Научная статья на тему 'ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЗИРОВАННОГО ПОМЕТА КУР НА ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ (ПЦР), СОСТАВ И СТРУКТУРУ МИКРОБИОМА (NGS-СЕКВЕНИРОВАНИЕ) ДЕРНОВОПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ'

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЗИРОВАННОГО ПОМЕТА КУР НА ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ (ПЦР), СОСТАВ И СТРУКТУРУ МИКРОБИОМА (NGS-СЕКВЕНИРОВАНИЕ) ДЕРНОВОПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ Текст научной статьи по специальности «Сельское хозяйство, лесное хозяйство, рыбное хозяйство»

CC BY
28
9
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
микробиологические показатели / биологизированный помет / пробиотики / филогенетический состав / метагеном / патогенные виды бактерий / microbiological indicators / biologized droppings / probiotics / phylogenetic composition / metagen / pathogenic bacterial species

Аннотация научной статьи по сельскому хозяйству, лесному хозяйству, рыбному хозяйству, автор научной работы — Н.Н. Щукин, Н.Ю. Пухова

Биологизация помета кур (включением в рационы кормления пробиотиков) клеточного содержания и дальнейшее его использование в растениеводстве может способствовать снижению затрат птицефабрик на утилизацию помета и повысить эффективность возделывания сельскохозяйственных культур на малоплодородных землях без ухудшения экологического состояния окружающей среды. В опыте использована высокая доза биологизированного свежего куриного помета (120 т/га), внесенная под весновспашку, контроль – вариант без органики. Секвенирование метагеномов почвенных образцов показало, что в результате внесения ферментированного бактериями пробиотиков помета филогенетический состав почвенного микробиома сохранялся, но изменялась его таксономическая структура и функциональность в связи с ростом численности бактерий (при различной активности таксонов). В пахотном горизонте отмечено увеличение обилия бактерий в 1-й срок отбора образцов с 6,9•107 до 1,3•108 копий/г почвы гена 16S рРНК бактерий, а через 30 дней – с 1,6•107 до 1,3•108 копий/г. Исследовалось и наличие в удобренной почве условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, которые обнаружены во всех почвенных образцах. Более высокая доля энтеробактерий отмечена в контрольном образце (0,6%), а с внесением помета – не превышала 0,15%. Содержание патогенных бактерий в удобренном варианте в 1-й срок отбора почвы практически не изменялось (0,7 0,8%), но во 2-й срок – резко снизилось (с 2,5 до 1,1%). Однако снижение содержания патогенных бактерий сопровождалось увеличением их численного обилия (с 3,9•105 до 1,4•106 копий/г), преимущественно бактерий Pseudomonas spp. (с 2,1•105 до 9,3•105 копий/г), что является следствием общего роста обилия бактерий в микробиоме на фоне обогащения почвы органикой и повышения почвенного плодородия. На указанном этапе исследований существенного негативного микробиологического влияния биологизированного свежего куриного помета на экологическое состояние почвы не выявлено.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по сельскому хозяйству, лесному хозяйству, рыбному хозяйству , автор научной работы — Н.Н. Щукин, Н.Ю. Пухова

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

AFTEREFFECT OF BIOLOGIZED CHICKEN MANURE ON BACTERIA ABUNDANCE (PCR), COMPOSITION, AND STRUCTURE OF THE MICROBIOME (NGS-SEQUENCING) OF SODDY-PODZOLIC SOIL

Biologization of chicken manure (by including probiotics in diets) of cellular content and its further use in crop production can help to reduce the cost of poultry manure disposal and increase the efficiency of crop cultivation on marginal lands without deteriorating the ecological state of the environment. The experiment used a high dose of biologized fresh chicken manure (120 t/ha) introduced under spring plowing. The control was a variant without organic matter. Sequencing of metagenomes of soil samples showed that as a result of the introduction of droppings fermented by bacteria, the phylogenetic composition of the soil microbiome was preserved, but its taxonomic structure and functionality changed due to the increase in the number of bacteria (with the different activity of taxa). In the arable soil layer, an increase in the abundance of bacteria was noted in the 1st sampling period from 6.9 • 107 to 1.3 • 108 copies/g of the soil of the 16S rRNA gene of bacteria, and after 30 days from 1.6 • 107 to 1.3 • 108 copies/g. The presence of opportunistic and pathogenic microorganisms in the fertilized soil, which were found in all soil samples, was also studied. A higher proportion of enterobacteria was noted in the control sample (0.6%), and with manure did not exceed 0.15%. The content of pathogenic bacteria in the fertilized version practically did not change in the 1st period of soil selection (0.7-0.8%), but in the 2nd period, it dropped (from 2.5 to 1.1%). However, the decrease in pathogenic bacteria was accompanied by an increase in their numerical abundance (from 3.9 • 105 to 1.4 • 106 copies/g), mainly Pseudomonas spp bacteria. (from 2.1 • 105 to 9.3 • 105 copies/g), which is the result of a general increase in the abundance of bacteria in the microbiome against the background of soil enrichment with organic matter and an increase in soil fertility. At the specified stage of studies, no significant negative microbiological impact of biologized fresh chicken droppings on the ecological state of the soil was detected.

Текст научной работы на тему «ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЗИРОВАННОГО ПОМЕТА КУР НА ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ (ПЦР), СОСТАВ И СТРУКТУРУ МИКРОБИОМА (NGS-СЕКВЕНИРОВАНИЕ) ДЕРНОВОПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ»

DOI:10.24412/2225-2584-2023-1-53-61

УДК 631.4, 579.266.2

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЗИРОВАННОГО ПОМЕТА КУР НА ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ (ПЦР), СОСТАВ И СТРУКТУРУ МИКРОБИОМА (NGS-СЕКВЕНИРОВАНИЕ) ДЕРНОВО-

ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ

Н.Н. ЩУКИН1, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник, (е-mail: n9159803437@ yandex.ru)

Н.Ю. ПУХОВА2, кандидат биологических наук

1Верхневолжский федеральный аграрный научный центр

ул. Центральная, д. 3, п. Новый, Суздальский р-н, Владимирская обл., 602060, Российская Федерация

2Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова

ул. Советская, д.14, г. Ярославль, 150000, Российская Федерация.

