CC BY
56
УДК 612.1 11.085.2
ВЛИЯНИЕ ПОЛЛЮТАНТОВ С РАЗЛИЧНЫМИ СТРЕСС-ХАРАКТЕРИСТИКАМИ НА АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ЭРИТРОЦИТОВ in vitro
© 2005 г. А. М. Кудряшов, *Н. М. Титова, *Е. В. Кудряшова
Краевой наркологический диспансер,
* Государственный университет, г. Красноярск
Исследовано влияние бензохинона и гидрохинона в концентрациях 20 мкМ на состояние ферментативной системы антиоксидантной защиты эритроцитов in vitro.
В эксперименте показано, что адаптация красных клеток крови сопряжена с ранней активацией глутатион-Б-трансферазы, суперок-сиддисмутазы и поздней — глута-тионпероксидазы, каталазы. Обнаружено обратимое ингибирование глюкоза-6-фосфатдегидроге-назной и глутатионредуктазной реакций гидрохиноном и бензохи-ноном соответственно. Кинетика окисления и восстановления глутатиона отражает момент включения компенсаторных механизмов в ответ на действие стресс-агентов. Суммируя полученные данные, можно говорить об эффективной компенсации и адаптации эритроцитов, позволя ющих выдержать экстремальное воздействие на клетку.
Ключевые слова: антиоксидантная система, поллютанты, эритроциты.
Промышленные предприятия современного конгломерата являются источником выброса в окружающую среду различных химических соединений, отрицательно влияющих на все без исключения живые организмы. Производные фенола — гидрохинон (1,4-диоксибензол, далее ГХ), а также хинон — 1,4-бензохинон (далее БХ) являются широко распространенными химическими загрязнителями поверхностных водных объектов, используемых человеком в хозяйственно-питьевых целях [1].
ГХ и БХ благодаря своей способности быть донором-акцептором электронов и протонов формируют окислительно-восстановительную пару
— бензохинон—гидрохинон (Е0 = 0,710 В), обеспечивающую в живых организмах роль «буферов» для реакций, связанных с переносом электронов. Так, восстановление БХ и окисление ГХ протекает по двухэлектронному механизму, через образование реакционноспособного анион-радикала семихинона. Известно, что в комплексе и по отдельности эти соединения запускают активацию свободнорадикальных реакций на клеточном уровне, а также участвуют в ней [6].
Адаптационные возможности организма в ответ на действие неблагоприятных факторов среды в значительной мере зависят от неспецифических реакций красной крови. Самая многочисленная и быстро изменяющаяся популяция красных клеток крови обладает мощной антиок-сидантной системой, способной прерывать развитие свободнорадикального окисления [4]. Более того, ввиду отсутствия в эритроцитах белоксинтезирующего аппарата в них не происходит обновление поврежденных биомолекул, поэтому адаптивные свойства эритроцитов в ответ на экстремальный стимул и, соответственно, их роль в резистентности организма будет определяться лабильностью компенсаторных свойств данных клеток.
В этой связи актуально исследование неспецифического напряжения и выявление ключевых биохимических критериев устойчивости организма в присутствии веществ с различными стресс-характеристиками. Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование адаптационных изменений антиоксидантного статуса эритроцитов в результате действия БХ и ГХ in vitro.
Материалы и методы исследования
В работе использована периферическая кровь практически здоровых мужчин в возрасте 25 лет. Забор крови производили из вены; антикоагулянтом служил гепарин (25 ЕД на 10 мл крови). Гепаринизирован-
Работа выполнена при финансовой поддержке Краевого фонда науки г. Красноярска (грант № 1М20); Фонда гражданских исследований и развития США (CRDF) и Министерства образования РФ (грант № REC 002).
