CC BY
43
Труды Карельского научного центра РАН № 2. 2010. С.62-67
УДК 591.542: 591.1: 599.323.4
ВЛИЯНИЕ ПОСТОЯННОГО ОСВЕЩЕНИЯ НА АНТИОКСИДАНТНУЮ СИСТЕМУ КРЫС ЗАВИСИТ ОТ ВОЗРАСТА ЖИВОТНЫХ
Е. А. Хижкин1, Т. Н. Ильина1, Т. А. Лотош2,
В. А. Илюха1’ 2, И. А. Виноградова2, В. Н. Анисимов3
1 Институт биологии Карельского научного центра РАН
2 Петрозаводский государственный университет
3 НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова Росмедтехнологий
Исследована активность антиоксидантных ферментов и содержание токоферола в различных органах, а также продолжительность жизни крыс, подвергавшихся воздействию постоянного освещения с месячного и четырнадцатимесячного возраста. Установлено, что влияние постоянного освещения начиная с 14-месячного возраста способно приводить к более позднему «старению» антиоксидант-ной системы, что, возможно, является одной из причин продления жизни животных. Содержание животных с месячного возраста при постоянном освещении оказывает противоположное воздействие на компоненты АОС и сопровождается сокращением жизни крыс.
Ключевые слова: постоянное освещение, антиоксидантная система, продолжительность жизни.
E. A. Khizhkin, T. N. Ilyina, T. A. Lotosh, V. A. Ilukha, I. A. Vinogradova, V. N. Anisimov. EFFECT OF CONTINUOUS LIGHT ON RATS ANTIOXIDANT SYSTEM IS DEPEND ON ANIMALS AGE
We evaluated the effect of exposure to constant light started at the age of 1 month and at the age of 14 months on the survival, life span and age-related dynamics of activity antioxidant enzymes and level of a-tocopherol in various organs in comparison to the rats maintained at the standard (12 : 12) light/dark regimen. The exposure to constant light started at the age of 14 months delayed aging of enzymatic and non-enzymatic component of antioxidant defence system that, probably, is one of the reasons of prolongation of a life span of animals. Circadian disruption induced by light-at-night started at the age of 1 month accelerates aging.
Key words: light-at-night, antioxidant enzymes, life span.
Введение
Открытие чуть более полувека назад мела-тонинсекретирующей роли эпифиза привело к интенсивному изучению физиологических функций этого органа, ранее считавшегося рудиментарным. Установленные для мелатонина уникальные антиоксидантные свойства позво-
лили возвести эпифиз в ранг органов, контролирующих не только формирование различных биологических ритмов, но и процесс старения, по крайней мере, у млекопитающих [Р1еграо!1, ВиИап, 2001]. Несмотря на то что свет является практически единственным экологическим фактором, обладающим четко выраженной суточной и сезонной периодичностью, физиоло-
0
гические механизмы его влияния на организм млекопитающих выяснены слабо [Анисимов, 2008]. Практически одновременно с открытием мелатонина получила свое распространение, а чуть позже и подтверждение свободнорадикальная теория старения Хармана - Эмануэля [Harman, 1956; Эмануэль, 1975]. Два открытия позволили модулировать с помощью различных световых режимов как состояние антиокси-дантной системы (АОС), так и влияние на продолжительность жизни. Было обнаружено, что продолжительность жизни животных отрицательно коррелирует с уровнем основного метаболизма и аутоокисляемостью тканей [Dowling, Simmons, 2009], а одним из способов защиты клеток от действия активных форм кислорода является повышение или восстановление активности антиоксидантных ферментов (АОФ), в том числе и в результате их синтеза de novo [Gutteridge, 1995].
Однако нерешенным остается вопрос, связанный, прежде всего, с моментом начала воздействия постоянного освещения, вызывающего функциональное «выключение» пинеальной железы. В литературе имеются сведения о том, что эпифиз в определенные возрастные периоды способен запускать внутреннюю «программу» старения организма [Pierpaoli, Bulian, 2001, 2005].
Целью нашего исследования было изучение влияния постоянного освещения, воздействие которого начиналось в возрасте одного (период становления репродуктивной функции) и четырнадцати (время начала снижения синтеза половых гормонов и «старения» многих физиологических функций) месяцев, на активность АОФ - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, содержание токоферола в органах, а также на продолжительность жизни крыс.
