CC BY
65
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 1 - P. 65-70
УДК: 616-001.37 DOI: 12737/25242
ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНА 6 И ПАРАКРИННЫХ ФАКТОРОВ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ КОЖИ КРЫСЫ ПРИ ХИМИЧЕСКОМ ОЖОГЕ
А.В. КОЧКИНА
ФГБОУВО «Тульский государственный университет», пр-т Ленина. 98, Тула, 300012, Россия
Аннотация. Статья посвящена совместному и отдельному влиянию препаратов паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток и пероксиредоксина 6 на течение химического ожога кожи. Рассмотрены эффекты воздействия используемых препаратов на процесс регенерации кожи после аппликаций трихлоруксусной кислотой. Оценку результатов проводили на основе визуального осмотра в течение 7 суток с момента ожога. Помимо этого, через 24 часа после нанесения ожога определялась относительная концентрация маркера клеточной пролиферации Ki-67 и маркера апопто-за Cas 3, а так же уровень цитокинов в тканях. Концентрация Ki-67 была намного выше в группах с лечением. Относительная концентрация Cas 3 в группах с лечением ниже относительно контрольной группы. Была показана высокая эффективность применения пероксиредоксина 6 при лечении химического ожога, что связано с подавлением данным ферментом-антиоксидантом окислительного стресса. Исходя из результатов анализа профиля цитокинов, сделан вывод о том, что в группе с совместным применением пероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток активнее всего проходят процессы клеточной пролиферации и заживления ткани, так как общий уровень цитокинов стимулирующих воспаление в данной группе снижен.
Ключевые слова: химический ожог, пероксиредоксин 6, регенерация кожи, паракринные факторы мезенхимальных стволовых клеток.
EFFECT OF PEROXIREDOXINS 6 AND PARACRINE FACTORS OF MESENCHYMAL STEM CELLS ON THE CYTOKINE PROFILE RAT SKIN IN CHEMICAL BURNS
A.V. KOCHKINA Tula State University, Prospect Lenina 98, Tula, 300012, Russia
Abstract: The article is devoted to joint and individual influence of paracrine factors of mesenchymal stem cells and peroxiredoxin 6 for chemical skin burns. The author presents the effects of exposure to the drugs used in the process of skin regeneration after trichloroacetic acid applications. The results were evaluated based on visual observation for 7 days after burn. Besides, 24 hours after application of the burn was determined relative concentration of the cell proliferation marker Ki-67 marker and apoptosis Cas 3, as well as the level of cytokines in the tissue. Ki-67 concentration was higher in the treatment group. Relative concentration Cas 3 treatment groups with respect to the control group below. It was shown the high efficiency of peroxiredoxin 6 for the treatment of chemical burns, which is associated with the suppression of this en-zyme-antioxidant oxidative stress. Based on the results of analysis of the profile of cytokines, the author concluded that the combined treatment group peroxiredoxin 6 and paracrine factors of mesenchymal stem cells are most active cell proliferation and tissue healing processes, as the total level of cytokines stimulate inflammation in this group was reduced.
Key words: chemical burn, peroxiredoxin 6, skin regeneration, paracrine factors of mesenchymal stem cells.
Химические ожоги возникают в результате попадания на кожу агрессивных химических веществ, таких как кислоты, щелочи. Степень повреждения зависит от его концентрации и
длительности контакта. Химический ожог сопровождается мощным окислительным стрессом, развитием воспалительного процесса, интенсивным некрозом и апоптозом клеток эпи-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 1 - P. 65-70
телия. Один из важных факторов лечения ожога — обеспечение адекватных комфортных условий для собственной регенерации [1,2,6,7].
В коже антиоксидантная система представлена набором ферментов-антиоксидантов, основным из которых является пероксиредоксин 6 (Ргх 6). Ранее была показана высокая эффективность применения Ргх 6 при лечении ряда патологий (ожоги трахеи, резаные раны, ише-мически/реперфузионные поражения почки и кишечника, повреждения кожи после УФ-облучения) [3,5,11,12]. Причем, локализация экзогенного Ргх 6 такая же, как и эндогенного [4]. Использование экзогенного Ргх 6 нейтрализует окислительный стресс, возникающий при повреждении ткани.
