CC BY
12УДК 571.27 :615.099:615.917
влияние подострой интоксикации этиленхлоргидрином на иммунные реакции,
функцию т- и п2-
лимфоцитов и содержание в крови крыс цитокинов
В экспериментах на неинбредных белых крысах установлено, что подострое отравление эти-ленхлоргидрином (0,2 ВЬ50 ежедневно в течение 4 сут) вызывает снижение функции ТМ- и ТЪ2-лимфоцитов в равной степени, уменьшение показателей гуморальных и клеточных иммунных реакций, содержания иммунорегуляторных цитокинов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4 в крови и повышение концентраций провоспалительного цитокина ИЛ-6 и антивоспалительного цитокина ИЛ-10. Ключевые слова: этиленхлоргидрин; ТЫ-, П2-лимфоциты; иммунотоксичность; цитокины.
П.Ф. Забродский, В.В. Масляков, М.С. Громов
Филиал НОУ ВПО «Саратовский медицинский университет "РЕАВИЗ"», 410011, г. Саратов, Российская Федерация
Введение. Этиленхлоргидрин (ЭХГ, (2-хлорэт-анол, хлорэтиловый спирт, хлоргидрин этилен-гликоля) - бесцветная вязкая жидкость со слабым эфирным запахом, хорошо растворяется в воде, этаноле, ацетоне, 1,2-дихлорэтане, хлороформе. Применяется как растворитель неорганических солей, в органическом синтезе (растворяет ацетилцеллюлозу). Используется для получения этиленоксида, тиодигликоля, некоторых красителей, пестицидов и фармацеви-ческих препаратов [1,2]. При аварийных ситуациях, нарушении техники безопасности ЭХГ может вызывать ингаляционные, перораль-ные отравления, легко проникает через кожу. При отравлении ЭХГ поражаются центральная нервная, сердечно-сосудистая системы, почки, печень и другие органы [1,2,3,4]. Учитывая, что при биотрансформаци ЭХГ образуются метаболиты, в основном, такие же, как и при отравлении широко применяющимся в химической промышленности винилхлоридом, возможна при интоксикации ЭХГ реализация мутагенного, канцерогенного, тератогеннного и иммуно-токсического действия [5,6]. Нарушения функции иммунной системы, синтеза лимфоцитами и другими клетками крови цитокинов при отравлении ЭХГ с целью целенаправленной кор-
рекции иммунного гомеостаза для профилактики инфекционных осложнений и заболевания, а также снижения смертности больных не изучено [1-4,7-9].
Целью исследования являлась оценка подо-строго действия ЭХГ (0,2 ВЬ50 ежедневно в течение 4 сут) на иммунные реакции, функцию ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов, а также на содержание в крови иммунорегуляторных, провоспалитель-ных и антивоспалительных цитокинов (у- интерферона - ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10).
Материалы и методы исследования. Эксперименты проводили на 112 нелинейных белых крысах обоего пола массой 180-240 г в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ МЗ РФ №708н от 23.08.2010) ЭХГ (Sigma-Aldгich) вводили внутрижелудочно в дозе 0,2 ВЬ50 в водном растворе (1,0 мл) в течение 4-х сут. ВЬ50 ЭХГ при пероральном введении составляла 53±4 мг/кг. Контрольные животные получали внутрь равный объем воды. Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [10-13]. Гуморальный иммунный ответ к Т-зависимо-му антигену (эритроцитам барана - ЭБ), характеризующую способность ТМ-клеток участво-
Забродский Павел Францевич (Zabrodskii Pavel Franzevich), д.м.н., проф., заслуженный деятель науки Российской Федерации, профессор кафедры медико-биологических дисциплин Саратовского филиала НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ» (Саратовский филиал Самарского медицинского института «РЕАВИЗ»), 410076, г. Саратов, pfzabrodsky@gmail.com
Масляков Владимир Владимирович (Maslyakov Vladimir Vladimirovich), до.м.н., проф., проректор по научной работе Саратовского филиала НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ», заведующий кафедрой клинической медицины, 410076, г. Саратов, maslyakov@inbox.ru Громов Михаил Сергеевич (Gromov Mihail Sergeevich), д.м.н., проф., ректор Саратовского филиала НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ» (Саратовский филиал Самарского медицинского института «РЕАВИЗ»), 410076, г. Саратов, saratov@reaviz.ru
вать в продукции плазматическими клетками IgM, определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации (пик продукции IgM), которую проводили внутрибрюшинно в дозе 2-108 ЭБ. Аналогично оценивали гуморальную иммунную реакцию к Т-независимому брюшнотифозному Vi-антигену (Vi-Ag), отражающую синтез IgM B-клетками (плазмоцитами) селезенки крыс. При этом проводили иммунизацию крыс Vi-Ag в дозе 8 мкг/кг. Функцию Thl-лимфоцитов оценивали также по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ, исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %. Разрешающую дозу ЭБ (5-108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут после иммунизации. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 ч. Функцию ^2-лим-фоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие IgG к ЭБ, в селезенке на 8 сут после иммунизации методом непрямого локального гемолиза в геле [10,11,13].