ную кровь центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин, плазму и лейкоциты удаляли. Эритроциты трижды отмывали центрифугированием с 5 объемами фосфатного буфера (12,5 мМ Na2HPO4 и 150 мМ NaCI, рН 7,4). Отмытые от плазмы и упакованные эритроциты суспендировали в инкубационной смеси (гематокрит 40 %). 1 мл инкубационной смеси с эритроцитами содержал 150 мМ NaCI, 5,6 мМ KCI, 2 мМ MgCI2, 2 мМ CaCI2, 1 мМ Na2HPO4, 24 мМ Трис-HCI-буфер, 10 мМ D-глюкозы. Водные растворы 1,4-бензохинона и 1,4-диоксибензола были использованы в конечной концентрации 20 мкМ. Применение этой концентрации основано на наших результатах, полученных ранее (данные не приводятся; статья направлена в печать). Опытные (с добавлением ГХ или БХ) и контрольные (без добавления поллютантов) образцы инкубировали при комнатной температуре (25 °С) в шейкере (THYS-2, Germany) в течение определенных промежутков времени от 0 до 120 мин. Через определенные временные интервалы пробы отмывали 5 объемами фосфатного буфера (рН 7,4) с последующим центрифугированием и затем в эритроцитах определяли активность ферментов антиоксидантной системы (АОС) и содержание восстановленного глу-татиона (TSH). Активность каталазы (КАТ) (КФ 1.11.1.6) определяли по утилизации перекиси водорода (Н2О2) [2]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1) определяли по накоплению продукта автоокисления адреналина супероксидным анион-радикалом в щелочной среде. За единицу активности принимали количество фермента, которое вызывало 50 %-ное торможение реакции [7]. Активность глутатионпероксидазы (ГП) (КФ 1.11.1.9) определяли при длине волны 340 нм по скорости окисления НАДФН в сопряженной глутатионредуктазной системе в присутствии восстановленного глутатиона [12]. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для окисления 1 мкмоля НАДФН за 1 мин. Активность глутатион^-трансферазы (TST) (КФ 2.5.1.18) определяли при длине волны 340 нм по скорости образования конъюгатов между ^Н и 1-хлор-2,4-динитробензолом [10]. Активность фермента рассчитана с использованием коэффициента молярной экстинции для конъюгатов (9,6 мМ-1см-1) и выражена как милимоль образующихся за 1 мин конъюгатов. Активность глюкоза-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) (КФ 1.1.1.49) определяли по скорости восстановления НАДФ+ до НАДФН, содержание последнего регистрировали при длине волны 340 нм [8]. Активность фермента выражали в мкмоль НАДФН, образованного за 1 мин. Активность глутатионредук-тазы (ГР) (КФ 1.6.4.2) определяли по скорости окисления НАДФН. Активность фермента выражали в мкмолях окисленного за 1 мин НАДФН [9]. Определение количества ^Н основано на взаимодействии ^Н с 5,5’-дитио-бис(2-нитробензойной кислотой) с образованием аниона 2-нитро-5-тиобензоата, который регистрировали при длине волны 412 нм. Концентра-
цию ^Н выражали в мкмолях образованного на 1 мл эритроцитарной взвеси аниона (гематокрит 40 %) [8]. Гематокрит и содержание гемоглобина определяли согласно описанным методам [10]. Определение показателей проводили на спектрофотометре СФ-26 (Россия), активность ферментов рассчитывали на 1 г гемоглобина.
Каждое воздействие БХ и ГХ исследовалось не менее чем в пяти отдельных опытах. При построении таблиц использовались усредненные величины, определенные из четырех-пяти измерений. Достоверность различий оценивали по непараметрическим ранговым критериям Вилкоксона и Манна-Уитни. Расчет осуществляли с помощью пакета статистических программ SPSS 11.5.
Результаты и обсуждение
При контакте эритроцитов с ГХ и БХ наблюдалось повышение активности всех антиоксидантных ферментов. Активность ^Т и СОД увеличивалась в большей степени и в более ранние сроки после воздействия стресса, чем ГП и КАТ. Интересно, что пик активности ^Т и СОД в эритроцитах, подвергнутых воздействию БХ, приходится на 60-ю, а с гидрохиноном — на 90-ю мин (табл. 1, 2).