Эффективное применение факторов роста в регенеративной медицине показано при восстановлении костной, соединительной, эпителиальной тканей. Паракринные факторы ме-зенхимальных стволовых клеток (МСК) обладают прогенераторным, антивоспалительным и антиапоптотическим действием [8,9], что способствует ускорению восстановления поврежденной ткани при химическом ожоге.
Следовательно, оптимальными условиями восстановления эпидермиса кожи после химического ожога являются: нейтрализация окислительного стресса и интенсификация процессов регенерации в коже. Целью данной работы является оценка эффективности влияния препаратов на основе паракринных факторов ме-зенхимальных стволовых клеток и пероксире-доксина 6 на регенерацию кожи при химическом ожоге.
Цель исследования - являлось определение уровня цитокинов в коже крысы при химическом ожоге при лечении пероксиредоксином 6 и паракринными факторами МСК.
Материалы и методы исследования. В работе были использованы: 1. Рекомбинант-ный человеческий пероксиредоксин 6 был получен в лаборатории механизмов рецепции Института биофизики клетки РАН. 2. Белки из культуральной среды мезенхимальных стволовых клеток свиньи были получены в НИИ им. Склифосовского. Эти белки представляют собой набор паракринных факторов культивируемых стволовых клеток, среди них обнаружены различные факторы роста, а также большое количество интерлейкина 6.
Исследование заключалось в изучении
процессов репарации на модельной ожоговой ране животных. Химический ожог моделировали на самцах популяции Wistar массой 200250 г, возрастом 6-8 недель, полученных из вивария ИБК РАН г. Пущино. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для эксперимента и других научных целей» и законодательством Российской Федерации.
Протокол эксперимента включал введение животного в длительный наркоз. После депиляции паравертебральной области спины, создавали контактный ожог пропитанной в 40% трихлоруксусной кислоте фильтровальной бумагой площадью 10*10 мм2. Время экспозиции пропитанной бумаги составило 3 минуты, после чего место нанесения ожога промывалось проточной водой 15 секунд. После нанесения ожога через 2 часа в депилированную паравер-тебральную область спины были сделаны инъекции препаратов (300 мкл, 10 введений по 30 мкл), площадь обкалывания 15*15 мм2.
В зависимости от вводимого препарата, животные были разделены на 2 группы: 1 группа (контрольная) - физиологический раствор;
2 группа - пероксиредоксин-6 (2 мг/мл);
3 группа - кондиционированная среда МСК (раствор, 10 мг/мл); 4 группа - пероксиредок-син-6 (4 мг/мл, 150 мкл) + кондиционированная среда МСК (10 мг/мл, 150 мкл).
Оценку результатов проводили на основе визуального осмотра в течение 7 суток с момента ожога, так же определялась концентрация цитокинов в тканях (вывод из эксперимента через 24 часа после ожога).
Цитокины (интерлейкины) IL 8, IL 6, Л10, определяли методом иммуноферментного анализа через 24 часа после нанесения ожога, так же были определены относительные концентрации cas-3, ki-67. Оптическую плотность измеряли на мультискане (Labsystems Multiskan Plus, Финляндия. При длине волны=405 нм. Проверка достоверности различий осуществлялась по критерию Стьюдента (t). Критический уровень значимости р (например, «критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение. Так как ожог был сделан трихлоруксусной кислотой, которая на месте контакта с тканями вызывает
денатурацию белков с развитием коагуляцион-ного некроза и обезвоживанея тканей, на месте ожога сформировался плотный, темный, поверхностный струп.
На третьи сутки после ожога отмечается положительная динамика регенерации кожи во всех группах. Наименьшее заживление наблюдается в контроле. Ожоговый струп чётко виден. В группах с лечением заживление внешне прошло успешнее, чем в контроле.