Резюме. Биологизация помета кур (включением в рационы кормления пробиотиков) клеточного содержания и дальнейшее его использование в растениеводстве может способствовать снижению затрат птицефабрик на утилизацию помета и повысить эффективность возделывания сельскохозяйственных культур на малоплодородных землях без ухудшения экологического состояния окружающей среды. В опыте использована высокая доза биологизированного свежего куриного помета (120 т/га), внесенная под весновспашку, контроль - вариант без органики. Секвенирование метагеномов почвенных образцов показало, что в результате внесения ферментированного бактериями пробиотиков помета филогенетический состав почвенного микробиома сохранялся, но изменялась его таксономическая структура и функциональность в связи с ростом численности бактерий (при различной активности таксонов). В пахотном горизонте отмечено увеличение обилия бактерий в 1-й срок отбора образцов с 6,9*10' до 1,3*10 копий/г почвы гена 16S рРНК бактерий, а через 30 дней - с 1,6*107 до 1,3*10 копий/г. Исследовалось и наличие в удобренной почве условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, которые обнаружены во всех почвенных образцах. Более высокая доля энтеробактерий отмечена в контрольном образце (0,6%), а с внесением помета - не превышала 0,15%. Содержание патогенных бактерий в удобренном варианте в 1-й срок отбора почвы практически не изменялось (0,7 - 0,8%), но во 2-й срок - резко снизилось (с 2,5 до 1,1%). Однако снижение содержания патогенных бактерий сопровождалось увеличением их численного обилия (с 3,9*10 до 1,4*10 копий/г), преимущественно бактерий Pseudomonas spp. (с 2,1*10 до 9,3*10 копий/г), что является следствием общего роста обилия бактерий в микробиоме на фоне обогащения почвы органикой и повышения почвенного плодородия. На указанном этапе исследований существенного негативного микробиологического влияния биологизированного свежего куриного помета на экологическое состояние почвы не выявлено.

Ключевые слова: микробиологические показатели, биологизированный помет, пробиотики, филогенетический состав, метагеном, патогенные виды бактерий.

Для цитирования: Щукин Н.Н., Пухова Н.Ю. Влияние последействия биологизированного помета кур на

численность бактерий (ПЦР), состав и структуру микробиома (NGS - секвенирование) дерново- подзолистой почвы // Владимирский земледелец. 2023. №1. С. 53-61. DOI:10.24412/2225-2584-2023-1-53-61.

Методами классической микробиологии основательно изучены различные стороны влияния куриного помета на культивируемую почвенную микробиоту при разрабатываемых технологиях производства и утилизации органических удобрений в разнообразных экологических условиях.

Исследованиями установлена зависимость

микробиологических свойств почвенных прокариотных сообществ от антропогенных абиотических факторов. Обогащение почвы органическими и органоминеральными веществами, проведение сельскохозяйственных обработок и различных культуртехнических мероприятий, наряду с высеваемыми культурами, изменяют физико-химические свойства почв - среду обитания микроорганизмов [1-3]. В свою очередь, активность тех или иных таксонов микробиома формирует его изменчивость. Поэтому микробиомы, обрабатываемых и используемых в сельском хозяйстве земель, по своим микробиологическим характеристикам значительно отличаются от естественных биоценозов [4]. Улучшение их функций в благоприятном для растений направлении (например, в результате внесения органических удобрений) способствует повышению продуктивности малоплодородной почвы [5].

Внедрение в молекулярную экологию методов секвенирования нуклеотидных последовательностей позволило полнее исследовать почвенные микроорганизмы и изучить микробиологические особенности прокариотных сообществ почвы [6, 7].

Выявлено, что в почве, включая ризосферу растений, существуют так называемые некультивируемые микроорганизмы, присутствие которых невозможно детектировать традиционными методами на питательных средах. По различным оценкам обилие некультивируемой микрофлоры составляет 90-99% состава почвенных микробиомов [8]. К ним относятся ранее неизвестные виды и формы микроорганизмов, прекращающие рост на питательных средах под влиянием неблагоприятных факторов, но сохраняющие жизнеспособность и возобновляющие пролиферацию при улучшении условий культивирования. Некультивируемое состояние (реакция на среду обитания) обнаружено у многих видов бактерий, включая патогенные [9].

Метагеномное пиросеквенирование микробиомов

различных типов почвы по регионам России показало доминирование бактерий, относящихся к филам: Proteobacteria (до 59,3%), АЛтоЬаЛепа (до 55,4%), Acidobacteria (до 26,5%), Verrucomicrobia (до 13,6%), Bacteroidetes (до 10,5%), Firmicutes (до 8,2%), Gemmatimonadetes (до 6,9%), СЫоюАею (до 5,7%). Подтвердилась зональность таксономической структуры микробиомов: преобладание представителей

филы Proteobacteria в почвах северных регионов и АЛтоЬаЛепа - в южных. В почвах с низкими значениями рН отмечено увеличение численности бактерий филы Acidobacteria, а в щелочных почвах - филы Firmicutes [6,7].

Полученные данные иллюстрируют зависимость распространения представителей различных

бактериальных фил от экологических условий, из которых основное влияние на структуру почвенного сообщества микроорганизмов оказывают влажность и кислотно-щелочной баланс почвы [6, 7, 10-12].

Приведем примеры функциональности таксономически значимых бактерий, распространенных в почвенных прокариотических сообществах. Протеобактерии, преобладающие в микробиомах дерново-подзолистой почвы различной степени кислотности, сложная и разнообразная фила бактерий среди прокариотических организмов, охватывают около 1600 таксонов грамотрицательных бактерий или примерно треть от всех известных видов бактерий.

Согласно филогенетической классификации, фила Proteobacteria включает специфический порядок бактерий Rhizobiales, многие из которых обладают способностью к азотфиксации в симбиозе с бобовыми растениями, образуя корневые клубеньки. Свободноживущие ризобии (в отсутствии растения-хозяина), подобно другим почвенным микроорганизмам, используют для питания вещества, растворенные в почве [13].

