CC BY
76
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 612.112.94.015.2:612.6
Руденко К.А., Тугуз А.Р, Анохина Е.Н., Муженя Д.В.
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ IL-17A (G197/197A), TNFa (G308/308A), IL-6 (C174/174G) НА СПОНТАННУЮ И СТИМУЛИРОВАННУЮ IN VITRO ПРОДУКЦИЮ ОСНОВНЫХ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ
ФГБУ ВПО Адыгейский государственный университет, НИИ комплексных проблем, 385000 г Майкоп, РФ
Влияние полиморфизмов генов трех основных провоспалительных цитокинов первой волны интерлейкина (IL) 17А (G197/197A), фактора некроза опухоли a (TNFa) (G308/308A), IL-6 (C174/174G) на спонтанную и стимулированную in vitro продукцию медиаторов в норме и при бронхиальной астме (БА) подтверждено для IL-17A. Гипопродукция IL-17A, сопряженная с носительством мутантной 197А-аллели гена IL-17A в гомозиготном и в большей степени гетерозиготном состоянии, может быть одной из причин изменения базовой воспалительной реакции при БА. Спонтанная продукция IL-6 МНК у больных БА повышена при наличии мутантной G174-аллели, гетерозиготного и гомозиготного генотипа. Сывороточный уровень TNFa, равно как и его продукция мононуклеарными клетками периферической крови (МНК), не определяется генотипом по исследованному локусу. Отмечено снижение спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции IL-17А МНК на фоне высокого сывороточного уровня у доноров и больных. Экспериментальные данные по ассоциации патологической 197А-аллели и А197А-генотипа IL-17А с риском развития БА у жителей Республики Адыгея подтверждают аналогичные закономерности для других этнических групп.
Ключевые слова: провоспалительные цитокины; SNP-генов; IL-17A (G197/197A); TNFa (G308/308A), IL-6 (C174/174G); бронхиальная астма; мононуклеарные клетки периферической крови; продукция спонтанная и стимулированная in vitro ФГА.
Rudenko K.A., Tuguz A.R., Anokhina E.N., Muzhenya D.V
INFLUENCE OF GENES IL-17A (G197/197A), TNFA (G308/308A), IL-6 (C174/174G) POLYMORPHISMS ON SPONTANEOUS AND IN VITRO STIMULATED PRODUCTION OF MAJOR PRO-INFLAMMATORY CYTOKINES IN ASTHMA
Adyghe State University, 385000, Maykop, Russian Federation
The influence of gene polymorphisms 3 basic inflammatory cytokines “first wave” IL-17A (G197/197A), TNF-alpha (G308/308A), IL-6 (C174/174G) on spontaneous and stimulated in vitro production of mediators in norm and in bronchial asthma confirmed for IL-17A. Hypo-products IL-17A, coupled with the carrier “mutant”A alleles of IL-17A in homozygous and heterozygous state, is one of the reasons of change in the underlying inflammatory reaction in bronchial asthma. Spontaneous production of IL-6 OLS BA patients improved with a “mutant” G174 alleles, heterozygous and homozygous genotype. Serum levels of TNF-alpha and its products MNCs are not determined by the genotype by the investigated locus. Decreased spontaneous and stimulated in vitro PHA production of IL-17A MNCs on the background of high serum levels in donors and patients. Experimental data on the Association pathological A alleles and AA genotype of IL-17A with the risk of ad in residents of RA confirm similar laws for other ethnic groups.
Key words: pro-inflammatory cytokines; SNP genes; IL-17A (G197/197A); TNF-alpha (G308/308A); IL-6 (C/174G);
bronchial asthma; mononuclear cells of peripheral blood (MNCs); products of the spontaneous and stimulated in vitro PHA.
Введение. Полиморфизмы промоторных регионов генов основных провоспалительных цитокинов интерлейкина (IL) 17А (G197/197A, rs2275913), фактора некроза опухоли а (TNFa) (G308/308A, rs1800629), IL-6 (C174/174G, rs1800795) приводят к их гипо- или гиперпродукции, что вызывает трансформацию базовой воспалительной реакции и является возможной причиной развития хронических заболеваний, в том числе бронхиальной астмы (БА). Данные о повышении уровня провоспалительных цитокинов TNFa и IL-6 в крови при различных атопических реакциях (аллергия и БА) не учитывали влияния полиморфных вариантов генов на цито-киновый статус больных [1].
