выражали как минимальное содержание лектина в буфере, при которой еще наблюдается реакция агглютинации эритроцитов.
Эритроциты для реакции ГА получали с помощью методики Луцика с соавторами [14]. После отделения эритроцитов от плазмы, их трижды отмывали в десятикратном объеме Tris-HCI буфера (20 мМ,
рН 7,2). Для реакции гемагглютинации готовили 2% эритроцитарную суспензию в буферном растворе, которую хранили при 40С не более 24 часов.
Обработку эритроцитов ферментами проводили добавлением к осадку эритроцитов 1 группы крови растворов ферментов: нейраминидазы (0,2 ед/мл), трипсина и проназы (1 мг/мл). Для этого эритроциты трижды промывали солевым буферным раствором (рН 7,4), а затем осадок 1-го объема эритроцитов смешивали с 2-мя объемами растворов ферментов в концентрации 1 мг/мл в буфере, содержащий 0,15 М ЫаО! и 0,01 М Иа2СО3 (рН 8,0) [14]. Смесь инкубировали в течение 40 мин при 370С и эритроциты вновь отмывали путем трехкратного центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин в стандартном буферном растворе. Затем супернатант полностью удаляли и готовили 2% суспензию эритроцитов в том же буфере.
Результаты исследований. Для определения лектинов в биологических объектах обычно применяют тест на агглютинацию с эритроцитами крови человека или животных, либо используют тест на преципитацию с гликоконъюгатами [2]. В наших экспериментах мы использовали реакцию гемагглютинации лектинов с эритроцитами 1-4 групп крови, поскольку одним из основных биохимических свойств лектинов является их избирательное узнавание определенных углеводных детерминант, находящихся на поверхности мембран эритроцитов, служащих своеобразными рецепторами для взаимодействия с ними (табл.).
Как видно из таблицы, изоляты микромицетов, принадлежащие к виду F.solani были способны продуцировать поверхностные лектины различной степени гемагглютинирующей активности. Однако практически все лектины агглютинировали эритроциты всех групп крови, кроме поверхностного лектина фитопатогена F.solani 6, который избирательно взаимодействовал только с 1 группой крови и лектина фитопатогенного штамма F.solani 12 дополнительно проявлявший взаимодействие с 3 группой крови.
По данным литературы, белки способные проявлять специфичность к молекулам антигенов крови являются панагглютининами. Следовательно, лектины большинства из исследуемых микромицетов F.solani могут быть отнесены в данную группу.
В исследованиях, проведенных зарубежными авторами, установлено, что ферментативная обработка красных кровяных клеток приводит к их модификации, что повышает чувствительность реакции ГА [2, 11].
Исследования, проведенные нами, показали, что обработка эритроцитов ферментами трипсином, нейраминидазой и проназой приводила к увеличению степени связывания лектинов F.solani с клетками крови (рис.).
Таблица
Активность лектинов грибов Fusarium solani
Штамм, род, вид Поверхностные лектины, титр
1 группа 2 группа 3 группа 4 группа
F.solani 64 4 4 4
F.solani 1 16 64 16 16
F.solani 2 - - - -
F.solani 3 8 8 8 8
F.solani 4 2 2 2 2
F.solani 5 - - - -
F.solani 6 128 - - -
F.solani 7 2 2 2 2
F.solani 8 32 32 32 32
F.solani 9 - - - -
F.solani 10 4 4 4 4
F.solani 11 - - - -
F.solani 12 32 - 32 -
F.solani 13 8 8 8 8
F.solani 14 - - - -
F.solani 15 32 8 8 8
F.solani 16 - - - -
F.solani 17 16 16 16 16
Рис. Гемагглютинирующая активность лектинов Fusarium solani после ферментативной обработки эритроцитов.
Трипсиновая обработка эритроцитов увеличивала степень взаимодействия поверхностных лектинов с эритроцитами в 2-4 раза. Четырех кратное повышение титра активности наблюдали для агглютининов изолятов F.solani 1, F.solani 8 и F.solani 17. Активность остальных агглютининов микромицетов повышалась в 2 раза, кроме штаммов F.solani 4, F.solani 7 и F.solani 10, у которых гемагглютинирующая активность оставалась неизменной.
Нейраминидазная модификация эритроцитов повышала степень связывания эритроцитов с лек-тинами еще более значительно (2-32 раза). В данном случае, обработка ферментом повышала активность агглютинина изолята F.solani 1 в 32 раза, агглютининов F.solani 8 и F.solani 12 - в 16 раз. Обработка эритроцитов ферментом повышала активности поверхностных лектинов остальных микромицетов в 2-4 раза.
