Влияние полифенольных комплексов ядровой древесины и клеточной культуры маакии амурской на магнитно-резонансные томографические показатели печени

Чучалин Владимир Сергеевич; Ратькин Александр Валентинович; Ратькин Е.В.; Федореев С.А.; Булгаков В.П.

Чучалин В.С.'}, Ратькин А.В.1, Ратькин Е.В}, Федореев С.А.2, Булгаков В.П.3

Effect of polyphenolic complexes wood and cellular culture Maackia amurensis on the MR ^mography performance of a liver

Chuchalin V.S., Ratkin A. V., Ratkin Ye.V., Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P.

1 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, г. Владивосток

3 Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток

Проведена сравнительная оценка гепатопротективных свойств полифенольной фракции ядровой древесины маакии амурской (максар) и полифенольного комплекса клеточной культуры маакии амурской.

Терапевтическую эффективность исследуемых объектов оценивали по их влиянию на магнитно-резонансные томографические показатели печени крыс с экспериментальным СИ4-гепатитом. Установлено, что гепатопротективная активность полифенольного комплекса клеточной культуры маакии амурской не уступает эффекту оригинального препарата «Мак-сар».

Ключевые слова: маакия амурская, максар, томография, гепатопротекторы.

Comparative evaluation of hepatoprotective properties of polyphenolic fraction from wood (Maksar) and a polyphenolic complex of cell culture of Maakia amurensis.

Therapeutic efficacy of the objects was assessed by their effect on the MR tomographic performance of the liver of rats with experimental СCl4-hepatitis. Hepatoprotective activity of polyphenol complex cell culture Maakia amurensis is not inferior to the original effect of the drug Maksar.

Key words: Maakia amurensis, Macsar, MR TOmography, hepatoprotectors.

УДК 616.36-073.756.8-073.86:615.322:582.736

Введение

Поиск новых источников субстанций для получения лекарственных средств, способных усиливать регенераторные процессы в печени, и внедрение их в широкую медицинскую практику являются важнейшей задачей, решение которой позволит удовлетворить в полном объеме запросы здравоохранения. Маакия амурская (Maackia amurensis Rupr. et Maxim.) семейства бобовых (Fabaceae) — реликтовое растение Дальнего Востока — служит сырьем для гепатопро-тективного препарата «Максар». Его запасы невелики и достаточно медленно самовозобновляются. Перспектива решения данной проблемы связана с возможностями калусных культур, которые способны

обеспечить практически неограниченные количества исходного материала. В связи с этим важно оценить возможности использования клеточной культуры ма-акии в качестве альтернативного источника сырья для получения гепатопротективных препаратов [1, 3, 4].

Цель исследования — оценить возможность коррекции структуры печени полифенольными комплексами ядровой древесины и клеточной культуры маа-кии амурской при эксперименте.

Материал и методы

Максар — полифенольная фракция ядровой древесины маакии амурской — получен в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (г. Владивосток). На основании результатов клинической апро-

бации Фармакологический государственный комитет МЗ РФ рекомендовал максар в качестве гепатопротек-тора для медицинского применения и промышленного выпуска. В исследованиях использовали субстанцию сухого экстракта маакии амурской, содержащую по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии 21,6% полифенолов, состав которых на 8,9% представлен стильбенами и на 12,7% изофлавоноидами [4, 6].

Полифенольный комплекс маакии амурской (ПКМА) получен в 2002 г. в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН из клеточной культуры растения с помощью экстракции 95%-м этанолом. Клеточная культура Maackia amurensis (штамм А-18) и экстрактивный комплекс на ее основе состоят из изо-флавоноидов, включая изофлавоны и птерокарпаны, а также их моно-, ди- и малонилглюкозиды. В отличие от нативного экстракта из ядровой древесины маакии амурской ПКМА не содержит мономерных и димерных стильбенов. Наработка препарата осуществлена в рамках исследований по созданию новой технологии для получения воспроизводимого источника изофлавонои-дов, а также для изучения путей их биосинтеза [5, 7].

Эксперименты проведены в осенне-зимний период на 50 беспородных белых крысах-самцах массой тела 180—210 г. Животные находились в стандартных условиях содержания на естественном световом режиме, при свободном доступе к воде и пище (температура воздуха в виварии 20—22 °С, влажность 50— 60%, световой режим (день — ночь) — 1 к 1. Кормление животных осуществляли дважды в день с использованием специальных сертифицированных гранул с минеральными и витаминными добавками. Содержание животных соответствовало Правилам лабораторной практики (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.). Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, дека-питацию) осуществляли с 09.00 до 12.00, опыты выполняли, соблюдая Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденные МЗ РФ.