Для триггерного IL-17A, запускающего каскад воспалительных медиаторов первой волны, из семи SNP (rs1892280,
Руденко Ксения Андреевна (Rudenko Kseniya Andreevna), lab_genetic@mail.ru
rs10807439, rs3819024, rs8193036 rs17880588 rs17878530 rs2275913) гена IL-17A, по данным базы HuGEN, с БА только у китайцев достоверно ассоциирована мутантная 197А-аллель (rs2275913) [2]. Влияние 197А-аллели гена IL-17A на сывороточный уровень и продукцию мононуклеарными клетками периферической крови (МНК) не исследовано.
С БА, по данным HuGEN, ассоциированы C1031T-, G308A-, C863A-, G238A-, C857A-, A1078G-полиморфизмы гена TNFa, однако в ряде работ, проведенных для географически удаленных регионов, исследованы преимущественно G308A-полиморфизмы гена TNFa. У жителей Великобритании, США, Мексики, Кореи, Японии, России при БА чаще выявляют 308А-аллель, для египтян характерна БА, ассоциированная с G308-аллелью, а в Китае, по данным четырех исследований, при БА определяют G- и А-аллели TNFa. Вместе с тем есть сведения об отсутствии ассоциации G308/308А-аллелей гена TNFa с хроническими воспалитель-
- 92 -
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Таблица 1
Распределение частоты аллелей, генотипов IL-17A, TNFa, IL-6 у доноров и больных БА
Аллель/ Частота аллелей и
Ген генотипов X2 OR (95% CI)
генотип больные БА доноры
IL-17A G197A G 0,564 0,765 6,98* 0,40 (0,20-0,80)
(n = 47/34) A 0,436 0,235 2,51* (1,26-5,03)
GG 0,404 0,559 8,45* 0,54 (0,22-1,31)
GA 0,319 0,412 0,67 (0,27-1,68)
AA 0,277 0,029 12,62* (1,56-101,97)
TNFa G308A (n = 61/38) G 0,795 0,882 2,46 0,52 (0,23-1,19)
A 0,205 0,118 1,92 (0,84-4,37)
GG 0,607 0,789 4,14* 0,41 (0,16-1,05)
GA 0,377 0,184 2,68* (1,02-7,07)
AA 0,016 0,026 0,62 (0,04-10,16)
IL-6 C174G (n = 37/34) С 0,419 0,412 0,01 1,03 (0,53-2,01)
G 0,581 0,588 0,97 (0,50-1,89)
СС 0,216 0,235 0,21 0,90 (0,29-2,73)
GA 0,405 0,353 1,25 (0,48-3,27)
GG 0,378 0,412 0,87 (0,34-2,25)
Примечание. Здесь и в табл. 2: n - количество обследованных больных/ доноров; * - статистически значимые отличия между показателями у больных БА и доноров (р < 0,05).
ными заболеваниями легких. Так, у больных с БА, проживающих в Белоруссии, частота распределения G308/308А-аллелей гена TNFa достоверно не отличалась от таковой у здоровых жителей [3-5]. По данным S. Hoffmann и соавт., носительство патологической 308А-аллели связано с увеличением продукции TNFa в 2-5 раз [6].
Наибольшее количество работ, ориентированных на поиск полиморфизмов генов, которые ассоциированы с БА, направлено на IL-6 и, в частности, с C174G SNP (rs1800795). В работах A. Settin и соавт. (Египет, 2008) и D. Trajkov и соавт. (Македония, 2008) показано, что риск развития БА связан с нормальной С174-аллелью IL-6 и нормальным СС-генотипом [7,
8]. C174G-полиморфизмы гена IL-6 влияют на продукцию медиатора: носительство 174G-аллели статистически значимо сочетается с гиперпродукцией IL-6, а нормальный гомозиготный генотип (С174/174С) связан с его пониженной секрецией [9].
Исследования по определению синтропных генов, ассоциированных с хроническими воспалительными заболеваниями легких в регионах России, их влиянию на сывороточный уровень, продукцию спонтанную и стимулированную in vitro ФГА разными клеточными популяциями не проведены.
Цель работы - изучить частоту распределения полиморфизмов генов основных провоспалительных цитокинов И-17А (G197/197A), TNFa (G308/308A),
IL-6 (C174/174G) и их влияние на спонтанную и стимулированную in vitro ФГА продукцию МНК при БА у жителей Республики Адыгея (РА).
Материалы и методы. В исследовании участвовали 99 жителей РА: неродственные доноры (n = 38) в возрасте 18-43 лет без клинических проявлений, наследственной отягощенности БА и больные в возрасте 19-56 лет (n = 61) пульмонологического отделения Адыгейской республиканской клинической больницы с тяжелыми формами БА, диагностированными в соответствии с критериями GINA, 2011. Полиморфизмы генов IL-17А (G197/197A rs2275913), TNFa (G308/308A rs1800629), IL-6 (C174/174G rs1800795) исследовали SNP-методом на тест-системах НПФ «Литех» (Москва) с электрофоретической детекцией результатов. Геномную ДНК выделяли из периферической крови доноров и больных «ДНК-экспресс кровь» НПФ «Литех» (Москва). Концентрацию и качество образцов ДНК тестировали на спектрофотометре NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, США).