Изменение активности ГП и КАТ в эритроцитах под влиянием БХ и ГХ имеет сходную динамику, но с той разницей, что инкубация эритроцитов с БХ к 120-й мин обнаружила достоверное (р < 0,05) превышение активности по отношению к соответствующим значениям, полученным в опыте с ГХ.
Обнаруженное несоответствие пиков активности ^Т и СОД в эксперименте с исследуемыми соединениями, возможно, связано с более поздним развитием свободнорадикальных процессов в присутствии ГХ по сравнению с БХ. Также привлекает внимание менее выраженный прирост активности ферментов антиоксидант-ной системы эритроцитов — ^Т, СОД, КАТ, ГП при действии ГХ во временном диапазоне 0—30 мин относительно опыта с БХ. По-вцдимому, характерные изменения указанных параметров в этот период объясняются особенностями химических свойств данных веществ. Известно, что гидрохинону присущи антиоксидантные свойства, в то время как продукт его окисления бензо-хинон выступает в качестве окислителя [1]. Несмотря на антиоксидантные свойства гидрохинона, проявленные в 30-минутный период, дальнейшая экспозиция эритроцитов с этим веществом свидетельствует о его прооксидантном эффекте, хотя и менее выраженном, чем у БХ. Но можно предположить, что с удлинением времени инкубации эритроцитов с ГХ более 2 ч мы, вероятно, обнаружили бы достижение уровня активности рассматриваемых ферментов значений соответствующих показателей, полученных в опыте с БХ на 120-й мин. И тем не менее инкубация эритроцитов с БХ и ГХ в течение двух часов обнаружила адаптивную перестройку ферментативной АОС, свидетельствующую об эффективной нейтрализации введенных в систему чужеродных соединений.
Таблица 1
Изменение показателей антиоксидантной системы эритроцитов, инкубированных по времени (мин)
в присутствии 20 мкМ гидрохинона
Параметр Контроль Минута
15 30 60 90 120
ГП, 17,46±0,54 17,98±0,43 19,03±0,94*** 20,08±0,27** 20,95±0,82** 22,70±0,63*
мкмоль/мин/гНв ( +103) (+109) (+115) (+120) (+130)
геТ, 2,55±0,18 2,68±0,08 2,91 ±0,16*** 3,24 ±0,19* 4,16±0,15* 3,32±0,20*
мкмоль/мин/гНв (+105) (+114) (+127) (+163) (+130)
ГР, 5,68±0,17 5,79±0,11 5,85±0,18 6,13±0,21 6,48±0,32*** 6,70±0,12**
мкмоль/мин/гНв (+102) (+103) (+108) (+114) (+118)
Г6ФДГ, 9,20±0,15 6,16±0,19* 7,08±0,42* 8,28±0,18*** 9,48±0,22 10,03±0,18***
мкмоль/мин/гНв (-67) (-77) (-90) (+103) (+109)
СОД, 1,60±0,07 1,63±0,08 1,81 ±0,06*** 1,90±0,10** 2,37±0,10* 2,03±0,12**
МЕ/гНв (+102) (+113) (+119) (+148) (+127)
КАТ, 26,45±1,51 26,71±0,67 27,77±0,64 30,15±0,40*** 32,53±0,70** 36,24±0,36*
мкат/мл (+101) (+105) (+114) (+123) (+137)
Г8Н, мкмоль/мл клеток 2,02±0,03 2,28±0,07*** (+113) 1,96±0,18 (-97) 1,49±0,18* (-74) 1,82±0,17*** (-90) 2,08±0,10 (+103)
Примечание. Значения, указанные в круглых скобках, представляют процентные изменения (« + » повышение, « —» снижение) по сравнению с соответствующими величинами контрольной группы, принятой за 100 %. Достоверность представлена относительно контрольных значений: * — р< 0,001; ** — р < 0,01; *** — р< 0,05 (для табл. 1, 2).