Материалы и методы
Опыт проводили на самцах и самках крыс линии ЛИО, содержавшихся на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде. Были сформированы 3 группы животных: первая содержалась в стандартных условиях освещения в течение всей жизни (12 часов свет/ 12 часов темнота; LD) и являлась контрольной, вторая и третья - при постоянном освещении с возраста одного месяца (LL-1) и 14 месяцев (LL-14), соответственно.
У крыс первых двух групп (LD и LL-1) образцы тканей печени, почек, сердца отбирали после декапитации в 6, 12, 18 и 24 месяца, у животных третьей группы (LL-14) - в 15, 18, 24 и 30 месяцев. Определение активности фермен-
тов проводили спектрофотометрически: СОД по модифицированной адренохромной методике [Misra, Fridovich, 1972], каталазы - по количеству разложенной перекиси водорода [Bears, Sizer, 1952]. Концентрацию токоферола определяли методом ВЭЖХ [Скурихин, Двинская, 1989]. Оценивали различные показатели, характеризующие продолжительность жизни в каждой из групп: среднюю продолжительность жизни (СПЖ), СПЖ последних 10 % крыс и максимальную продолжительность жизни (МПЖ) животных. Полученные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики, сравнение проводили с применением непараметрического критерия Вилкоксо-на - Манна - Уитни, влияние факторов оценивали с использованием дисперсионного анализа [Коросов, Горбач, 2007]. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС), «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Биоэтических правил проведения исследований на человеке и животных».
Результаты и обсуждение
Установлено, что с возрастом происходит в разной степени выраженное рассогласование в работе ферментов антиоксидантной системы у крыс первых двух групп. В печени и почках крыс групп LD и LL-1 отмечено снижение активности СОД к 12 месяцам с последующим увеличением к 18-месячному возрасту, тогда как активность каталазы, наоборот, повышалась у 12-месячных крыс и снижалась к 18 месяцам. В отличие от этого, у крыс, содержавшихся при постоянном освещении с 14 месяцев, наблюдалась синхронность изменений активности ферментов - при увеличении активности СОД возрастала и активность каталазы. Для этих ферментов в обоих органах зарегистрирована сезонная цикличность изменений активности. При сохранении этой цикличности у группы LL-14 наблюдалась и более высокая активность обоих ферментов, причем ее максимальные значения отмечались в двухлетнем возрасте, а не в 12 и 18 месяцев, как это происходило в первых двух группах (рис. 1, 2).
В сердечной мышце у крыс, содержавшихся в условиях стандартного и постоянного освещения с месячного возраста, активность СОД снижалась уже к первому году и сохранялась на этом уровне в течение дальнейшей жизни. У крыс, находившихся при постоянном освещении с 14 месяцев, активность этого фермен-
0
та начиная с 18 месяцев резко увеличивалась и среднее ее значение к 30 месяцам более чем в 7 раз превышало таковое у 15-месячных животных (рис. 3). Активность каталазы в сердце крыс группы 1_Ь-1 несколько увеличивалась к 18 месяцам, тогда как ее активность у крыс группы 1_Ь-14 повышалась к 24 месяцам.
Возраст, мес.
-LD
Возраст, мес.
В
Возраст, мес.
Рис. 1. Возрастные изменения активности СОД (А), каталазы (Б) и содержания токоферола (В) в печени крыс, содержавшихся в различных режимах освещения:
1_й - стандартное освещение, 1_Ы - постоянное освещение с месячного возраста, 1_Ь-14 - постоянное освещение с 14 месяцев; * - различия достоверны по сравнению с животными, содержавшимися при 1_й, 0 - различия достоверны по сравнению с животными, содержавшимися при 1_Ы
Снижение активности АОФ, свидетельствующее о «старении» АОС, в органах крыс, с 14 месяцев содержавшихся в условиях постоянного освещения, происходило позже (24 месяца), чем у животных, которые находились при
стандартном и постоянном освещении с месячного возраста. Активность как СОД, так и каталазы в большинстве органов 24-месячных крыс группы 1_Ь-1 была ниже по сравнению с их активностью у животных того же возраста группы 1_Ь-14.
При изучении состояния АОС необходимо не только учитывать изменения, касающиеся ан-тиоксидантных ферментов, но и принимать во внимание ее неферментативный компонент. Было установлено, что содержание токоферола в органах крыс, так же как и активность АОФ, различалось в зависимости от сроков начала экспериментальных воздействий. При этом возрастное снижение концентрации токоферола в органах крыс, находившихся в группах 1_Э и 1_Ь-1, наступало раньше, чем у животных 1_Ь-14 (рис. 1-3).