Наибольшее повышение степени взаимодействия лектинов с эритроцитами наблюдали после проназной обработки. Особенно существенна была обработка, как и с нейраминидазой, для поверхностных агглютининов F.solani 1 (64 раза), F.solani 8, F.solani 12 (32 раза). В остальных случаях опыта, обработка красных кровяных клеток протеазой повышала чувствительность реакции ГА агглютининов штаммов F.solani 13, F.solani 17в 16 раз, а для агглютининов штаммов F.solani и F.solani 15 - в 8 раз. Необходимо отметить, что данная обработка дополнительно выявила активность агглютининов у изолятов микромицетов F.solani 9, F.solani 11 и F.solani 16, у которых не наблюдалась реакция ГА с необработанными эритроцитами.
Значительное увеличение чувствительности реакции ГА после обработки эритроцитов протеолити-ческими ферментами (трипсином и проназой), скорее всего, связана с удалением гликопротеидов на поверхности эритроцитов, что приводит к высвобождению углеводных групп и к более лучшему связыва-
нию клеток крови агглютининами. Нейраминидазная модификация эритроцитов, по-видимому, отщепляла сиаловые кислоты, расположенные на поверхности клеток, открывая остатки галактозы гликопротеидов. Полученные результаты имеют общее сходство как с нашими, так и зарубежными исследованиями лекти-нов микромицетов, в которых было установлено, что ферментативная обработка красных кровяных клеток приводит к существенному усилению их чувствительности в реакциях с лектинами.
Заключение. Исследование изолятов грибов Республики Татарстан показало, что большинство поверхностных лектинов микромицетов вызывали агглютинацию эритроцитов независимо от группы крови. Модифицированные ферментами эритроциты значительно повышали чувствительность реакции прямой гемагглютинации лектинов исследуемых ми-кромицетов. Наиболее эффективной модификацией эритроцитов, повышающей уровень гемагглютини-рующей активности лектинов микромицетов, является обработка их ферментом проназой.
Литература
1. Алимова, Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma / Ф.К.Алимова. - Казань: УНИПРЕСС ДАС, 2006. - 268 с.
2. Khan, F. Fungal lectins: Current molecular and biochemical perspectives / F.Khan, M.Khan // Int. J. Biol. Chem. -2011. - Vol. 5, № 1. - P. 1-20.
3. Isolation and homodimeric lectin with antifungal and antiviral activities from red kidney bean (Phaseolus vulgaris) seeds / X.Ye, T.Ng, P.Tsang, J.Wang // J. Protein Chem. - 2001. - Vol. 20, № 5. - P. 367-375.
4. First isolation and characterization of a novel lectin with potent antitumor activity from a Russula mushroom / G.Zhang, J.Sun, H.Wang, T.Ng // Phytomedicine. - 2010. - Vol. 17, № 10. - P. 775-781.
5. She, Q. A novel lectins with potent immunomodulatory activity isolated from both fruiting bodies and cultured mycelia of the edible mushroom Volvariella volvacea / Q.She, T.Ng, W.Liu // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. -Vol. 247, № 1. - P. 106-111.
6. Маменко, П. Н. Функции лектинов растений при абиотических и биотических стрессах / П.Н.Маменко // Физиология растений и генетика. - 2014. - Том. 46, № 2. - С. 95-107.
7. Sharon, N. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules / N.Sharon, H.Lis // Glycobiology. - 2004. - Vol. 14, № 11. - P. 53-62.
8. Barak, R. The properties of L-fucose-binding agglutinin associated with the cell wall of Rhizoctonia solani / R.Barak, YElad, I.Chet // Archives of Microbiology. - 1986. - Vol. 144. - P. 346-349.
9. Barak, R. Lectins: a possible basis for specific recognition in the interaction of Trichoderma and Sclerotium rolfsii / R.Barak, D.Mirelman, I.Chet // Phytopathology. - 1985. - Vol. 75, № 4. - P. 458-462.
10. A soluble fucose-specific lectin from Aspergillus fumigatus conidia-structure, specificity and possible role in fungal pathogenicity / J.Houser [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, № 12. - P. 1-15.
11. Singh, R.S. Screening of Aspergillus species for occurrence of lectin activity and their characterization / R.S.Singh, A.K.Tiwary, R.Bhari // J. Basic Microbiol. - 2008. - Vol. 48. - P. 112-117.
12. Muhammadiev, R.S. Mycelial and Extracellular Lectins of Lower Fungi / R.S.Muhammadiev, T.V.Bagaeva // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2015. - Vol. 6, № 6. - P. 1737-1743.
13. Purification, elicitor activity, and cell wall localisation of a glycoprotein from Phytophthora parasitica var. nicotianae, a fungal pathogen of tobacco / N.Sejalon-Delmas [et al.] // Phytopathology. - 1997. - Vol. 87, № 9. - P. 899-909.
14. Луцик, М.Д. Лектины / М.Д.Луцик, Е.Н.Панасюк, А.Д.Луцик. - Львов: Высшая школа, 1981. - 156 с.