Оценку активности естественных клеток-киллеров (ЕКК) -естественной цитотоксично-сти (ЕЦ) - и антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ), характеризующую функцию К-клеток, осуществляли спектро-фотометрическим методом через 4 сут после первого введения ЭХГ [10,11]. В контроле и в опытной группе при оценке АЗКЦ крыс иммунизировали внутрибрюшинно через 15-30 мин после первого введения токсиканта.
Концентрацию цитокинов иммунорегулятор-ных цитокинов (ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4), провос-палительного цитокина (ИЛ-6) и антивоспалительного цитокина (ИЛ-10) [10,11] исследовали в плазме крови крыс через 4 сут после инъекции ЭХГ (и иммунизации ЭБ) методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. в соответствии с инструкциями изготовителя.
Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента. Различия между параметрами считались достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение. После подострой интоксикации ЭХГ через 4 сут показатели Т-зависимой гуморальной иммунной реакции - АОК к ЭБ; IgM (функция Th1- и В-лим-фоцитов), АОК к ЭБ (IgG) (функция Th2^ В-лимфоцитов), а также Т-независимого гуморального иммунного ответа (функция В-лим-фоцитов) - АОК к Vi-Ag (IgM) - снижались соответственно в 1,63; 1,59 и 1,54 раза (p<0,05) [табл. 1].
Показатели клеточных иммунных реакций после подострой интоксикации ЭХГ - активность ЕКК, АЗКЦ, функция лимфоцитов
ТМ-типа (реакция ГЗТ) - уменьшались соответственно в 1,71; 1,90 и 1,68 раза (р<0,05).
Полученные данные показывают, что гуморальные и клеточные иммунные реакции при подостром отравлении ЭХГ снижались практически в равной степени (соответственно, в среднем в 1,59±0,14 и в 1,76±0,13 раза; р>0,05).
Средние показатели активности ТМ-клеток (АОК к ЭБ - ^М, реакция ГЗТ) и ^-лимфоцитов (АОК к ЭБ - 1^0) [10,11] при интоксикации ЭХГ уменьшались практически одинаково - соответственно в 1,66 и 1,59 раза.
Существуют основания полагать, что редукция в результате подострого отравления ЭХГ функции лимфоцитов (параметров системы иммунитета) связана с действием на них как молекулы токсиканта, так его более токсичных метаболитов, которые образуются в результате окисления ЭХГ алкогольдегидрогена-зой и альдегиддегидрогеназой соответственно до хлорацетальдегида и хлоруксусной кислоты [2,3,4,6,7,8,14]. Метаболиты ЭХГ ингибируют цикл трикарбоновых кислот в митохондриях лимфоцитов и других клеток [7,8].
Воздействие ЭХГ (табл. 2) приводило к уменьшению концентрации в крови иммунорегу-ляторных цитокинов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4 соответственно в 3,13; 2,73 и 2,89 раза (р<0,05). Концентрация в крови провоспалительного ци-токина ИЛ-6 увеличивалась в 1,62 раза (р<0,05), а содержание антивоспалительного цитокина ИЛ-10 возрастало в 1,43 раза (р>0,05).
После подострого воздействия ЭХГ соотношение ИФНу/ИЛ-4 в контроле составляло 6,8±0,7, а после действия токсиканта - 6,2±0,7. Это подтверждает полученные данные, свидетельствующие о том, что под влиянием ЭХГ ТИ1- и ТИ2-лимфоциты поражаются в равной степени [10,11].