В г
Рис. 1. Внешний вид ожога на 7 сутки. А - контроль, Б - Ргх 6, В - факторы МСК, Г - Ргх 6 и факторы МСК
На 7 сутки во всех трёх группах произошло отшелушивание струпа. В контрольной группе наблюдается место нанесения ожога (рис. 1А), причем регенерация кожи происходит дольше, чем в группах с лечением. В группах с применением Ргх 6 наблюдается наилучший эффект (рис. 1Б, 1Г), процесс регенерации полностью завершился, морфологических изменений не наблюдается. Применение паракринных факторов МСК так же благотворно повлияло на регенерацию эпителия (рис. 1В), однако, процесс восстановления кожного покрова полностью не завершен.
Универсальным маркером для оценки клеточного цикла является ядерный белок - антиген Кг-67, по экспрессии которого можно исследовать пролиферативную активность клеток. Кг-67 - белок, который синтезируется в ядрах только тех клеток, которые находятся в процессе деления. Полученные данные имму-ноферментного анализа на маркер клеточной
пролиферации Ki-67 отражены на рис. 2.
Относительная концентрация Ki-67 и Cas 3
ожог Ргх МСК Ргх+МСК
Рис. 2. Относительная концентрация Ki-67 и Cas-3 в
поражённой коже. Примечание: * - статистически достоверные различия между опытной и контрольной группами, р<0,05)
Сравнивая эффект применения препаратов на основе фермента-антиоксиданта Prx 6, паракринных факторов МСК, а так же совместного применения двух препаратов, заметим, что во всех трех группах наблюдается повышенная концентрация Ki-67 в процентах относительно контроля.
Каспазы играют важную роль в процессах апоптоза, некроза и воспалительных процессах. При стрессовых условиях и воздействии на клетку повреждающих веществ активируется процесс контролируемой клеточной гибели - апоптоз. Результатом апоптоза является постепенное и медленное избавление от «ненужных» в функциональном отношении на данный момент клеток, например, с серьезными нарушениями структуры или функции генетического аппарата. Когда же на клетку оказывают воздействия повреждающие факторы в чрезмерных дозах, апоптоз переходит в стадию неконтролируемой клеточной гибели, т.е. некроз. Так, вследствие, химического ожога сначала в ткани происходит процесс энергозависимого апоптоза, когда же концентрация повреждающего химического агента воздействующего на ткань увеличивается, и количество разрушенных клеток начинает превышать количество пролиферирующих, происходит нарушение гоместостаза клеточных популяций и в организме наступает стадия некроза.
Так как каспаза 3 (Cas 3) является ключевой эффекторной каспазой, в процессе апоптоза, её можно использовать в качестве основного маркера клеточной гибели.
В анализе на наличие фермента Cas 3, ин-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 1 - P. 65-70
дуцирующего процессы апоптоза, было отмечено, что в группах, где после ожога использовались препараты пероксиредоксина 6 и пара-кринных факторов МСК, относительная концентрация Cas 3 была ниже, по сравнению с контрольной группой.
Сравнивая относительную концентрацию Cas 3 в тканях после применения препаратов с контрольной группой, заметим, что в группе контроля относительная концентрация каспа-зы почти в 2 раза выше, чем в группах с лечением. Из этого можно сделать вывод, что препараты с Prx 6 и факторами МСК уменьшают выделение каспазы 3 в клетках поражённой ткани, а следственно снижают интенсивность апоптоза.