МНК выделяли из стабилизированной гепарином (25 ЕД/ мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла («Histopaque», плотность 1077, Sigma, США), центрифугированием при 4°С и 400 g в течение 30 мин. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и троекратно отмывали средой 199 («ПанЭко», Москва). После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин и 4°С.
Для исследования спонтанной и стимулированной ФГА (5 мкг/мл; «ПанЭко», Москва) продукции TNFa МНК культивированы при 37оС и 5% С02 в течение 18 ч в среде RP-MI-1640 («ПанЭко», Москва) с добавлением 10% фетальной сыворотки, 80 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Москва) в 96-луночных плоскодонных планшетах (Costar, США) в концентрации 2-106 мкл/мл.
Уровень 1Б-17А, TNFa, IL-6 в сыворотках, супернатантах МНК у доноров и больных определяли иммуноферментным анализом (ELISA) с помощью коммерческих тест-систем «Вектор БЕСТ» (Новосибирск), «Цитокин» (Санкт-Петербург) на плашечном спектрофотометре (BioRad, США) при длине волны 450 нм.
Статистически значимые различия (р < 0,05) частоты аллелей гена ГБ-17А (G197/197A rs2275913), TNFa (G308/308A rs1800629), IL-6 (074/174G rs1800795) рассчитывали с ис-
пользованием непараметрического метода Фишера, %2, OR (odds-ration - отношение шансов), 95% доверительного интервала (95% СГ); концентрации цитокинов - параметрического t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Статистически значимые различия по частоте полиморфных вариантов и генотипов исследованных генов цитокинов между больными и донорами установили в отношении пускового провоспалительного ]Ь-17А. У больных достоверно повышена частота мутантной 197А-аллели (%2 = 6,98; OR = 2,51) и гомозиготного АА-генотипа (%2 = 8,45; OR = 12,62), что можно рассматривать как ассоциированные с риском развития БА у жителей РА (табл. 1). Это согласуется с данными J. Chen и соавт. [2]. G308/308A-аллельные варианты гена TNFa не ассоциированы с БА, однако носительство гетерозиготного GA-генотипа повышает риск развития БА (%2 = 4,14; OR = 2,68). Частота С174/174G-полиморфизмов гена IL-6, завершающего первую волну базовой воспалительной реакции, у больных и доноров достоверно не различалась. Сывороточная концентрация TNFa, IL-6 (р > 0,05) не превышает физиологических значений (ниже 100 пг/мл), не зависит от генотипов исследованных SNP, статистически значимо не различается у больных и доноров. Концентрация IL-17A в нативной сыворотке у больных БА и доноров достоверно не различается для G197G-, G197A-, A197A-генотипов, однако значительно превышает уровень TNFa и IL-6 (табл. 2), достигая 2533 пг/мл. Гиперпродукция !Ь-17А, инициирующего развитие хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний, вероятнее всего, обусловливает вовлечение этого медиатора в патофизиологические процессы [1].
Уровень спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции МНК TNFa, П-17А в супернатантах МНК у больных и доноров достоверно не различается (р > 0,05), однако выявили статистически значимое (р < 0,05) повышение стимулированной продукции IL-6 у больных с патологическим гомозиготным G174G-генотипом (см. табл. 2).
- 93 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
Таблица 2
Влияние SNP-генов IL-17A, TNFa, IL-6 на спонтанную, стимулированную in vitro продукцию медиаторов воспаления МНК у больных и доноров
Концентрация (в пг/мл) в сыворотке, супернатантах интактных и стимулированных МНК
Ген/SNP больные БА доноры t
сыво- ротка1 МНК2 МНК + ФГА3 сыво- ротка1 МНК2 МНК + ФГА3
IL-17A (G197A)
G197/197G 2516,10 1698,28 177,64 2533,62 468,403 425,93 1,9061 1,4622 0,6243
G197/197A 2572,23 39,03 462,32 2542,71 99,80 128,57 0,6791 0,9072 1,0593
A197/197A 2416,66 604,43 455,58 -TNFa (G308A) - - -
G308/308G 14,07 58,93 141,96 14,60 49,90 116,13 0Д721 0,4042 0,7933
G308/308A 28,22 63,41 121,19 10,35 64,18 114,85 0,8941 0,022 0,1163
A308/308A - - IL-6 (d74G) - - -
С174/174С 13,00 44,68 525,45 0 187,29 340,15 -
C174/174G 0 319,39 452,17 0 294,16 361,56 0,1562 0,8313
G174/174G 12,55 210,23 367,53 0 130,96 53,56 0,5332 3,2053*
Примечание. t - критерий Стьюдента, рассчитанный для больных и доно ров в сыворотках (t)1, при спонтанной (t)2 и стимулированной (t)3 продукции.