.-1
.-14
10 15 20
Возраст, мес.
Рис. 2. Возрастные изменения активности СОД (А), каталазы (Б) и содержания токоферола (В) в почках крыс, содержавшихся в различных режимах освещения: усл. обозн. см. на рис. 1
0
Одним из интересных, на наш взгляд, фактов была обнаруженная сезонность в изменении активности АОФ, с учетом того, что крысы достаточно долгое время разводятся в лабораторных условиях. Влияние сезона на активность СОД наблюдалось в сердце, а каталазы - в печени и почках. Содержание витамина Е под влиянием этого фактора изменялось только в сердце. Кроме того, как и предполагалось, существенное влияние оказывало время начала светового воздействия (табл. 1).
Таблица 1. Оценка влияния различных факторов на активность антиоксидантных ферментов и содержание токоферола
Органы
Воз-
раст
Факторы
Сезон
Режим
освеще-
ния
Печень
Сердце
Печень
Почки
СОД
Время начала светового воздействия
17,6 %
6,67 0,0025 Каталаза
9.1 %
11.01 0,0016
9,1 % 15,2 0,0003
30,8 %
25,58 0,0001 14,0%
7,84 0,001 Витамин Е
20,1 % 33,34 0,0001
25,5 % 26,02 0,0001
32,2 % 53,47 0,0001
Печень 12,2 % 8,1%
8,03 - 5,33 -
0,007 0,03
Почки 11,8 % 24,3 %
8,53 - - 17,59
0,005 0,0001
Сердце 9,4 % 8,1% 21,6 %
8,09 7,02 - 18,61
0,006 0,01 0,0001
Примечание. Данные представлены в виде степени влияния, в %, критерия Фишера и уровня значимости. Указаны только достоверно влияющие факторы.
Возраст, мес.
-LD -LL-1 - LL-14
Возраст, мес.
В
Возраст, мес.
Рис. 3. Возрастные изменения активности СОД (А), каталазы (Б) и содержания токоферола (В) в сердце крыс, содержавшихся в различных режимах освещения: усл. обозн. см. на рис. 1
В целом возрастные изменения можно охарактеризовать как рассогласование в работе антиоксидантных ферментов, а также как постепенное снижение уровня антирадикальной защиты неферментативными антиоксидантами в изученных органах. Снижение функциональной активности пинеальной железы с помощью постоянного освещения влияло как на динамику, так и на уровень активности ферментов. Однако изменения в значительной степени зависели от возраста животного, включаемого в эксперимент с постоянным освещением: если применение постоянного освещения с месячного возраста влияло, в основном, лишь на уровень активности, то у крыс группы 1_Ы4, прежде всего, на динамику, а не только на абсолютные значения активности ферментов (рис. 1-3).
Полученные данные по активности ферментов согласуются с показателями продолжительности жизни экспериментальных животных. Установлено, что крысы, с одномесячного возраста находившиеся при постоянном освещении, характеризовались более низкой средней (самки - на 22,1 % и самцы - на 3 %) и максимальной продолжительностью жизни (самки - на 18 %, самцы - на 4 %) по сравнению с крысами, находившимися при стандартном освещении (табл. 2). СПЖ самок в группе 1_Ь 14 на 4% ниже, тогда как МПЖ на месяц больше, чем у самок крыс при стандартном освещении. Самцы в группе 1_Ь-14 имели более высокие показатели продолжительности жизни по сравнению с животными, находившимися в стандартных световых условиях. Показатели
продолжительности жизни самцов и самок в группе И-14 превышают таковые у крыс, содержавшихся в группе Ю.
Таблица 2. Влияние различных режимов освещения на продолжительность жизни самцов и самок крыс
Световой режим
Показатели Стандартное освещение (LD) Постоянное освещение (LL-1) Постоянное освещение (LL-14)
Количество
крыс 57 50 88
Самцы СПЖ, сут 766 ± 25,3 744 ± 28,0 818 ± 18,0
МПЖ, сут 1045 1005 1198
СПЖ
последних 10 % крыс,
сут 994 ± 9,2 1002 ± 1,8 1087 ± 8,3
Количество
крыс 40 54 59
Самки СПЖ, сут 844 ± 33,6 658 ± 22,8 811 ± 20,0
МПЖ, сут 1167 956 1198
СПЖ
последних 10 % крыс,
сут 1129 ± 18,9 921 ± 19,7 1113 ± 24,9
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о более позднем старении как ферментативного, так и неферментативного компонента антиоксидантной системы крыс, содержавшихся при постоянном освещении с 14 месяцев, по сравнению как с И-1, так и с Ю. Обычно изменения активности антиоксидантных ферментов, вызванные воздействием светового режима, связывают с нарушением синтеза и секреции мелатонина эпифизом [81топпеаих, Ribelayga, 2003]. Для протекторного влияния мелатонина при перекисном окислении липидов возможны как минимум два механизма действия [Меньщикова и др., 2006], включающие непосредственное улавливание активных форм кислорода и/или торможение их генерации в клетке, а также регуляцию экспрессии генов АОФ.