Известно, что благоприятные почвенно-экологические условия жизнедеятельности бактерий с целлюлозоразлагающей эколого-физиологической функцией близки к оптимальным для произрастания полевых культур, поэтому изменение их численности служит показателем влияния определенных агротехнических мероприятий (в том числе внесения органики) на биологическую активность и уровень плодородия почвы [8, 9, 14].

Патогенные свойства бактерий связаны с особенностями их ферментов и токсинов, которые обладают не только определенной патогенностью по отношению к растениям и животным, но и пестицидной активностью против сорняков, грибов, насекомых и нематод. В полной мере это относится к бактериям ВиМоШепа sp. Одни штаммы этого вида (таксона) вызывают бактериозы зерновых, овощных культур и картофеля, а другие -выделяют продукты, обладающие гербицидной (против двудольных и осоковых сорняков), фунгицидной (против грибных заболеваний) или инсектицидной (против

насекомых и нематод) активностью.

Высокой фитопатогенностью для многих сельскохозяйственных культур обладают некоторые штаммы бактерий Pseudomonas sp. и Xanthomonas sp. -возбудители бактериальных заболеваний, которые в сочетании с грибными инфекциями, например, зерновых культур, являются причинами: слабого кущения (с признаками, напоминающими азотно-фосфорное голодание растений), карликовости стеблей, стерилизации колоса, почернения зерен у основания, неразвитости корневой системы и развития корневых гнилей, неустойчивости растений к засухе, снижения зимостойкости и полегания; падения урожайности и устойчивости к неблагоприятным природным (абиотическим) факторам и других.

В обычных условиях совместная бактериально-грибная инфекция трудно распознаваема, а признаки болезней часто приписываются одним грибам или недостаткам элементов питания в почве. При этом использование фунгицидов только против грибных инфекций усиливает бактериальные, а внесение минеральных удобрений не приносит желаемого результата.

Кроме того, бактерии Pseudomonas могут снижать эффективность ряда гербицидов и инсектицидов, обладать редкой способностью выделять белок - активатор замерзания воды, который снижает ее температуру в период зимовки озимых зерновых. В результате этого даже успешно перезимовавшие растения могут погибнуть весной после возобновления вегетации [15-17].

Задачей данных исследований является изучение таксономического состава, численности и функциональных изменений почвенного микробиома в результате внесения свежего биологизированного помета (путем включения пробиотиков в рацион кормления птицы клеточного содержания) в малоплодородную дерново-подзолистую почву, исключая стадию обеззараживания и доработки (компостирования или высушивания помета) в навозохранилищах, при соблюдении норм экологической безопасности окружающей среды.

Применение биологизированного свежего помета кур клеточного содержания в растениеводстве после тщательного изучения его экологической безвредности для окружающей среды, позволит снизить затраты птицефабрик на утилизацию помета и использовать его для более эффективного возделывания сельскохозяйственных культур, особенно на малоплодородных землях.

Условия, материалы и методы. Исследования проводились на дерново-подзолистой почве Пошехонского района Ярославской области. Легкосуглинистый пахотный (0-20 см) слой почвы характеризовался близкой к слабокислой реакцией среды (рНкс1 - 4,96), низким содержанием гумуса (1,05%, по Тюрину), повышенной обеспеченностью подвижным фосфором

(141 мг/кг, по Кирсанову) и обменным калием (137 мг/кг, по Масловой), повышенным содержанием нитратного азота (20,9 мг/кг почвы) и очень низким - аммонийного (9,6 мг/кг). Плодородие почвы снижалось с глубиной в среднесуглинистом подпахотном (20-40 см) горизонте, но более значительно - в слое 30-40 см. Наблюдалось повышение кислотности почвы (до 4,53 ед.), снижение содержания гумуса (до 0,54%), фосфора (до 125 мг/кг), калия (до 98 мг/кг), нитратного (до 7,4 мг/кг) и аммонийного (4,9 мг/кг) азота.

Агрохимические свойства почвы и их изменение под влиянием последействия внесения биологизированный куриный помет (БКП), показатели которых необходимы для оценки условий обитания почвенных микроорганизмов, изучались в лаборатории агрохимии и экологии Верхневолжского ФАНЦ.

Биологизацию помета кур клеточного содержания производили включением в ежедневный рацион их кормления пробиотиков.

Свежий БКП из птичников вывозили в течение 1-2 дней на поля, исключая стадию промежуточного хранения и обеззараживания в навозохранилище, и разбрасывали под весновспашку в 2019 г. Эксперимент по влиянию последействия помета на микробиом почвы провели в 2020 г. (второй год после внесения помета) в 2-х вариантах: контроль - без удобрений и удобренный - 120 т/га БКП.

Образцы почвы отбирали под посевами яровой пшеницы в 2 срока: 1-го июля в слоях 0-20 и 20-40 см -в фазу трубкования пшеницы и 30-го июля (в слое 0-20 см) -в фазу молочной спелости зерна. В полевых условиях из каждых 5 индивидуальных проб составляли смешанные образцы, которые подсушивали при комнатной температуре и хранили в морозильной камере при -700С.

В молекулярно-генетической лаборатории ООО «БИОТРОФ» (г. Санкт-Петербург) исследовалась таксономическая структура бактериального сообщества почвы с использованием NGS-секвенирования нуклеотидных последовательностей и производился подсчет численности копий бактерий в реальном времени (real-time PCR) методом ПЦР препаратов ДНК, выделенных из образцов почвы по вариантам опыта (на контроле и удобренном).

Амплификация проводилась с использованием ДНК-амплификатора Verity («Life Technologies, Inc.», США) с помощью эубактериальных праймеров (IDT) 343F (CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3) и 806R (GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3) фланкирующих участок V1V3 гена 16S рРНК.

Метагеномное секвенирование осуществляли на геномном секвенаторе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с набором MiSeq Reagent Kit V3 («Illumina, Inc.», США). Максимальная длина полученных последовательностей составила 2 х 300 нт. Химерные последовательности были исключены из анализа с помощью программы «USEARCH 7.0».