Таблица 2
Изменение показателей антиоксидантной системы эритроцитов, инкубированных по времени (мин)
в присутствии 20 мкМ бензохинона
Параметр Контроль Минута
15 30 60 90 120
ГП, 17,38±0,29 18,60±0,42 19,12±0,94*** 19,99±0,31*** 21,90±0,90** 25,03±0,63*
мкмоль/мин/гНв (+107) (+110) (+115) (+126) (+144)
Г8Т, 2,60±0,11 2,96±0,07*** 3,25±0,10** 4,42±0,24* 3,56±0,21* 3,33±0,17*
мкмоль/мин/гНв (+114) (+125) (+170) (+137) (+128)
ГР, 5,76±0,10 4,03±0,11* 3,63±0,16* 4,44 ±0,24* 5,41±0,19 6,74±0,18**
мкмоль/мин/гНв (-70) (-63) (-77) (-94) (+117)
Г6ФДГ, 9,12±0,41 8,76±0,20 7,57±0,43** 9,03±0,15 9,67±0,29 10,12±0,15***
мкмоль/мин/гНв (-96) (-83) (-99) (+106) (+111)
СОД, 1,55±0,06 1,72±0,10*** 1,84±0,07** 2,31 ±0,10* 2,06±0,11* 1,92±0,13**
МЕ/гНв (+111) (+119) (+149) (+133) (+124)
КАТ, 27,09±1,02 28,99±0,71 30,34±0,69*** 31,70±0,40** 34,68±0,80* 40,09±0,46*
мкат/мл (+107) (+112) (+117) (+128) (+148)
Г8Н, мкмоль/мл клеток 2,00±0,03 1,34±0,07* (-67) 1,00±0,25* (-50) 1,40±0,10* (-70) 1,78±0,14*** (-89) 1,98±0,09 (-99)
Влияние БХ и ГХ, с характерными для них окислительными и восстановительными свойствами, на компенсаторный ответ ферментативной АОС подтверждают данные по содержанию внутриклеточного небелкового антиоксиданта — восстановленного глутатиона. Концентрация ^Н при инкубации эритроцитов с БХ (окислитель) достоверно снижается (р < 0,001), достигая максимума к 30-й мин с последующей постепенной регенерацией к 120-й мин. В присутствии ГХ повышается уровень ^Н на 15-й мин инкубирования эритроцитов с дальнейшим снижением концентрации к 60-й и восстановлением к 120-й мин относительно контрольных величин. Важно отметить более выраженный спад концентрации ^Н при введении БХ, чем в присутствии ГХ (см. табл. 1, 2). Согласно по-
лученным данным, повышение уровня ^Н на 15-й мин при воздействии ГХ (р < 0,05) происходило несмотря на то, что активность ГР, осуществляющей регенерацию ^Н за счет восстановления его окисленной формы, в течение 30-минутного периода инкубации практически не менялась относительно контрольных значений. Эти данные указывают на то, что в эритроцитах могут иметь место окислительно-восстановительные реакции (без участия ферментов) между окисленной формой глутатиона и ГХ, результатом чего является накопление ^Н. Наблюдаемый спад ^Н в интервалах с 15-й по 60-ю мин в опыте с ГХ, а также с момента введения в инкубационную смесь БХ и до 30-й мин свидетельствует о развитии свободнорадикального окисления, сопряженного с одновре-
менной активацией ферментов АОС. Медленное восстановление ^Н с 30-й и 60-й мин в опытах с БХ и ГХ указывает на включение механизмов антиоксидан-тной защиты, обеспечивающих резистентность эритроцитов к действию экстремальных факторов.
По-другому реагируют на присутствие стресс-агентов оксидоредуктазы: ГР и Г6ФДГ. Так, при инкубировании эритроцитов с БХ в динамике активностей обоих ферментов наблюдается провал с максимумом на 30-й мин с последующим стабильным ростом уровня к 120-й мин инкубации. Подобный провал в активности Г6ФДГ с максимальным значением на 15-й мин и отсутствие каких-либо достоверных изменений со стороны ГР до 60-й мин проявляются в результате воздействия ГХ на эритроциты. Далее в присутствии ГХ активность Г6ФДГ восстанавливается, а ГР достоверно повышается к 90-й мин (р < 0,05) с последующим ростом активности обоих ферментов к 120-й мин.