Косвенным подтверждением участия эндогенного мелатонина в наблюдаемых процессах является различная степень выраженности изменений каждого из ферментов, а также органоспецифичность установленных сдвигов активности. Степень изменений активности СОД и каталазы обусловлена не только спецификой антиоксидантных ферментов, но и особенностями взаимодействия мелатонина с активными формами кислорода. Мелатонин может реагировать с перекисью водорода, являющейся субстратом для каталазы, и не реагирует с су-пероксидным анион-радикалом, являющимся субстратом для СОД [А11едга е1: а1., 2003].
Снижение активности АОФ и содержания витамина Е в исследованных органах крыс, находившихся в условиях постоянного освещения с месячного возраста, хорошо согласуется с со-
кращением времени жизни крыс. Полученные результаты позволяют утверждать, что воздействие постоянного освещения может не только приводить к снижению продолжительности жизни крыс, как было показано ранее [Vinogradova et al., 2009], но и способствовать увеличению выживаемости животных. Фактором, обусловливающим эти различия, как и в ранее проведенных экспериментах на мышах [Pierpaoli, Bulian, 2005], является срок начала экспериментальных воздействий. Удаление эпифиза на разных этапах постнатального онтогенеза (3, 5, 7, 9, 14 и 18 месяцев) приводит как к сокращению, так и к увеличению продолжительности жизни животных [Pierpaoli, Bulian, 2005]. Эпифизэктомия в 14-месячном возрасте значительно увеличивала выживаемость мышей и поддерживала их гормональный и метаболический статус на уровне 5-месячных животных. Авторы считают, что именно в этом возрасте эпифиз запускает «программу» старения организма. Воздействие постоянного освещения с 14 месяцев у крыс, так же как и эпифизэкто-мия в этом возрасте у мышей [Pierpaoli, Bulian, 2005], оказывает сходное влияние на продолжительность жизни животных. Нами установлено, что у самок крыс, находившихся в группе LL-14, СПЖ, МПЖ и СПЖ последних 10 % животных и у самцов этой группы МПЖ достоверно выше, чем у крыс, содержавшихся при стандартном и постоянном освещении с одного месяца. Средняя и максимальная продолжительность жизни крыс, содержавшихся при постоянном освещении с месячного возраста, были значительно ниже по сравнения с животными других групп.
Заключение
Проведенное исследование является еще одним подтверждением свободнорадикальной теории старения, выдвинутой Д. Харманом [Harman, 1956] и Н. М. Эмануэлем [Эмануэль, 1975] более полувека назад. Воздействие подавляющего функциональную активность эпифиза постоянного освещения с возраста 14 месяцев способно приводить к более позднему «старению» ферментативного и неферментативного компонентов антиоксидантной системы крыс, что, возможно, является одной из причин продления жизни животных, а также подтверждает предположение [Pierpaoli, Bulian, 2005] о ключевой роли эпифиза в запуске «программы» старения организма.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 07-04-00546) и Грантов Президента РФ НШ-306.2008.4 и НШ-3731.2010.4.
©
Литература
Анисимов В. Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения: В 2 т. 2-е изд., перераб. и доп. СПб.: Наука, 2008. Т. 1. 481 с.
Коросов А. В., Горбач В. В. Компьютерная обработка биологических данных: Метод. пособие. Петрозаводск: ПетрГУ, 2007. 76 с.
Меньщикова Е. Б., Ланкин В. З., Зенков Н. К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Слово, 2006. 556 с.
Скурихин В. Н., Двинская Л. М. Определение а-токоферола и ретинола в плазме крови сельскохозяйственных животных методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии // С.-х. биология. 1989. № 4. С. 127-129.
Эмануэль Н. М. Некоторые молекулярные механизмы и перспективы профилактики старения // Изв. АН СССР Сер. биол. 1975. № 4. С. 785-794.