Обработка полученных ридов 2 х 300 нт происходила с помощью биоинформатической платформы «CLC Bio GW 7.0» («Qjagen», Нидерланды) и включала в себя перекрывание, фильтрацию по качеству (QV>15) и триммирование праймеров. Определение таксономической принадлежности микроорганизмов до рода проводили с применением программы RDP Classifier.

Погрешность прибора MiSeq, на котором проводили NGS-секвенирование, составляла 5%.

Результаты и обсуждение. Результаты секвенирования нуклеотидных последовательностей и подсчета методом ПЦР численности копий гена 16S рРНК бактерий из различных почвенных горизонтов по вариантам опыта представлены в таблице 1.

Распределение бактерий по горизонтам почвы отличалось неравномерностью: в пахотном слое (0-20 см) численность бактерий варьировала в пределах 6,9^107-1,3^108 копий/г почвы и снижалась примерно на 2 порядка с глубиной (в слое 20-40 см).

Внесение помета способствовало росту обилия микроорганизмов в почве по сравнению с контролем: в образцах от 1 июля с 6,9^107 до 1,3^108 в слое 0-20 см и с 6,3^105 до 1,5^106 копий/г в слое 20-40 см. Вместе с тем через 30 дней в пахотном слое контрольного варианта наблюдалось снижение численности бактерий (до 1,6^107 копий/г) и их стабильность на удобренном фоне (в начале и конце опыта - по 1,3^108 копий/г).

Наряду с изменением обилия бактерий в 1-й срок отбора образцов в легко- (слой 0-20 см) и среднесуглинистом (слой 20-40 см) горизонтах почвы под влиянием последействия БКП происходило снижение кислотности (рНкс1) почвы - от близкой к слабокислой до слабокислой (в слое 0-20 см); повышение содержания нитратного азота в 1,1-3,2 раза и аммонийного - в 1,3-6,4 раза.

Более существенные изменения агрохимических свойств в удобренной почве наблюдались во 2-й срок отбора образцов: резко снизилась кислотность почвы -

1. Влияние последействия помета на обилие бактерий в почве

Сроки отбора образцов Удобрение Слой почвы, см Количество копий бактерий, копий/г (lg копий/г)

1 июля без удобрений (контроль) 0-20 6,9^107 (7,84)

20-40 6,3^105 (5,80)

последействие 120 т/га 0-20 1,3^108 (8,11)

20-40 1,5^106 (6,17)

30 июля без удобрений (контроль) 0-20 1,6^107 (7,20)

последействие 120 т/га 0-20 1,3^108 (8,11)

от близкой к слабокислой (во всех слоях) до слабокислой (в слое 0-20 см) и нейтральной (слой 20-40 см), в 1,7-14,7 раза увеличилось содержание нитратного азота и в 1,3-12,8 раза - аммонийного. При наибольших значениях этих показателей в слое 30-40 см.

Заметное увеличение (на 1 порядок) обилия бактерий в удобренной почве, показатель активности процессов, инициируемых, как известно, определенными группами микроорганизмов углеродного и азотного циклов в аэробных и анаэробных условиях, вследствие повышения содержания в почве питательных веществ (содержания минерального азота - от низкого до очень высокого), а также снижением кислотности (рНКС|) от среднекислой и близкой к слабокислой до нейтральной в результате внесения помета.

Согласно проведенному филогенетическому анализу (рис. 1), таксономический состав микробного сообщества бактерий сформирован преимущественно представителями 10-и фил (Proteobacter¡a, Acidobacteria, А^поЬаЛепа, Bactero¡detes, Chloroflex¡, F¡rm¡cutes, Gemmat¡monadetes, Verrucom¡crob¡a, РагшЬаЛепа и На^от^Ь), суммарная доля которых в образцах пахотного слоя почвы оставалась постоянной (около 91-93%), но резко уменьшалась с глубиной с 93 до 67% на удобренном фоне и с 92 до 48% на контроле. Это, возможно, связанно с ухудшением условий аэрации почвы с глубиной для обитания аэробных бактерий.

Глубже по профилю почвы возрастала доля неопределенных последовательностей ДНК (с 4-5% в слое 0-20 см до 30-49% в слое 20-40 см). В разнице содержания неидентифицируемых микроорганизмов в подпахотном горизонте, на фоне последействия помета (30%) и на контроле (49%), также усматривается взаимосвязь с плодородием почвы.

Наиболее широко в таксономическом составе микробиома представлена фила Р^еоЬа^епа с вкладом в сообщество 18-31%, далее следуют А^поЬаЛепа (8-25%), Ac¡dobacter¡a (4-18%), Bactero¡detes (5-9%), Verrucom¡crob¡a (2-7%), F¡rm¡cutes (1-7%) и Plantom¡cet¡s

Рис. 1. Влияние последействия помета на разнообразие бактериального сообщества на уровне фил

(1-5%, рис. 1). Обозначенные филы включают в себя широкий спектр бактерий с разными эколого-физиологическими функциями, а динамика их долевого участия в сообществе бактерий зависила от плодородия, температуры, влажности и глубины отбора почвенных образцов.

Последействие внесения помета сопровождалось повышением таксономического значения представителей одних фил и подавлением других. Усилением активности на улучшение плодородия почвы отзывались бактерии А^поЬаЛепа (их доля возросла с 15-19 до 21-25%) и Ac¡dobacter¡a (с 13-16 до 18%). Подобная реакция характерна и для представителей Bactero¡detes и F¡rm¡cutes. При этом долевое участие в микробиоме протеобактерий несколько снижалось (с 29-31 до 26%).

На уровне порядков в почвенном микробиоме доминировали: Act¡nomycetales (7,3-13,9%, фила А^поЬа^епа), Ви^оНет^ (2,4-9,2%, фила Proteobacter¡a), Rh¡zob¡ales (2,6-7,3%, фила Proteobacter¡a), Хап^отопаШа^ (1,3-7,3%, фила Proteobacter¡a), Ga¡ellales (2,4-4,5%, фила Аа^тоЬаЛепа), Planctomycetales (1,84,3%, фила Planctomycetes), Sph¡ngobacter¡ales (1,74,3%, фила Bactero¡detes), Sol¡rubrobacterales (0,7-3,5%, фила Аа^тоЬаЛепа), Sph¡ngomonadales (0,5-3,0%, фила Proteobacter¡a) (рис. 2).