Крысы были разделены на пять групп по 10 особей в каждой: I группа — интактные животные; II — с СС14-гепатитом, которым ежедневно в течение 4 сут вводили в желудок 1,25 мл тетрахлорметана в 50%-м масляном растворе на 1 кг массы тела; III—IV — крысы, получавшие за 2 ч до введения гепатотоксина внутрижелудочно максар из ядровой древесины или

ПКМА в ранее установленной для максара оптимальной эффективной дозе 200 мг/кг массы тела в форме суспензии на 1%-й крахмальной слизи (по 100 мг/кг массы тела за 2 ч до введения тетрахлорметана и спустя 2 ч после введения гепатотоксина); V — контрольные животные, получавшие эквиобъемные количества растворителей.

Терапевтическую эффективность препаратов оценивали по их влиянию на томографические показатели печени. Исследование проводили на магнитно-резонансном томографе PharmaScan US 70/16 фирмы Bruker BioSpin MRI (Coventry, Великобритания), который служит для визуализации высококачественных изображений различных органов и тканей животных массой тела до 350 г. Прибор включает операционный модуль Avance, рабочую станцию Hewlet Paccard и программное обеспечение ParaVision 3.0.1.

С помощью программы Region of Tool Instruments, обеспечивающей работу томографа, был проведен сравнительный анализ объемов печени крыс, а также измерена интенсивность сигнала, отраженного от паренхимы органа.

Характер интенсивности сигнала в МРТ определяется четырьмя параметрами: протонной плотностью (количеством протонов в исследуемой ткани), временем спин-решетчатой релаксации Т1, временем спин-спиновой релаксации Т2, движением или диффузией исследуемых структур.

Были получены Т1- и Т2-взвешенные изображения (Т1-ВИ и Т2-ВИ) печени крыс в режимах RARE 8 и FLASH в аксиальной и коронарной проекциях. Для получения Т2-ВИ использовали импульсную последовательность с параметрами: TR = 2 579,8 мс; ТЕ = 44,5 мс; FOV = 6—8 см, матрица 256 х 256; толщина среза 2 мм; количество срезов от 16 до 18. Для Т1-ВИ использована быстрая импульсная последовательность FLASH, адаптированная для фармаскана, с параметрами: TR = 100 мс; ТЕ = 3 мс; FOV = 6—8 см, матрица 264 х 264; толщина среза 2 мм; количество срезов от 16 до 18.

Экспериментальные данные представлены в виде среднего арифметического М и его стандартной ошибки m. Сравнение средних между группами проводили по непараметрическому критерию Н Краскала— Уоллиса, различия в группах считали значимыми при p < 0,05. Расчеты выполняли с использованием программы Statistica 6.0 для Windows [2].

Результаты и обсуждение

МРТ имеет некоторые преимущества в визуализации патологических изменений печени, вызванных применением гепатотоксинов: исследование не сопровождается лучевой нагрузкой, позволяет получать целостные изображения печени в любой проекции, выявлять их взаимосвязь с билиарной системой без применения контрастных веществ, позволяет оценить отеки и признаки кровотечения. МРТ дает возможность изучить количественную и качественную оценку состояния органа у исследуемых животных.

С ее помощью показано, что терапия ПКМА оказывала защитное действие на клетки печени при интоксикации тетрахлорметаном, что выражалось в уменьшении размеров органа и сокращении интенсивности сигнала от него. При СС14-гепатите регистрировалось увеличение линейных размеров печени на 20% по сравнению с показателями контрольной группы животных. Вероятно, это свидетельствует об острой воспалительной реакции и связанным с ней отеком печеночной ткани. Терапия ПКМА и максаром на фоне интоксикации тетрахлорметаном сохраняла объем печени крыс на уровне размеров органа в контрольной группе (таблица). При этом достоверно значимых различий в степени влияния на геометрические параметры органа между ПКМА и максаром не выявлено. На фоне лечения отмечалась тенденция к нормализации линейных размеров печени в большей степени за счет ее правой доли. Введение растворителей препаратов не сопровождалось изменением параметров, регистрируемых у интактных животных. Таким образом, ПКМА, нормализуя метаболические изменения в печени, препятствует развитию отека и огранивает воспалительное увеличение органа, тем самым сохраняя ее объем.

Влияние ПКМА и гепатопротектора «Максар» на объем печени и интенсивность сигнала от паренхимы печени крыс на Т1-ВИ и Т2-ВИ при остром СС14-гепатите (М ± т, средние из 6—10 определений)

Показатель Экспериментальная группа

Контрольная СС14-гепатит Максар и СС14 ПКМА и СС14

Объем печени, 3 см Интенсивность сигнала Т1-ВИ, усл. ед. Интенсивность сигнала Т2-ВИ, усл. ед. 269,4 ± 14,9 320,2 ± 18,9* 219,5 ± 17,6# 248,9 ± 26,4# 149,1 ± 8,3 224,8 ± 17,7* 114,0 ± 5,5# 137,9 ± 8,0# 51,8 ± 7,3 105,0 ± 12,3* 67,1 ± 7,0# 84,4 ± 13,3#

* р < 0,05 по отношению к контрольным животным для СС14-гепатита.