Влияние исследованных полиморфизмов на спонтанную и стимулированную продукцию медиаторов воспаления отметили преимущественно для IL-17A (см. табл. 2). МНК с нормальным гомозиготным G197G-генотипом продуцируют достоверно более высокий уровень IL-17A, чем с гетерозиготным G197А-генотипом (t = 3,081 прир < 0,05). Снижение продукции IL-17A МНК клетками, носителями мутантного гомозиготного А197А-генотипа (IL-17A), статистически не подтверждено (t = 1,362;р > 0,05).
Уровень TNFa, IL-6 в супернатантах интакных и стимулированных in vitro ФГА МНК у доноров и больных с хро-
ническими воспалительными заболеваниями легких в наших исследованиях (см. табл. 2) не подтвердили данные S. Hoffmann и соавт. [6]; Н. Ohman и соавт. [9], о влиянии rs1800629, rs1800795 SNP на спонтанную и стимулированную продукцию этих медиаторов, что может быть обусловлено небольшой выборкой обследованных групп.
Быводы. 1. Полиморфизмы генов промоторных регионов генов IL-17A и IL-6 влияют на продукцию соответствующих медиаторов МНК: 197А-аллель IL-17A в гетерозиготном и гомозиготном состоянии подавляет спонтанную продукцию цитокина, G174G-генотип IL-6 повышает стимулированную in vitro ФГА продукцию IL-6.
2. G308A-полиморфизмы промоторного региона гена TNFa не оказывают влияния на сывороточный уровень, спонтанную и стимулированную продукцию медиатора.
3. С риском развития БА у жителей РА ассоциированы мутантная 197А-аллель, А197А-генотип IL-17A (rs2275913) и гетерозиготный G308A генотип TNFa (rs1800629).\
REFERENCES
at: http://www. geneProspector
1. HuGENavigator (2013). Available hugenavigator.net/HuGENavigator/
(accessed June 2013).
2. Chen J., Deng Y., Zhao J., Luo Z., Peng W., Yang J. et al. The polymorphism of IL-17 G-152A was associated with childhood asthma and bacterial colonization of the hypopharynx in bronchiolitis. J. Clin. Immunol. 2010; 30(4): 539-45.
3. Aoki T., Hirota T., Tamari M., Ichikawa K., Takeda K., Arinami T. et al. An association between asthma and TNF-308G/A polymorphism: meta-analysis. J. Hum. Genet. 2006; 51: 677-85.
4. Zhang Y, Zhang J., Tian C., Xiao Y, He C., Li X. et al. The -308 G/A polymorphism in TNFa gene is associated with asthma risk: an update by meta-analysis. J. Clin. Immunol. 2011; 31: 2174-85.
5. Zedan M., Settin A., Farag M.K., El-Bayoumi M., El Regal ME., El Baz R. et al. Gene polymorphisms of tumor necrosis factor alpha-308 and interleukin-10-1082 among asthmatic Egyptian children. Allergy Asthma Proc. 2008; 29: 268-73.
6. Hoffmann S.C., Stanley E.M., Cox E.D., DiMercurio B.S., Koziol D.E., Harlan D.M. et al. Ethnicity Greatly Influences Cytokine Gene Polymorphism Distribution. Am. J. Transplant. 2002; 2: 560-7.
7. Settin A., Zedan M., Farag M., Regal M., Osman E. Gene polymorphisms of IL-6-174 G/C and IL-1Ra VNTR in
asthmatic children. Indian J. Pediatr. 2008; 75: 1019-23.
8. Trajkov D., Mirkovska-Stojkovikj J., Arsov T., Petlichkovski A., Strezova A., Efinska-Mladenovska O. et al. Association of Cytokine Gene Polymorphisms with Bronchial Asthma in Macedonians. Iran J. Allergy Asthma Immunol. 2008; 7: 143-56.
9. Ohman H., Tiitinen A., Halttunen. M., Lehtinen M., Paavonen J., Surcel H.M. Cytokine polymorphisms and severity of tubal damage in women with chlamydia-associated infertility. J. Infect. Dis. 2009; 199: 1353-9.
Поступила 04.09.13 Received 04.09.13
- 94 -