Улучшение плодородия почвы по-разному отражалось на реакции представителей отдельных порядков. Например, возросшая активность доминирующих видов, посредством внесения помета, подавляла развитие бактерий порядка ВиМоШепа^, многие виды которых вызывают вспышки патогенных инфекций. Поэтому в контрольном образце пахотного слоя почвы их содержалось значительно больше (5,0-9,2%), чем на удобренном фоне (3,4-3,7%). Положительной отзывчивостью на внесение органики выделялись бактерии порядка Act¡nomycetales, долевое участие которых возросло (с 7,2-11,0 до 12,5-13,9%).

Несколько иная реакция наблюдалась у представителей порядка Rh¡zob¡ales. В образцах пахотного слоя почвы 1-го срока отбора доля ризобий по вариантам не отличалась (около 6,7 %), через 30 дней наблюдалось их снижение в контроле (до 5,1 %) и долевое постоянство (даже некоторое повышение) в удобренной почве (7,3 %, рис. 3). В данном случае также следствием активности ризобий по вариантам являлась обеспеченность почвы минеральным азотом, запасы которого в удобренном образце почвы почти в 1,1-14,7 раз (в зависимости от сроков отбора) превышали их показатели в контроле. Дополнительным «стрессором» для развития ризобий в контрольном

Рис. 2. Влияние последействия помета на разнообразие бактериального сообщества на уровне порядков

(около 9,6^106 копий/г). Видно, что понижение обилия ризобий в контроле связано со снижением органических веществ в почве к концу вегетации яровой пшеницы.

варианте послужил недостаток влаги в почве при повышении среднесуточной температуры воздуха с 1-го по 30 июля (с 16,0 до 19,6 0С), под влиянием которой возрастающая потребность бактерий в минеральном питании не покрывалась их запасами в почве для сохранения их таксономической доли в микробиоме.

Наблюдалось снижение ризобий с глубиной (от 0-20 до 20-40 см) в реальном (численном) и относительном выражении их обилия: на контроле - с 4,7^106 до 1,6^104 копий/г (или с 6,7 до 2,6% в микробиоме) и на удобренном фоне - с 8,9^106 до 5,6^104 копий/г (или с 6,8 до 3,7 %), т.е. на 2 порядка во всех вариантах. Очевидно, резкое снижение обилия и содержания ризобий в подпахотном горизонте почвы объясняется пониженным содержанием кислорода и отсутствием корней растений (бобовых) для симбиотмческих отношений, которые обеспечивают бактериям Rhizobiales аэробные условия. Кроме того, среднекислая реакция среды в контрольном образце в 1-й срок отбора в слое 30-40 см, угнетающе влияла на их активность.

Количественное обилие ризобий, как и их относительное содержание в микробиоме, в контрольном и удобренном вариантах в пахотном слое 1-го срока отбора образцов отличалось мало (4,7^106 и 8,9^106 копий/г), но через 30 суток их количество в контрольном варианте снизилось на 1 порядок (до 8,2^105 копий/г), а в удобренном сохранилось

Из этого следует, что плодородие и степень аэрации - факторы определяющие изменение численности ризобий в почве при прочих равных условиях среды.

Бактерии, идентифицированные методов

секвенирования, различающиеся таксономически, но физиологически объединенные источником и процессом питания (разложением целлюлозы растительных остатков), отнесены к условно целлюлозолитическим. Многие целлюлозолитические таксоны принадлежат к порядкам Flavobacteriales (фила Bacteroidetes), Clostridiales (фила Firmicutes), Cytophagales (фила Bacteroidetes), Bacteroidales (фила Bacteroidetes) А^потусе1а^, Gaiellales,

&

7 6

I3

а

=Х 2

о

и

|

Помет Помет Контроль Контроль Помет 0-20 см 20-40 см 0-20 см 20-40 см 0-20 см 1 июля 30 июля Контроль 0-20 см

Рис. 3. Влияние последействия помета на содержание в почве бактерий Rhizobiales

30

а« 25

20

15

Ï 10

.3 ч

llhlf

Помет 0-20 см

Помет 20-40 СМ

Контроль 0-20 см

Контроль 20-40 СМ

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Помет 0-20 см

Контроль 0-20 СМ

1 июля 30 июля

■ РйуоЬеое^э!« ■ ОойткЭДеБ ■СугооЬэеэ!» ■бааего^йБ ■ Аа'тоЬэаегё

Рис. 4. Влияние последействия помета на содержание в почве целлюлозолитических бактерий

Рис. 5. Влияние последействия помета на содержание в почве энтеробактерий

Рис. 6. Влияние последействия помета на содержание в почве патогенных бактерий

Solirubrobacterales (фила Actinobacteria) и другие.

В начале исследований (1 июля) доля условно целлюлозолитических бактерий в верхнем горизонте (0-20 см) составляла 24,3% по последействию помета и 25,7% - на контроле (рис. 4). В нижнем слое (20-40 см) их долевое участие в микробиоме снижалось до 20,5% на фоне удобрения пометом и до 16,5% - в контроле. В том числе и потому, что содержание органического субстрата (целлюлозы) после внесения помета больше в верхнем слое почвы.

Через 30 дней (30 июля) в горизонте почвы 0-20 см в удобренном образце доля целлюлозолитических бактерий возросла до 28% (на 3,7%), а в контрольном - несколько снизилась (до 24 % или на 1,7%).

Со стороны таксономического значения в микробиоме, из условно целлюлозолитических бактерий

наибольшим содержанием

выделялись представители филы Actinobacteria (долевое участие 8,325,3%); далее следовали порядки по убыванию - Clostridials (0,74,7%), Flavobacteriales (0,9-2,9%), Bacteroidales (0,3-2,2%) и Cytophagales (0,3-0,6%). Последействие внесения БКП способствовало повышению активности этих бактерий в пахотном горизонте, особенно представителей филы Actinobacteria: в 1-й срок отбора образцов почвы с 19,4 до 21,0% и во 2-й - с 15,5 до 25,3%. В подпахотном горизонте, несмотря на общую тенденцию к снижению содержания идентифицированных аэробных

представителей целлюлозолитиков в микробиоме, присутствие анаэробных (например, порядки Clostridiales и Bacteroidales) - повышалось (с 0,3-2,2 до 2,0-3,4%), указывая на смещение аэробно-анаэробного равновесия в анаэробную сторону с глубиной почвы.