Полученные данные позволяют предполагать, что снижение концентрации в крови иммуноре-гуляторного цитокина ИФН-у обусловлено поражением ЭХГ ТИ1-лимфоцитов, а также ЕКК, К-клеток, осуществляющих АЗКЦ, цитотокси-ческих Т-лимфоцитов [15]. Уменьшение в крови после интоксикации ЭХГ ИЛ-2, вероятно, свидетельствует о супрессии его продукции Т-клетка-ми, в том числе, и лимфоцитами ТИ0- и ТМ-типа, редукции пролиферации Т- и В-клеток, активности ЕКК и АЗКЦ [16]. Снижение в крови ИЛ-4, по-видимому, происходит вследствие поражения ЭХГ и продуктами его метаболизма [6,7,8,14] преимущественно ТИ2- лимфоцитов [10,11,15,17], а увеличение провоспалительного цитокина ИЛ-6 характеризует активацию его синтеза макрофагами, моноцитами и лимфоидными дендритными клетками [13,18], связанную с воспалительными изменениями в печени и почках
Таблица 1
Влияние подострой интоксикации ЭХГ (0,2 DL50 ежедневно в течение 4 сут) на показатели системы
иммунитета белых крыс (М±m, п=9-10)
Функция лимфоцитов Параметры Контроль ЭХГ
Thl-типа и В-клетки АОК к ЭБ (IgM), 103 39,3±4,2 24,1±2,5*
Thl-типа ГЗТ, % 36,0+3,8 21,4±2,3*
Т1л2-типа и В-клетки ЭБ (IgG), 103 25,5±2,6 16,0±18*
В-клетки (плазмоциты) Vi-Ag (IgM), 103 26,8±2,9 17,4±1,7*
ЕКК ЕЦ, % 18,0±1,7 10,5±1,2*
К-клетки АЗКЦ, % 13,3±1,4 7,0±0,9*
Примечание: * -p<0,05 по сравнению с контролем.
Таблица 2
Влияние подострой интоксикации ЭХГ (0,2 DL50 ежедневно в течение 4 сут) на содержание цитокинов в крови белых крыс, пг/мл ^±m, n=7-8)
Цитокины Контроль ЭХГ
ИФН-у 1266±133 405±41*
ИЛ-2 1050±110 384±68*
ИЛ-4 185±18 65±8 *
ИФНу/ИЛ-4 6,8±0,7 6,2±0,7
ИЛ-6 71±9 115±12a
ИЛ-10 398±45 570±60*
Примечание:* -p<0,05 по сравнению с контролем.
вследствие поражения их ЭХГ и продуктами его метаболизма [2,3,4,6,7,8,14].
Повышение концентрации антивоспалительного цитокина ИЛ-10 обусловлено увеличением его синтеза ТИ2-лимфоцитами, макрофагами и В-лимфоцитами [19] и реализацией компенсаторной реакцией CD4+CD25+Foxp3+ регуля-торных Т-клеток, на поражение ЭХГ лимфоцитов, моноцитов и макрофагов [20,21]. Следует отметить, что повышение продукции ИЛ-10 направлено на снижение синтеза провоспалитель-ных цитокинов [11, 19].
Таким образом, иммунотоксическое действие ЭХГ сопровождается супрессией гуморального и клеточного иммунного ответа, нарушением продукции цитокинов лимфоцитами и другими клетками крови. Эти изменения обусловлены, в основном, более токсичными, чем ЭХГ, продуктами его биотрансформации хлораце-
тальдегидом и хлоруксусной кислотой [6,7,8,14]. Механизмами нарушения функции лимфоцитов и других клеток системы иммунитета под влиянием ЭХГ являются ингибирование цикла трикарбоновых кислот в митохондриях клеток иммунной системы [8], инициация перекис-ного окисления липидов мембран клеток и др. [7,8,9,10,12].
Выводы.
1. Подострая интоксикация ЭХГ в ежедневной дозе 0,2 DL50 в течение четырех суток вызывает снижение функции Th1- и ТИ2-лимфоцитов в равной степени, уменьшение показателей гуморальных и клеточных иммунных реакций.
2. При подострой интоксикации ЭХГ снижается содержание иммунорегуляторных цитокинов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4 в крови и увеличиваются концентрация провоспалительного цитокина ИЛ-6 и антивоспалительного цитокина ИЛ-10.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Liu G. Y. T, Richey W. F., Betso J.E., Hughes B., Klapacz J., Lindner J. Chlorohydrins. In: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Wiley-VCH, Weinheim. 2014. Avaiable at: http://onlinelibrary.wiley.com/ doi/10.1002/14356007.a06_565. pub2/abstract
2. Chen Y.T., Liao J.W., Hung D..Z. Protective effects of fomepizole on 2-chloroethanol toxicity. Hum. Exp. Toxicol. 2010; 29(6):507-12.
3. Chen Y.T., Hsu C.I., Hung D.Z., Matsuura I., Liao J.W. Effects of chloroacetaldehyde in 2-chloroethanol-induced cardiotoxicity. Food Chem Toxicol. 2011; 49(5): 1063-7.