#р < 0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препаратов.

При терапии ПКМА и максаром на фоне интоксикации гепатотоксином интенсивность сигналов от паренхимы печени крыс изменялась. В группе животных, получавших тетрахлорметан, интенсивность сигнала на Т2-ВИ не менее чем на 50 усл. ед. была выше по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Наиболее существенное увеличение интенсивности сигналов зарегистрировано на Т1-ВИ печени отравленных тетрахлорметаном животных, которое составило 75 усл. ед. Введение ПКМА, так же как и максара, обеспечивало нормализацию интенсивности сигнала от паренхимы органа. Изменение интенсивности сигнала на Т1-ВИ и Т2-ВИ при остром СС14-гепатите, возможно, связано с застойными явлениями в печени, нарушениями ее гемодинамики. При этом у крыс с тетрахлорметановым гепатитом заметно увеличение долевых венозных протоков по сравнению с соответствующими показателями контрольных животных и крыс, леченных ПКМА и максаром (рис. 1— 4).

Рис. 1. Томографический снимок печени крысы контрольной группы

на 5-й день наблюдения

Рис. 2. Томографический снимок печени крысы на фоне острого СС14-гепатита на 5-й день наблюдения

Рис. 3. Томографический снимок печени крысы при терапии макса-ром на фоне острого СС14-гепатита на 5-й день наблюдения

Acodwy VlndtvOitOk, Mv.v -tt-a^^ JO-

во и к км fpect tetf 30 Oct 2004 lli -fc 1*17

RARE BIO (tmnd) Tfi: 257ae m» те 44 5 ma ТА 245NEX2

^ O mm

t Rpv C O cm

9 W мтх га«

•'Pen -11.2 mm P to* KepmiTc l

Рис. 4. Томографический снимок печени крысы при терапии ПКМА на фоне острого СС14-гепатита на 5-й день наблюдения

Заключение

препарат «Максар», при остром экспериментальном гепатите, вызванном тетрахлорметаном, ограничивает развитие морфологических и функциональных нарушений в печени за счет нормализации кровообращения, уменьшения воспаления и отека ткани.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 09-04-99130.

Литература

1. Булгаков В.П., Федореев С.А., Журавлёв Ю.Н. Биотехнология — здоровью человека: научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке // Вестн. ДВО РАН. 2004. № 3. С. 93—99.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998. 459 с.

3. Кулеш Н.И., Максимов О.Б., Глебко Л.И. и др. «Максар» — гепатозащитный препарат из дальневосточного растительного сырья // Тез. докл. на регион. ассамблее «Здоровье населения Дальнего Востока». Владивосток, 1996. С. 263.

4. Федореев С.А., Кулеш Н.И., Веселова М.В. и др. Препарат максар из маакии амурской — эффективное гепато-защитное средство // Материалы регион. науч. конф. «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии»: сб. тез. докл. Владивосток, 2004. С. 98—99.

5. Fedoreyev S., Bulgakov V. Isoflavonoid composition of the Maackia amurensis callus culture // Journal of Biotechnology. 2008. V. 136. P. 140—143.

6. Fedoreyev S.A., Kulesh N.I., Glebko L.I. et al. Maksar: a preparation based on Amur Maackia // Pharm. Chem. J. 2004. V. 38. Р. 605—610.

7. Fedoreyev S.A., Pokushalova T.V., Veselova M.V. et al. Isoflavonoid production by callus cultures of Maackia amurensis // Fitoterapia. 2000. V. 71. P. 365—372.

Полифенольный комплекс клеточной культуры маакии амурской, так же как и гепатопротективный

Поступила в редакцию 16.02.2011 г. Утверждена к печати 01.04.2011 г.

Сведения об авторах

B. С. Чучалин — д-р фарм. наук, зав. кафедрой фармацевтической технологии СибГМУ (г. Томск)

A.В. Ратькин — канд. фарм. наук, доцент кафедры фармацевтической технологии СибГМУ (г. Томск). Е.В. Ратькин — ассистент кафедры фармацевтической технологии СибГМУ (г. Томск).

C.А. Федореев — д-р хим. наук, ст. науч. сотрудник Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (г. Владивосток).

B.П. Булгаков — д-р биол. наук, член-корреспондент РАН, Биолого-почвенный институт ДВО РАН (г. Владивосток).

Для корреспонденции

Чучалин Владимир Сергеевич, тел.: 8-913-116-43-43, (3822) 42-09-58; e-mail: phtech@ssmu.ru