Численное обилие

целлюлозолитиков в 1-й срок учета в контрольном и удобренном образцах в слое 0-20 см отличалось незначительно 1,8^107 и 3,4^107 копий/г. К концу опыта их обилие на контроле снизилось на 1 порядок (до 4,1^106 копий/г), а на фоне

1600000 1400000 1200000 loooooo йооооо 600000 400000 200000 о

_

Помет Помет Контроль Контроль 0-20 см 20-40 см 0-20 см 20-40 см 1 ИЮЛЯ Помет Контроль 0-20 см 0-20 см 30 июля

■ Peptococcaceae I Streptococcaceae i Xanthomonas sp.

I Paste urellaceae i Mycoplasmataceae ■ Pseudomonas sp.

Staphylococcaceae I Campylobacteraceae i Burkholderia sp.

Рис. 7. Влияние последействия помета на обилие в почве патогенных бактерий

органики - не изменилось (3,8^107 копий/г почвы), что объясняется в удобренном варианте - добавлением в почву доступного для питания бактерий соединений азота (включая минеральный) и углерода из состава органических веществ помета, стимулировавших разложение бактериями целлюлозы, а в контрольном - их недостатком.

Учитывая, что в опытах изучалось последействие внесения в почву высокой дозы свежего биологизированнрго помета (при клеточном содержании птицы) без предварительной специальной обработки (обеззараживания в хранилищах, компостирования или высушивания), то в целях проверки экологической безопасности окружающей среды проводились исследования на присутствие в почве условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

Условно-патогенные энтеробактерии (семейство Enterobacteriaceae и др.) распространены повсеместно: в почве, воде, входят в состав микробиоты животных и человека. Во всех исследованных образцах почвы выявлены представители энтеробактерий с незначительной в бактериальном сообществе долей, которая слабо изменялась по вариантам (рис. 5). Относительно большее содержание энтеробактерий обнаружено в контрольных образцах почвы в конце июля (0,6%). В остальных образцах доля энтеробактерий не превышала 0,15%.

В начале опыта обилие энтеробактерий в слое почвы 0-20 см в удобренном и контрольном образцах не отличалось и составляло около 3,9^104 копий/г почвы. Нижний слой почвы (20-40 см) характеризовался значительно меньшим (на 2 порядка) обилием условно-патогенных бактерий (9,1^10 - 2,1^103 копий/г). К концу опыта доля энтеробактерий в верхнем горизонте почвы несколько снизилась на фоне последействия помета (до 2,6^104 копий/г почвы), но повысилась - в контроле (до 9,1^104 копий/г почвы).

В почве выявлены патогенные таксоны животных и растений, принадлежащие семействам Peptococcaceae, Pasteurellaceae, Staphylococcaceae, Streptococcaceae,

Peptococcaceae (фила Firmicutes), Mycoplasmataceae (фила Tenericutes) и Campylobacteraceae (фила Proteobacteria), а также относящиеся к Xanthomonas sp. (семейство Xanthomonadaceae), Pseudomonas sp. (семейство Pseudomonadaceae)

и Burkholderia sp. (семейство Burkholderiaceae).

Обнаруженные в почве патогены составляли незначительную долю в микробиомах (0,7-2,5%, рис. 6). В начале опыта в верхнем слое почвы отмечена наименьшая доля патогенных бактерий, которая по вариантам практически не отличалась (0,7-0,8%). На глубине 20-40 см их содержание несколько повышалось (до 1,3% в удобренном варианте и до 1,0% в контроле), в основном вследствие активности анаэробных патогенов (Peptococcaceae и Streptococcaceae). Во 2-й срок (в сравнении с 1-м) отбора образцов в горизонте почвы 0-20 см содержание патогенов в удобренной почве изменилось незначительно (повысилось с 0,7 до 1,1%), а в контроле - резко возросло (с 0,8 до 2,5%) с преобладанием представителей семейств Peptococcaceae и Burkholderiaceae, но особенно Pseudomonadaceae. Предположительно, стимулирование микробного ценоза органическим веществом помета подавляет развитие патогенов при возрастании активности других эколого-физиологических групп микроорганизмов.

По результатам количественной ПЦР, в 1-й срок отбора образцов из верхнего слоя почвы существенных различий в обилии патогенных бактерий по вариантам не выявлено: 6,7^105 копий/г почвы - на контроле и 8,9^105 - на фоне последействия помета (рис. 7). В конце опыта обилие патогенов в удобренной почвы возросло (до 1,4^10^ копий/г почвы, в их числе бактерий Pseudomonas sp. -с 2,1^105 до 9,3^105), но несколько снизилось в контроле (до 3,9^105 копий/г). Высокой активностью в пахотном слое выделялись и представители Burkholderia sp. и Peptococcaceae.

Относительно низкое обилие патогенных бактерий характерно для образцов, отобранных в подпахотном горизонте: в удобренном и контрольном вариантах,

соответственно, 1,8^104

и

6,2^103 копий/г почвы

с преобладанием бактерий Pseudomonas sp. и Xanthomonas sp. - фитопатогенов, возбудителей бактериальных заболеваний сельскохозяйственных растений, которые обнаружены во всех почвенных образцах.

В процессе анализа взаимосвязи обилия патогенных бактерий в почве с применением куриного помета отмечено снижение относительной (долевой) и повышение численного (реального) обилия микроорганизмов под влиянием обогащения почвы органикой. В контрольных

образцах почвы наблюдалась обратная зависимость: увеличение долевого участия патогенов (анаэробов) при снижении их численного обилия в условиях бедного агрофона - недостатка органических веществ.