Allegra M., Reiter R. J., Tan D.-X. et al. The chemistry of melatonin’s interaction with reactive specie // J. Pineal Res. 2003. Vol. 34. P 1-10.
Bears R. F., Sizer I. N. A spectral method for measuring the breakdown of hdrogen peroxide by catalase // J. Biol. Chem. 1952. Vol. 195, N 1. P 133-140.
Dowling D. K., Simmons L. W. Reactive oxygen species as universal constraints in life-history evolution // Proc. R. Soc. 2009. Vol. 276. P 1737-1745.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Хижник Евгений Александрович
аспирант
Институт биологии Карельского научного центра РАН ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск,
Республика Карелия, Россия, 185910 эл. почта: hizhkin84@mail.ru тел.: (8142) 573107
Ильина Татьяна Николаевна
старший научный сотрудник, к. б. н.
Институт биологии Карельского научного центра РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия,
Россия, 185910
эл. почта: ilyina@bio.krc.karelu
тел.: (8142) 573107
Лотош Татьяна Анатольевна
старший преподаватель кафедры фармакологии, организации и экономики фармации с курсами микробиологии и гигиены мед. фак-та
Петрозаводский государственный университет
пр. Ленина, 33, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия,
185910
эл. почта: tatyanakotosh@yandex.ru тел.: (8142) 769871
Илюха Виктор Александрович
зав. лаб. экологической физиологии животных, д. б. н. Институт биологии Карельского научного центра РАН ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185910
эл. почта: Ilyukha@krc.karelia.ru тел.: (8142) 573107
Виноградова Ирина Анатольевна
зав. кафедрой фармакологии, организации и экономики фармации с курсами микробиологии и гигиены мед. фак-та, д. м. н.
Петрозаводский государственный университет
пр. Ленина, 33, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия,
185910
эл. почта: iri89569627@yandex.ru тел.: (8142) 769871
Анисимов Владимир Николаевич
руководитель отдела канцерогенеза и онкогеронтологии, д. м. н. НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова Росмедтехнологий Песочный-2, Санкт-Петербург, Россия, 197758 эл. почта: aging@mail.ru
Gutteridge J. M. C. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage // Clinical Chemistry. 1995. Vol. 41, N 12. P 1819-1828.
Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry // J. Gerontol. 1956. Vol. 11, N 2. P 298-300.
Misra H. H., Fridovich I. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247. P 3170-3175.
Pierpaoli W., Bulian D. The pineal aging and death program. I. Grafting of old pineals in young mice accelerates their aging // J. Anti-Aging. Med. 2001. Vol. 4, N 1. P. 31-37.
Pierpaoli W., Bulian D. The pineal aging and death program. II. Life prolongation in pre-aging pinealectomized mice // Ann. N.Y Acad. Sci. 2005. Vol. 1057. P 133-144.
Simonneaux V., Ribelayga C. Generation of the Melatonin Endocrine Message in Mammals: A Review of the Complex Regulation of Melatonin Synthesis by Norepinephrine, Peptides, and Other Pineal Transmitters // Pharmacol. Rev. 2003. Vol. 55. P 325-395.
Vinogradova I. A., Anisimov V. N., Bukalev A. V. et al. Circadian disruption induced by light-at-night accelerates aging and promotes tumorigenesis in rat // Aging. 2009. Vol. 1, N 10. P 855-865.
Khizhkin, Evgeniy
Institute of Biology, Karelian Research
Centre, Russian Academy of Science
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia
e-mail: hizhkin84@mail.ru
tel.: (8142) 573107
Ilyina, Tatiana
Institute of Biology, Karelian Research
Centre, Russian Academy of Science
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia
e-mail: : ilyina@bio.krc.karelu
tel.: (8142) 573107
Lotish, Tatyana
Petrozavodsk State University
33 Lenina pr., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia
e-mail: tatyanakotosh@yandex.ru
tel.: (8142) 769871
Ilyukha, Victor
Institute of Biology, Karelian Research Centre, Russian Academy of Science
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: Ilyukha@krc.karelia.ru tel.: (8142) 573107
Vinogradova, Irina
Petrozavodsk State University
33 Lenina pr., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia
e-mail: iri89569627@yandex.ru
tel.: (8142) 769871
Anisimov, Vladimir
Department of Carcinogenesis and Oncogerontology N. N. Petrov Research Institute of Oncology Pesochny-2, 197758, St. Petersburg, Russia e-mail: aging@mail.ru