INFLUENCE OF SURFACE ERYTHROCYTES ABO GROUPS AND ITS MODIFICATION ON HEMAGGLUTINATING ACTIVITY OF LECTINS OF FUSARIUM SOLANI
Mukhammadiev Rich.S. - postgraduate; Mukhammadiev Rin.S. - postgraduate; 1Bagaeva T.V. - Doctor of Biological Sciences, professor; 2Valiullin L.R. - Candidate of Biological Sciences; 2Papunidi K.Kh. - Doctor of Veterinary Sciences, professor.
1Kazan Federal University, Kazan (e-mail: public.mail@kpfu.ru).
2Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
In the present study, eighteen isolates of fungi belonging to Fusarium solani, were screened for the presence of surface lectins. All the fungal isolates showed different degree of activity of surface lectins depending on fungal strain. Among pathogenic and nonpathogenic isolates of F.solani fifteen of them were found to possess lectin activity. Fungal isolates of F.solani and F.solani 6 indicated the presence of high lectin activity (titre 64 and titre 128, respectively) compared to the other strains. Trypsin, pronase and neuraminidase treatment of erythrocytes increased the sensitivity to hemagglutination by fungal lectins. Trypsin treatment increased the degree of binding of surface lectins to erythrocytes by 2-4 times, while neuraminidase treatment increased by 2-32 times. The highest level of lectin activity was observed after treatment with pronase. The lectin activity was 2-64 times higher with pronase treated erythrocytes than with untreated ones. This modification of erythrocytes allowed to reveal the activity of agglutinins in the isolates of fungi F.solani 9, F.solani 11 and F.solani 16. Treatment of erythrocytes like in case of neuraminidase treatment has shown significant impact on surface agglutinins of F.solani 1, F.solani 8 and F.solani 12.
KEYWORD: fungi, Fusarium solani, surface lectins, activity.
References
1. Alimova, F.K. Promyshlennoe primenenie gribov roda Trichoderma [Industrial application of Trichoderma fungi] /
F.K.Alimova. - Kazan: UNIPRESS DAS, 2006. - 268 p.
2. Khan, F. Fungal lectins: Current molecular and biochemical perspectives / F.Khan, M.Khan // Int. J. Biol. Chem. -2011. - Vol. 5, № 1. - P. 1-20.
3. Isolation and homodimeric lectin with antifungal and antiviral activities from red kidney bean (Phaseolus vulgaris) seeds / X.Ye, T.Ng, P.Tsang, J.Wang // J.Protein Chem. - 2001. - Vol. 20, № 5. - P. 367-375.
4. First isolation and characterization of a novel lectin with potent antitumor activity from a Russula mushroom /
G.Zhang, J.Sun, H.Wang, T.Ng // Phytomedicine. - 2010. - Vol. 17, № 10. - P. 775-781.
5. She, Q. A novel lectins with potent immunomodulatory activity isolated from both fruiting bodies and cultured mycelia of the edible mushroom Volvariella volvacea / Q.She, T.Ng, W.Liu // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - Vol. 247, № 1. - P. 106-111.
6. Mamenko, P. N. Funktsii lektinov rastenij pri abioticheskih i bioticheskih stressah [Lectins functions of plants at abiotic and biotic stresses] / P.N.Mamenko // Fiziologiya rastenij i genetika. - 2014. - Tom. 46, № 2. - P. 95-107.
7. Sharon, N. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules / N.Sharon, H.Lis // Glycobiology. - 2004. - Vol. 14, № 11. - P. 53-62.
8. Barak, R. The properties of L-fucose-binding agglutinin associated with the cell wall of Rhizoctonia solani / R.Barak, YElad, I.Chet // Archives of Microbiology. - 1986. - Vol. 144. - P. 346-349.
9. Barak, R. Lectins: a possible basis for specific recognition in the interaction of Trichoderma and Sclerotium rolfsii / R.Barak, D.Mirelman, I.Chet // Phytopathology. - 1985. - Vol. 75, № 4. - P. 458-462.
10. A soluble fucose-specific lectin from Aspergillus fumigatus conidia-structure, specificity and possible role in fungal pathogenicity / J.Houser [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, № 12. - P. 1-15.
11. Singh, R.S. Screening of Aspergillus species for occurrence of lectins activity and their characterization / R.S.Singh, A.K.Tiwary, R.Bhari // J. Basic Microbiol. - 2008. - Vol. 48. - P. 112-117.
12. Muhammadiev, R.S. Mycelial and Extracellular Lectins of Lower Fungi / R.S.Muhammadiev, T.V.Bagaeva // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2015. - Vol. 6, № 6. - P. 1737-1743.
13. Purification, elicitor activity, and cell wall localisation of a glycoprotein from Phytophthora parasitica var. nicotianae, a fungal pathogen of tobacco / N.Sejalon-Delmas [et al.] // Phytopathology. - 1997. - Vol. 87, № 9. - P. 899-909.
14. Lutsik, M.D. Lektiny [Lectins] / M.D.Lutsik, E.N.Panasyuk, A.D.Lutsik. - Lvov: Vysshaya shkola, 1981. - 156 p.