Выводы. Филогенетический состав микробиома изучаемой дерново-подзолистой почвы отличался постоянством независимо от плодородия почвы. Но под влиянием последействия органики (повышения обеспеченности минеральным азотом и снижения кислотности почвы) изменялась структура микробиома со сменой доминант и соответствующей им функциональности.

На данном этапе исследований существенного негативного влияния биологизированного свежего помета кур на экологическое состояние почвы не выявлено, а некоторое повышение обилия патогенов при снижении их долевого участия в почвенном микробиоме сопряжено с повышением общей активности бактерий на фоне улучшения плодородия.

В статье рассмотрены лишь некоторые аспекты экологической проблемы применения органики в растениеводстве. Предложенная трактовка данных исследований является предварительной оценкой накопленного первичного материала.

Литература.

1. Пухова Н.Ю., Верховцева Н.В., Ларина Г.Е. Структура микробного сообщества чернозема выщелоченного в зависимости от антропогенной нагрузки//Проблемы агрохимии и экологии. 2011. № 4. С. 42-49.

2. Новиков В.М. Влияние агротехнологических приемов и погодных условий на биологическую активность темно-серой почвы при возделывании зернобобовых и крупяных культур //Зернобобовые и крупяные культуры. 2016. №4. С. 116-120.

3. Карепина Т.А., Лисицина Н.А., Муравин Э.А. Микробное сообщество дерново-подзолистой почвы после длительного применения удобрений//Плодородие.2012. № 5. С. 29-31.

4. Bissett A., Richardson A.E., Baker G., Thrall P.H., Long-term land use effects on soil microbial community structure andfunction, Appl. Soil Ecol., 2011, Vol. 51, pp. 66-78, DOI: 10.1016/i.apsoil.2011.08.010.

5. Щукин Н.Н., Окорков В.В., Окоркова Л.А., Железова А.Д. Особенности возделывания зерновых культур по интенсивной технологии с применением свежего куриного помета на дерново-подзолистой почве Ярославской области // Биологический круговорот питательных веществ при использовании удобрений и биоресурсов в системах земледелия различной интенсивности. Суздаль-Иваново: ПресСто, 2021. С. 166-178.

6. Чирак Е.Л., Першина Е.В., Дольник А.С. и др. Таксономическая структура микробных сообществ в почвах различных типов по данным высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 168-рРНК1//Сельскохозяйственная биология. 2013. № 3. С. 100-109.

7. Думова В.А., Першина Е.В., Мерзлякова Я.В., Круглов Ю.В., Андронов Е.Е. Основные тенденции в формировании почвенного микробного сообщества в условиях стационарного полевого опыта по данным высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 6-рРНК// Сельскохозяйственная биология. 2013. № 5. С. 85-92.

8. Першина Е.В., Андронов Е.Е., Самосоров Г.Г., Семенов А.Н. Генное досье микробиома // Наука из первых рук. Новосибирск: ООО «ИНФОЛИО», 2013.Т. 49, № 1. С. 68-75.

9. Соколенко А.В. Некультивируемые формы бактерий: распространение в природе, индукторы некультивируемого состояния и реверсии // Современные наукоемкие технологии. 2006, № 2. С. 11-15.

10. Riesenfeld C.S., Schloss P.D., Handelsman J. Metagenomics, genomic analysis of microbial communities // Annual Review of Genetics. 2004. № 38. P. 525-552.

11. Тихонович И.А., Чернов Т.И., Железова А.Д. и др. Таксономическая структура прокариотных сообществ почв разных биоклиматических зон // Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева. 2018. Вып. 95. С. 125-153.

12. Lauber C.L., Hamady M., Knight R., Fierer N. Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale. Appl. Environ. Microbiol., 200975(15): 5111-5120. DOI: 10.1128/AEM.00335-09.

13. Абрамова А.В., Топаж А.Г., ХвороваЛ.А. Агентный подход в моделировании симбиотической азотфиксации: от пассивных объектов к активным субъектам взаимодействия//Агрофизика. 2015. №4. С. 49-62.

14. Железова А.Д., ПассоваД.И., Никитин Д.А., Яшин М.А., Железова С.В. Влияние способа сельскохозяйственной обработки на микробиологичес-киехарактеристики дерново-подзолистой почвы//Бюллетень Почвенного института имени В.В. Докучаева. 2019. Вып. 99. С. 117-144.

15. Горобей И.М., Осипова Г.М. Проблемы бактериозов растений и подходы к ее решению//Сибирский вестник с.-х. науки.2017. Т47. № 4. С. 94-102.

16. ИгнатовА.Н., Пунина Н.В., Матвеева Е.В., Корнев К.П., Пехтерева Э.Ш., Политыко В.А. Новые возбудители бактериозов и прогноз их распространения в России //Защита и карантин растений. 2009. № 4. С. 38-41.

17. Желдакова Р.А., Мямин В.Е. Фитопатогенные микроорганизмы. Минск: БГУ, 2006. 116 с.

References.

1. Pukhova N.Yu., Verkhovtseva N.V., Larina G.E. The structure of the microbial community of leached chernozem depending on anthropogenic load //Problems of agrochemistry and ecology. 2011. No. 4. pp. 42-49.

2. Novikov V.M. The influence of agrotechnological techniques and weather conditions on the biological activity of dark gray soil in the cultivation of leguminous and cereal crops //Leguminous and cereal crops. 2016. No. 4. pp. 116-120.

3. Karepina T.A., Lisitsina N.A., Muravin E.A. Microbial community of sod-podzolic soil after prolonged application of fertilizers // Fertility.2012. No. 5. pp. 29-31.

№ 1 (103) 2023

8/ia5uMipckiù ЗемлейлОД

4. Bissett A., Richardson A.E., Baker G., Thrall P.H., Long-term land use effects on soil microbial community structure and function, Appl. Soil Ecol., 2011, Vol. 51, pp. 66-78, DOI: 10.1016/i.apsoil.2011.08M0.

5. Shchukin N.N., Okorkov V.V., Okorkova L.A., Zhelezova A.D. Features of cultivation of grain crops by intensive technology with the use of fresh chicken manure on sod-podzolic soil of the Yaroslavl region //Biological circulation of nutrients when using fertilizers and bioresources in farming systems of varying intensity. Suzdal-Ivanovo: PresSto, 2021. pp. 166-178.