Ранее была выявлена прямая зависимость между окислительно-восстановительными потенциалами хи-нонов и фенолов и их воздействием на биферментную систему люцифераза — оксидоредуктаза [3]. Возможно, в нашем случае действие ГХ и БХ на активность Г6ФДГ и ГР также связано с происходящими в реакции окислительно-восстановительными процессами. Для полноценной работы этих ферментов необходимы коферменты: окисленный НАДФ+ (для Г6ФДГ) и восстановленный НАДФН (для ГР). Редокс система НАДФ+—НАДФН характеризуется меньшим окислительно-восстановительным потенциалом (0,317 В) по отношению к БХ—ГХ (0,710 В). Следовательно, если в системе присутствует соединение с более положительным или отрицательным, чем у НАДФ+ и НАДФН, окислительно-восстановительным потенциалом, то они (возможно, и другие коферменты) будут восстанавливаться и окисляться в первую очередь. Так, ГХ, участвуя в неферментативном восстановлении окисленного НАДФ+, обеспечивает глутатионредукта-зу необходимым для ее работы кофактором, а глюко-за-6-фосфат дегидрогеназу, напротив, подвергает действию со стороны мощного ингибитора — НАДФН. Показано, что НАДФ+ стабилизирует молекулу Г6ФДГ и сохраняет ее в активном состоянии, а НАДФН — продукт реакции — является сильным ингибитором Г6ФДГ, вызывающим диссоциацию белковой молекулы [11]. БХ оказывает противоположное действие: окисляя НАДФН, он опосредованно снижает скорость глутатионредуктазной реакции, а по обратной связи стимулирует скорость пентозофосфатного пути через активацию Г6ФДГ. Обобщая полученные данные по влиянию БХ и ГХ на активность ГР и Г6ФДГ, можно говорить об участии данных поллютантов в разобщении функциональной активности оксидоредуктаз, связанном с происходящими в их реакциях окислительновосстановительными процессами.
Кроме участия в окислительно-восстановительных процессах, воздействие исследованных веществ на активность ферментов могло заключаться в измене-
нии структуры белка, что впоследствии приводило к снижению его активности. На наш взгляд, этот эффект обнаруживается при анализе активности Г6ФДГ в присутствии БХ в зависимости от времени инкубации. Так, Г6ФДГ является тиолчувствительным ферментом, активность которого помимо регуляции на уровне субстрата может зависить от соотношения окисленных и восстановленных сульфгидрильных ^Н-) групп в молекуле белка [11]. Окисление белковых SН-групп возможно, так как по мере восстановления БХ реализуются два эффекта: образование анион-радикала семихинона и снижение восстанавливающих эквивалентов (см. табл. 2), в совокупности ведущие к сдвигу соотношения антиоксидант/прооксидант в сторону последних и, следовательно, к накоплению продуктов окислительных процессов. Регенерация ^Н, по-видимому, напрямую связана с восстановлением окисленных тиоловых групп и, как следствие, активности Г6ФДГ. Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что АОС эритроцитов эффективно противостоит воздействию неблагоприятных факторов среды.
В ходе проделанной работы выявлено:
1) развитие экстремального состояния при воздействии БХ и ГХ сопряжено с интенсификацией окислительных процессов, выраженных в активации ^Т, СОД, КАТ, ГП и снижении уровня ^Н. Активность АОС зависит как от стресс-характеристик веществ, так и от продолжительности воздействия поллютантов;
2) кратковременное воздействие поллютантов характеризуется максимальным ростом ^Т и СОД, которые являются первыми ферментами, реагирующими в ответ на присутствие поллютантов. Более продолжительное воздействие БХ и ГХ на эритроциты приводит к активации КАТ и ГП;
3) гидрохинон обратимо ингибирует Г6ФДГ, а БХ
— глутатионредуктазную реакцию за счет происходящих в ферментативных реакциях окислительно-восстановительных процессов между стресс-агентами и коферментами;
4) ГХ проявляет двоякие свойства: антиоксидант-ные к 15-й мин и прооксидантные с 15-й по 60-ю мин инкубации эритроцитов. БХ при инкубации эритроцитов проявляет себя как инициатор окислительного стресса.