Кроме того, можно отметить, что наименьшую относительную концентрацию Cas 3 содержат группы, в которых присутствует фермент-антиоксидант Prx 6. Это может быть связано с тем, что фермент Prx 6 нейтрализует активные форма кислорода, которые, вступая во взаимодействия с липидами мембран, молекулами ДНК, вызывают оксидативный стресс. АФК повышают проницаемость мембран, ин-гибируют катионные помпы, потенцируют дефицит АТФ и избыток внутриклеточного кальция, что приводит к развитию повреждения клетки и ткани. Если митохондрии не справляются с удалением активных форм кислорода, последние инициируют открытие пор во внешней мембране и выход в цитозоль белка, ответственного за каскад реакций, ведущих к синтезу протеаз, к примеру, таких как каспазы. Следственно, в повреждённой ткани происходит увеличение концентрации каспаз, которую можно понизить, c помощью фермента-антиоксиданта Prx 6 способного нейтрализовать активные формы кислорода, индуцирующие процесс запуска апоптоза.
В результате ожога в пораженной области возникает процесс воспаления, при котором белки плазмы и лейкоциты крови переходят из микроциркуляторных сосудов в очаг воспаления. Ход воспалительного процесса управляется медиаторами воспаления - эндогенными веществами, которые появляются в очаге воспаления. Одним из важнейших медиаторов воспаления является IL 6. Он продуцируется фибробластами, активированными моноцитами, нейтрофилами и макрофагами. Уровень IL 6 коррелирует с глубиной поражения площадью
ожога. Иммунологическое действие Я, 6 включает увеличение р-клеточной пролиферации и продукции иммуноглобулинов [10]. Свойства К 8 вызывать миграцию клеток участвующих в воспалении и способствовать их адгезии делают его активным участником острой воспалительной реакции в местах поражения ткани.
Кроме цитокинов стимулирующих воспаление, существуют цитокины действующие в противовоспалительном направлении. В качестве такого цитокина выступает К 10. Секреция этого цитокина не позволяет воспалению приобрести неконтролируемый характер. К 10 продуцируется Г-клетками, моноцитами, макрофагами и р-клетками. Как противовоспалительный цитокин, Л, 10 угнетает продукцию провоспалительных цитокинов, в то же время К 10 усиливает пролиферацию Б-клеток, защищает их от апоптоза.
Рис. 3. Относительная концентрация интерлейкинов
в поражённой коже. Примечание: * - статистически достоверные различия между опытной и контрольной группами, р<0,05)
Анализ гистограммы цитокинов (рис. 3) показал, что в группе с физ. раствором относительная концентрацияпровоспалительного ци-токина К 8 была ниже 30%, а концентрация цитокина К 6 выше на 20%, по сравнению с контрольной группой.
В группе с препаратом Ргх 6 относительная концентрация всех исследуемых цитокинов была ниже, чем в контрольной группе. Концентрация цитокинов К 6 и К 8 на 50-55%, а противовоспалительного цитокина К 10 на 46%, по сравнению с контролем.
Так же наблюдается меньший рост интерлейкинов К 8 и К 10 в группе с препаратом факторов мезенхимальных стволовых клеток, а
величина же Л 6 остаётся равной в процентах относительно контроля.
В группе с препаратом фермента-антиоксиданта Ргх 6 совместно с паракринны-ми факторами МСК, можно наблюдать динамику снижения относительной концентрации в ряду цитокинов Л 6, Л 8, Л10 на 40, 50 и 74% соответственно, по сравнению с контролем.
Исходя из результатов анализа профиля цитокинов, также можно сделать вывод о том, что в группе с препаратом Ргх 6 и паракринны-ми факторами МСК активнее всего проходят процессы клеточной пролиферации и заживления ткани, так как общих уровень цитокинов стимулирующих воспаление в данной группе снижен. Данный вывод также подтверждает уровень относительной концентрации противовоспалительного Л10, который повышен в тканях, где наблюдается активный процесс воспаления и некроз.
Заключение. Исходя из результатов данной работы, можно сделать вывод об эффективности применения Ргх 6 при лечении химического ожога, а так же о положительном влиянии паракринных факторов МСК на скорость регенерации. Визуальная оценка эффективность применения пероксиредоксина 6 и пара-кринных факторов МСК на процесс регенерации кожи при химическом ожоге показала, что
Литература
1. Алексеев А.А., Гаврилюк Б.К., Салахидди-нов К.З., Тюрников Ю.И. Поиск рациональных биотехнологических методов лечения глубоких и обширных ожогов // Хирург. 2013. № 3. С. 60-65.
2. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Рахаев А.М. Лечение пограничных ожогов и донорских ран с применением культивированных аллофибробла-стов // Анн. хир. 2001. № 1. С. 59-65.
3. Волкова А.Г., Шарапов М.Г., Равин В.К., Гордее-ва А.Е., Карадулева Е.А., Мубаракшина Э.К., Тем-нов А.А., Фесенко Е.Е., Новоселов В.И. Эффект различных ферментов-антиоксидантов на регенеративные процессы в эпителии трахеи после химического ожога // Пульмонология. 2014. Т.12, № 2. С. 84-90.
4. Гордеева А.Е., Кочкина А.В., Карадулева Е.В., Новоселов В.И. Распределение экзогенных фер-ментов-антиоксидантов в организме при свободно-радикальных патологиях // Международный
в контрольной группе регенерация кожи происходит дольше, чем в группах с лечением. В группах с применением Ргх 6 наблюдается наилучший эффект, применение паракринных факторов МСК так же благотворно повлияло на регенерацию эпителия по сравнению с контрольной группой.
Исходя из результатов анализа профиля цитокинов, можно сделать вывод о том, что применение фермента-антиоксиданта факторов МСК снижает уровень цитокинов в поврежденной ткани. В группе с применением Ргх 6 и паракринными факторами МСК активнее всего проходят процессы клеточной пролиферации и заживления ткани, так как общих уровень ци-токинов стимулирующих воспаление наиболее низкий в данной группе.
По результатам данной работы можно сделать вывод об эффективности применения пе-роксиредоксина 6 и паракринных факторов МСК при химическом ожоге. Комплекс антиок-сиданта и ростовых факторов обеспечивает наиболее оптимальные условия для заживления ожоговой раны, подавляя окислительный стресс и способствуя сокращению сроков регенерации.
References
Alekseev AA, Gavriljuk BK, Salahiddinov KZ, Tjurni-kov Jul. Poisk racional'nyh biotehnologicheskih me-todov lechenija glubokih I obshirnyh ozhogov. Hirurg. 2013;3:60-5. Russian.
Alekseev AA, Krutikov MG, Rahaev AM. Lechenie pogranichnykh ozhogov i donorskikh ran s primene-niem kul'tivirovannykh allofibroblastov [Treatment of borderline burn wounds and donor with the stump of activated-allofib-roblastov]. Ann. hir. 2001;1:59-65. Russian.
Volkova AG, Sharapov MG, Ravin VK, Gordeeva AE, Karaduleva EA, Mubarakshina JeK, Temnov AA, Fe-senko EE, Novoselov VI. Effekt razlichnykh fermen-tov-antioksidantov na regenerativnye protsessy v epitelii trakhei posle khimicheskogo ozhoga [The effect of different antioxidant enzymes in the regenerative processes in the tracheal epithelium after chemical burn]. Pul'monologija. 2014;12(2):84-90. Russian.
Gordeeva AE, Kochkina AV, Karaduleva EV, Novose-lov VI. Raspredelenie ekzogennykh fermentov-antioksidantov v organizme pri svobodno-radikal'nykh patologiyakh [The distribution of ex-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 1 - P. 65-70
научно-исследовательский журнал. Часть 3. 2015. № 9(40). С. 6-10.
5. Гордеева А.Е., Шарапов М.Г., Новоселов В.И., Фесенко Е.Е., Темнов А.А., Хубутия М.Ш. Влияние пероксиредоксина VI на сохранение тонкой кишки при ишемии/реперфузии // Трансплантология. 2014. Т. 4, № 8. С. 21-27.
6. Кузин М.И., Костюченок Б.М. Раны и раневая инфекция. М.: Медицина, 1990. 592 с.