6. Chirak E.L., Pershina E.V., Dolnik A.S., etc. Taxonomic structure of microbial communities in soils of various types according to high-throughput sequencing of 168-rRNK1 gene libraries//Agricultural biology. 2013. No. 3. pp. 100-109.

7. Dumova V.A., Pershina E.V., Merzlyakova Ya.V., Kruglov Yu.V., Andronov E.E. The main trends in the formation of the soil microbial community in the conditions of stationary field experience according to high-performance sequencing of 16S-rRNA gene libraries //Agricultural biology. 2013. No. 5. pp. 85-92.

8. Pershina E.V., Andronov E.E., Samosorov G.G., Semenov A.N. Microbiome gene dossier //First-hand science. Novosibirsk: LLC "INFOUO", 2013.T. 49, No. 1. pp. 68-75.

9. Sokolenko A.V. Uncultivated forms of bacteria: distribution in nature, inducers of uncultivated state and reversion//Modern high-tech technologies. 2006, No. 2. pp. 11-15.

10. Riesenfeld C.S., Schloss P.D., Handelsman J. Metagenomics, genomic analysis of microbial communities // Annual Review of Genetics. 2004. № 38. P. 525-552.

11. Tikhonovich I.A., Chernov T.I., Zhelezova A.D., etc. Taxonomic structure of prokaryotic communities of soils of different bioclimatic zones //Bulletin of the V.V. Dokuchaev Soil Institute. 2018. Issue 95. pp. 125-153.

12. Lauber C.L., Hamady M., Knight R., Fierer N. Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale. Appl. Environ. Microbiol., 200975(15): 5111-5120. DOI: 10.1128/AEM.00335-09.

13. Abramova A.V., Topazh A.G., Khvorova L.A. Agent approach in simulating symbiotic nitrogen fixation: from passive objects to active subjects of interaction //Agrophysics. 2015. No. 4. pp. 49-62.

14. Zhelezova A.D., Passova D.I., Nikitin D.A., Yashin M.A., Zhelezova S.V. The influence of the method of agricultural processing on the microbiological characteristics of sod-podzolic soil // Bulletin of the V.V. Dokuchaev Soil Institute. 2019. Issue 99. pp. 117-144.

15. Gorobey I.M., Osipova G.M. Problems of plant bacteriosis and approaches to its solution //Siberian Bulletin of Agricultural Science.2017. T47. No. 4. pp. 94-102.

16. Ignatov A.N., Punina N.V., Matveeva E.V., Kornev K.P., Pekhtereva E.Sh., Polityko V.A. New pathogens of bacterioses and the forecast of their spread in Russia // Protection and quarantine of plants. 2009. No. 4. pp. 38-41.

17. Zheldakova R.A., Myamin V.E. Phytopathogenic microorganisms. Minsk: BSU, 2006.116 p.

AFTEREFFECT OF BIOLOGIZED CHICKEN MANURE ON BACTERIA ABUNDANCE (PCR), COMPOSITION, AND STRUCTURE OF THE MICROBIOME (NGS-SEQUENCING) OF SODDY-PODZOLIC SOIL

N.N. SHCHUKIN1, N.YU. PUKHOVA2

JUpper Volga Federal Agrarian Research Center ul. Tsentralnaya 3, poselok Noviy, Suzdalskiy rayon, Vladimir Oblast, 601260, Russian Federation

2Yaroslavl State University named after P. Demidov, ul. Sovetskaya, 14, Yaroslavl, 150000, Russian Federation

Abstract. Biologization of chicken manure (by including probiotics in diets) of cellular content and its further use in crop production can help to reduce the cost of poultry manure disposal and increase the efficiency of crop cultivation on marginal lands without deteriorating the ecological state of the environment. The experiment used a high dose of biologized fresh chicken manure (120 t/ha) introduced under spring plowing. The control was a variant without organic matter. Sequencing of metagenomes of soil samples showed that as a result of the introduction of droppings fermented by bacteria, the phylogenetic composition of the soil microbiome was preserved, but its taxonomic structure and functionality changed due to the increase in the number of bacteria (with the different activity of taxa). In the arable soil layer, an increase in the abundance of bacteria was noted in the 1st sampling period from 6.9 • 107 to 1.3 • 108 copies/g of the soil of the 16S rRNA gene of bacteria, and after 30 days - from 1.6 • 107 to 1.3 • 108 copies/g. The presence of opportunistic and pathogenic microorganisms in the fertilized soil, which were found in all soil samples, was also studied. A higher proportion of enterobacteria was noted in the control sample (0.6%), and with manure did not exceed 0.15%. The content of pathogenic bacteria in the fertilized version practically did not change in the 1st period of soil selection (0.7-0.8%), but in the 2nd period, it dropped (from 2.5 to 1.1%). However, the decrease in pathogenic bacteria was accompanied by an increase in their numerical abundance (from 3.9 • 105 to 1.4 • 106 copies/g), mainly Pseudomonas spp bacteria. (from 2.1 • 105 to 9.3 • 105 copies/g), which is the result of a general increase in the abundance of bacteria in the microbiome against the background of soil enrichment with organic matter and an increase in soil fertility. At the specified stage of studies, no significant negative microbiological impact of biologized fresh chicken droppings on the ecological state of the soil was detected.

Keywords: microbiological indicators, biologized droppings, probiotics, phylogenetic composition, metagen, pathogenic bacterial species.

Author details: N.N. Shchukin, Candidate of Sciences (agriculture), senior research fellow, (e-mail: n9159803437@yandex.ru); N.Yu. Pukhova, Candidate of Sciences (biology).

For citation: Shchukin N.N., Pukhova N.Yu. Aftereffect of biologized chicken manure on bacteria abundance (PCR), composition and structure of the microbiome (NGS-sequencing) of soddy-podzolic soil // Vladimir agricolist. 2023. №1. pp. 53-61. D0I:10.24412/2225-2584-2023-1-53-61.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.