4. Hung D.Z., Lee H.P., Huang C.F. The Last Dinner: Fatality of 2-Chloroethanol Intoxication. J. Clin. Toxicol. 2016; 6:314. Avaiable at: https://www. omicsonline.org/open-access/the-last-dinner-fatality-of-2chloroethanol-intoxication-2161-0495-1000314. php?aid=79104
5. Могиленкова Л.А. Воздействие винилхлорида на состояние здоровья работающих в производственных усло-
REFERENCES:
1. Liu G. Y. T., Richey W. F., Betso J.E., Hughes B., Klapacz J., Lindner J. Chlorohydrins. In: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Wiley-VCH, Weinheim. 2014. Avaiable at: http://onlinelibrary.wiley.com/ doi/10.1002/14356007.a06_565. pub2/abstract
2. Chen Y.T., Liao J.W., Hung D..Z. Protective effects of fomepizole on 2-chloroethanol toxicity. Hum. Exp. Toxicol. 2010; 29(6):507-12.
3. Chen Y.T., Hsu C.I., Hung D.Z., Matsuura I., Liao J.W. Effects of chloroacetaldehyde in 2-chloroethanol-induced cardiotoxicity. Food Chem Toxicol. 2011; 49(5): 1063-7.
4. Hung D.Z., Lee H.P., Huang C.F. The Last Dinner: Fatality of 2-Chloroethanol Intoxication. J. Clin. Toxicol. 2016; 6:314. Avaiable at: https://www. omicsonline.org/open-access/the-last-dinner-fatality-of-2chloroethanol-intoxication-2161-0495-1000314. php?aid=79104
5. Mogilenkova L.A. Vozdejstvie vinilhlorida na sostojanie zdorov'ja rabotajushhih
v proizvodstvennyh uslovijah (Obzor).
виях (Обзор). Биомедицинский журнал. Профилактическая медицина. 2011; 12: 558-71. Avaiable at: http://www.medline. ru/public/pdf/12_047.pdf
6. LiaoJ.W., Hsu C.I., Matsuura I., Chen Y.T. Chloroacetaldehyde Induces chromosome aberrations and micronucleus formation but not 2-chloroethanol. J. Health Sci. 2011; 57(3): 300-3.
7. Chen C.H., Chen S.J., Su C.C., Yen C.C., Tseng T.J., Jinn IR,. et al. Chloroacetic acid induced neuronal cells death through oxidative stress-mediated p38-MAPK activation pathway regulated mitochondria-dependent apoptotic signals. Toxicology. 2013; 303: 72-82.
8. Lu T.H., Su C.C., Tang F.C., Chen C.H., Yen C.C., Fang K.M. et al. Chloroacetic acid triggers apoptosis in neuronal cells via a reactive oxygen species-induced endoplasmic reticulum stress signaling pathway. Chem. Biol. Interact. 2015; 225: 1-12.
9. Pourahmad J., Hosseini M.J., Eskandari M.R., Rahmani F. Involvement of four different intracellular sites in
Biomedicinskij zhurnal. Profllakticheskaja medicina. 2011; 12: 558-71 (in Russian). Avaiable at: http://www.medline.ru/ public/pdf/12_047.pdf
6. Liao J.W., Hsu C.I., Matsuura I., Chen Y.T. Chloroacetaldehyde Induces chromosome aberrations and micronucleus formation but not 2-chloroethanol. J. Health Sci. 2011; 57(3): 300-3.
7. Chen C.H., Chen S.J., Su C.C., Yen C.C., Tseng T.J., Jinn IR,. et al. Chloroacetic acid induced neuronal cells death through oxidative stress-mediated p38-MAPK activation pathway regulated mitochondria-dependent apoptotic signals. Toxicology. 2013; 303: 72-82.
8. Lu T.H., Su C.C., Tang F.C., Chen C.H., Yen C.C., Fang K.M. et al. Chloroacetic acid triggers apoptosis in neuronal cells via a reactive oxygen species-induced endoplasmic reticulum stress signaling pathway. Chem. Biol. Interact. 2015; 225: 1-12.
9. Pourahmad J., Hosseini M.J., Eskandari M.R., Rahmani F. Involvement of four different intracellular sites in
chloroacetaldehyde- induced oxidative stress cytotoxicity. Iran. J. Pharm. Res. 2012; 11: 265-76.
10. Забродский, П.Ф., Мандыч В.Г. Иммунотоксикология ксенобиотиков. Саратов: СВИБХБ; 2007.
11. Забродский П.Ф. Иммунотоксикология фосфорорганических соединений Саратов: Саратовский источник; 2016.
12. Курляндский Б.А., Филов В.А., ред. Общая токсикология. М.: Медицина; 2002.
13. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. М.: Мир; 2000.
14. Sakai A, Shimizu H, Kono K, Furuya E. Monochloroacetic acid inhibits liver gluconeogenesis by inactivating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Chem. Res. Toxicol. 2005; 18: 277-82.
15. Schoenborn J.R., Wilson C.B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv. Immunol. 2007; 96: 41-101.
16. Nelson B.H. Interleukin-2 signaling and the maintenance of self-tolerance. Curr. Dir. Autoimmun. 2002; 5: 92-112.
chloroacetaldehyde- induced oxidative stress cytotoxicity. Iran. J. Pharm. Res. 2012; 11: 265-76.
10. Zabrodskij P.F., Mandych V.G. Immunotoksikologija ksenobiotikov. Saratov: SVIBHB; 2007 (in Russian).
11. Zabrodskij P.F. Immunotoksikologija fosfororganicheskih soedinenij Saratov: Saratovskij istochnik; 2016 (in Russian).
12. Kurliandski; B.A. Filov V.A., eds. General Toxicology. Moscow: Medicina; 2002 (in Russian).
13. Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunology. Moscow: Mir; 2000 (in Russian).
14. Sakai A, Shimizu H, Kono K, Furuya E. Monochloroacetic acid inhibits liver gluconeogenesis by inactivating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Chem. Res. Toxicol. 2005; 18: 277-82.
15. Schoenborn J.R., Wilson C.B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv. Immunol. 2007; 96: 41-101.
16. Nelson B.H. Interleukin-2 signaling and the maintenance of self-tolerance.
17. Becker K.L., Nylen E.S., White J.C., Muller B., Snider R.H. Clinical review 167: Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection, and sepsis: a journey from calcitonin back to its precursors. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004; 89 (4):1512-25.
18. Hashmi AM, Butt Z, Umair M. Is depression an inflammatory condition? A review of available evidence. J. Pak. Med. Assoc. 2013; 63 (7): 899-906.
19. Mosser D.M., ZhangX. Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine. Immunol Rev. 2008 ;226:205-18.
20. Said E.A., Trautmann L., Dupuy F., Zhang Y., Shi Y., El-Far M., Hill BJ. et al. Programmed death-1-induced interleukin-10 production by monocytes impairs CD4+ T cell activation during HIV infection. Nat. Med. 2010; 16(4): 452-59.
21. Smith A.J., Humphries S.E. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality. Cytokine Growth Factor Rev. 2009; 20 (1): 43-59.
Curr. Dir. Autoimmun. 2002; 5: 92-112.
17. Becker K.L., Nylen E.S., White J.C., Muller B., SniderR.H. Clinical review 167: Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection, and sepsis: a journey from calcitonin back to its precursors. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004; 89 (4):1512-25.
18. Hashmi AM, Butt Z, Umair M. Is depression an inflammatory condition? A review of available evidence. J. Pak. Med. Assoc. 2013; 63 (7): 899-906.
19. Mosser D.M., Zhang X. Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine. Immunol Rev. 2008 ;226:205-18.
20. Said E.A., Trautmann L., Dupuy F., Zhang Y., Shi Y., El-Far M, Hill BJ. et al. Programmed death-1-induced interleukin-10 production by monocytes impairs CD4+ T cell activation during HIV infection. Nat. Med. 2010; 16(4): 452-59.
21. Smith A.J., Humphries S.E. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality. Cytokine Growth Factor Rev. 2009; 20 (1): 43-59.
P.F. Zabrodskii, V.V. Maslyakov, M.S. Gromov
THE EFFECT OF SUBACUTE INTOXICATION WITH ETHYLENE CHLOROHYDRIN ON IMMUNE RESPONSES, TH1 AND TH2 LYMPHOCYTE FUNCTION AND CYTOKINE LEVELS
IN RATS BLOOD
Branch of the Private Educational Institution of Higher Education " Saratov Medical University "REVIZ", 410011 Saratov, Russian Federation
In experiments on outbred albino rats, it was established that subacute intoxication with ethylene chlorohydrin (0.2 LD50 daily for 4 days) causes a decrease in Th1 and Th2 lymphocytes function to the same extent, diminishes parameters of humoral and cellular immune responses and the content of immunoregulatory cytokines IFN-y, lL-2, IL-4 in blood, increases concentrations of pro-inflammatory cytokine IL-6 and anti-inflammatory cytokine IL-10.
Keywords: ethylene chlorohydrin, Th1-, Th2-lymphocytes, immunotoxicity; cytokines.
Материал поступил в редакцию 09.03.2017 г.