7. Сравнение эффективности раневых покрытий животного и синтетического происхождения после некрэктомии у пострадавших с глубокими ожогами / Максюта В.А., Скворцов Ю.Р., Чмы-рев И.В. [и др.] // Вестн. Рос. воен.-мед. акад. 2012. № 3. С. 60-63.
8. Хубутия М.Ш., Вагабов В.А., Темнов А.А., Склифас А.Н. Паракринные механизмы противовоспалительного и органопротективного действия при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток // Трансплантология. 2012. № 1-2. С. 2032.
9. Khubutiya M.S., Vagabov A.V., Temnov A.A., Skli-fas A.N. Paracrine mechanisms of proliferative, anti-apoptotic and anti-inflammatory effects of mesenchymal stromal cells in models of acute organ injury // Cytotherapy. 2014ю vol. 16, №5. P. 579-585.
10. Induction of cytokines in human peripheral blood mononuclear cells by mycoplasmas / Kita M., Ohmo-to Y., Hirai Y. [et al.] // Microbiol. Immunol. 1992. Vol. 36. P. 507-516.
11. Kümin A., Huber C., Rülicke T., Wolf E., Werner S. Peroxiredoxin 6 Is a Potent Cytoprotective Enzyme in the Epidermis // The American Journal of Pathology. 2006. Vol. 169, № 4. P. 1194-1205.
12. Rolfs F., Schäfer M., Werner S. Peroxiredoxin 6 in skin carcinogenesis // Oncoscience. 2014. Vol. 1, №6. P. 392-393.
ogenous antioxidant enzymes in the body by free radical pathologies]. Mezhdunarodnyjnauchno-issledovatel'skijzhurnal. Chast' 3. 2015;9(40):6-10. Russian.
Gordeeva AE, Sharapov MG, Novoselov VI, Fesenko EE, Temnov AA, Hubutija MSh. Vlijanie peroksire-doksina VI na sohranenie tonkoj kishki pri ishe-mii/reperfuzii [Influence peroxiredoxin VI to preserve the small intestine ischemia / reperfusion]. Transplantology. 2014;4(8):21-7. Russian. Kuzin MI, Kostjuchenok BM. Rany I ranevaja infekcija [Wounds and wound infection]. Moscow: Medicina; 1990. Russian.
Maksjuta VA, Skvorcov JuR, Chmyrev IV, et al. Srav-nenie effektivnosti ranevyh pokrytij zhivotnogo I sinteticheskogo proishozhdenija posle nekrjektomii u postradavshih s glubokimi ozhogami [Comparison of the effectiveness of wound dressings animal and synthetic origin in after necrectomy in patients with deep burns]. Vestn. Ros.voen.-med. akad. 2012;3:60-3. Russian.
Khubutiya MSh, Vagabov VA, Temnov AA, Sklifas AN. Parakrinnye mehanizmy protivovospalitel'nogo i or-ganoprotektivnogo dejstvija pri transplantacii me-zenhimal'nyh stvolovyh kletok [Paracrine mechanisms of anti-inflammatory and organoprotective steps in the transplantation of mesenchymal stem cells]. Transplantology. 2012;1-2:20-32. Russian. Khubutiya MS, Vagabov AV, Temnov AA, Sklifas AN. Paracrine mechanisms of proliferative, anti-apoptotic and anti-inflammatory effects of mesenchymal stromal cells in models of acute organ injury. Cyto-therapy. 2014;16(5):579-85.
Kita M, Ohmoto Y, Hirai Y, et al. Induction of cyto-kines in human peripheral blood mononuclear cells by mycoplasmas. Microbiol. Immunol. 1992;36:507-16.
Kümin A, Huber C, Rülicke T, Wolf E, Werner S. Pe-roxiredoxin 6 Is a Potent Cytoprotective Enzyme in the Epidermis. The American Journal of Pathology. 2006;169(4):1194-205.
Rolfs F., Schäfer M., Werner S. Peroxiredoxin 6 in skin carcinogenesis. Oncoscience. 2014;1(6):392-3.