Список литературы
1. Карпович Т. А. Рекомендации к разработке комплексного метода биотестирования сточных вод с использованием рыб в качестве тест-объекта / Т. А. Карпович, В. И. Лукьяненко // Эксперим. водная токсикол. — 1990.
— № 14. — С. 232—237.
2. Королюк М. А. Метод определения активности ката-лазы / М. А. Королюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова // Лаб. дело. — 1988. — № 1. — С. 16—17.
3. Кудряшева Н. С. Закономерности концентрационного тушения биолюминесценции биферментной системы / Н. С. Кудряшева, П. И. Белобров, В. А. Кратасюк. — Красноярск: ИБ СО РАН, 1988. — 37 с.
4. Кулинский В. И. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатиона / В. И. Кулинский, Л. С. Колесниченко // Усп. совр. биол. — 1993. — Вып.
3. — С. 187—195.
5. Меньшиков В. В. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / В. В. Меньшиков. — М.: Медицина, 1987. — 460 с.
6. Подколзин А. А. Антиоксидантная защита организма при старении и некоторых патологических состояниях, с ним связанных / А. А. Подколзин, В. И. Донцов, В. Н. Крутько и др. // Клин. геронт. — 2001. — Т. 3, № 4. — С. 50—58.
7. Сирота Т. В. Новый подход в исследовании автоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы / Т. В. Сирота // Вопр. мед. химии. — 1999. — № 3. — С. 36—42.
8. BeutlerE. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods / E. Beutler. — Orlando: Grune & Stration, 1990.
— Р. 32—33.
9. GoldbergD. M. Glutathionеreductase / D. M. Goldberg, R. J. Spooner // Meth. Enzym. — 1983. — Vol. 3. — P. 258—265.
10. Habig W.H. Glutathione-S-transferases. The first enzymes step mercapturic acid formation / W H. Habig, M. J. Pabst, W B. Jacoby // J. Biol. Chem. — 1974. — Vol. 249. — P. 7130—7139.
11. McMillan D. C. Favism: effect of divicine on rat erythrocyte sulfhydryl status, hexose monophosphate shunt activity, morphology, and membrane skeletal proteins / D. C. McMillan // Toxicol. Sci. — 2001. — Vol. 62, N 2. — P. 353—359.
12. Paglia D. E. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathioneperoxidese /
D. E. Paglia, W N. Valentine // J. Clin. Lab. Med. — 1967.
— Vol. 70. — P. 158—169.
INFLUENCE OF POLLUTANTS WITH VARIOUS STRESS-CHARACTERISTICS ON ANTIOXIDANT STATUS ERYTHROCYTES in vitro
А. М. ^dryashov, *N. M. TOova, *Е. V. ^dryashova
Regional Narcological Dispensary,
*State University, Krasnoyarsk
In the present work has investigated to influence with the benzoquinone and hydroquinone in concentration 20 mmol on the condition of enzymatic the antioxidant system erythrocytes in vitro. At the experiment was demonstrated adaptation of red blood cells it is associate with early to activation of the glutathine-S-transferase, superoxide dismutase and it is late — glutathione peroxidase, catalase. The reverse inhibition of glucose-6-phosphate dehydrogenase and glutathione reductase reactions by the hydroquinone and benzoquinone, accordingly has found. The kinetics of oxidation and regeneration the glutathione have an effect on moment to include in compensatent mechanisms in reply to action of stress-agents. The obtain dates were summated, it is possibly to tell about effective to compensation and adaptation of erythrocytes, that were allowed to stood the extremal influence on the red blood cell.
Key words: antioxidant system, pollutants, red blood cells.
