Влияние парентерального применения эритропоэ-тина на функциональную активность нейтрофи-лов периферической крови при экспериментальной термической травме Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616-001.17

ВЛИЯНИЕ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ЭРИТРОПОЭ-ТИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИ-ЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ

М.В. Осиков, Е.В. Симонян, О. Т. Саедгалина, А.И. Алимов

ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Челябинск, Россия

Аннотация. Количество пострадавших при Термической травме (ТТ) не имеет тенденции к снижению. Сложность и многообразие патогенетических процессов, лежащих в ее основе, могут привести к различным осложнениям, в том числе инфекционным. Одним из ключевых звеньев патогенеза ТТ является изменение количественного состава и функциональной активности нейтрофилов, которые представляют первую линию защиты от микробных и немикробных агентов при ТТ. Интерес в терапии ТТ представляют эндогенные биологически активные вещества, например эритропоэтина (ЭПО), иммунотропные эффекты которого были доказаны в клинических и в экспериментальных условиях при различной патологии. Цель работы: исследовать влияние ЭПО на функциональную активность нейтрофилов в динамике экспериментальной ТТ. Эксперимент выполнен на 50 белых нелинейных половозрелых крысах массой 250±20 г. Моделировали ТТ ША степени и площадью 4% путем погружения участка межлопаточной области крысы в очищенную воду 98-99оС на 12 с. ЭПО вводили животным в дозе 500 МЕ/кг ежедневно. Исследования проводили на 5 и 14 сутки ТТ. Количество нейтрофилов определяли с помощью гематологического анализатора «Мейотс - М 16» (Швеция). Поглотительную способность нейтрофилов периферической крови исследовали с использованием частиц монодисперсного полистерольного латекса, кисло-родзависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови - с помощью НСТ-теста. При ТТ на 5 и 14 сутки эксперимента в периферической крови увеличивается количество нейтрофилов и активируется их поглотительная и НСТ-редуцирующая способности. Применение ЭПО при ТТ приводит к увеличению в крови количества палочкоядерных нейтрофилов на 5 и 14 сутки эксперимента и снижению активности и интенсивности фагоцитоза. Активность и интенсивность кислородзависимого метаболизма нейтрофилов при ТТ в условиях применения ЭПО статистически значимо не изменяется на 5 сутки и снижается на 14 сутки эксперимента.

Ключевые слова: термическая травма, эритропоэтин, НСТ, нейтрофилы, врожденный иммунитет

Среди ожоговых повреждений 95% занимает термическая травма (ТТ) горячей водой или пламенем. Количество пострадавших не имеет тенденции к снижению [1]. При выборе подходов к лечению ТТ необходимо учитывать, что сложность и многообразие патогенетических процессов, лежащих в ее основе, могут привести к разнообразным осложнениям (вторичный иммунодефицит, сепсис, септический шок, полиорганная недостаточность, образование патологических рубцов, нарушение двигательных функций). Одним из ключевых звеньев патогенеза ТТ

является изменение количественного состава и функциональной активности иммунных клеток в крови и в очаге повреждения, например, нейтро-филов, которые представляют первую линию защиты от микробных и немикробных агентов при ТТ [2]. Таким образом, интерес в терапии ТТ представляют вещества, обладающие иммуно-тропным действием. Ранее нами продемонстрированы плейотропные, в том числе иммунотроп-ные, эффекты эритропоэтина (ЭПО) в клинических и в экспериментальных условиях при различной патологии [3].

—--—

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

Цель работы. Исследовать влияние парентерального применения эритропоэтина на функциональную активность нейтрофилов в периферической крови в динамике экспериментальной ТТ.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 50 белых нелинейных половозрелых крысах массой 250±20 г. при строгом соблюдении требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных. Все животные случайным образом разделены на 3 группы: 1 - интакт-ные (n=10), 2 - животные с ТТ и асептической повязкой (n=20), 3 - животные с ТТ, которым внутрибрюшинно вводили ЭПО (n=20). ТТ IIIA степени и площадью 4% моделировали путем погружения участка межлопаточной области крысы в очищенную воду 98-99оС на 12 с. Глубину и площадь ожога оценивали морфологическими методами. ЭПО вводили животным в составе препарата Эритропоэтин (МНН Эпоэтин бета, ЗАО «Биннофарм», Россия) в дозе 500 МЕ/кг ежедневно. Исследования проводили на 5 и 14 сутки ТТ. Количество нейтрофилов в периферической крови определяли с помощью гематологического анализатора «Medonic - M 16» (Швеция). Нейтрофилы из периферической крови выделяли с помощью двойного градиента плотности фиколла-верографина 1,077 и 1,092 г/мл. Поглотительную способность нейтрофилов периферической крови исследовали с использованием частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса, учитывая активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число [4]. Кислородзависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови исследовали, учитывая интенсивность восстановления НСТ в его нерастворимую форму - диформозан, оценивали активность и интенсивность спонтанного и индуцированного НСТ-теста. Результаты обрабатывали с использованием программы «Statistica 10.0 for Windows». Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Манна - Уитни, Вальда - Вольфо-витца.

Результаты исследования и их обсуждения. Результаты представлены в таблице 1. Установлено, что при ТТ на 5 и 14 сутки эксперимента наблюдается нейтрофильный лейкоцитоз. Функциональная активность нейтрофилов периферической крови при ТТ повышается за счет

увеличения количества сегментоядерных нейтрофилов в крови. На 5 и 14 сутки эксперимента увеличивается количество активно фагоцитирующих клеток, поглотительная способность одного фагоцита и интенсивность захвата объектов фагоцитоза. Прогностическое значение имеет изменение кислородзависимого метаболизма по показателям НСТ-теста. В эксперименте другими исследователями показано, что выживаемость животных выше, если НСТ-тест повышается, а затем снижается [5]. При ТТ показатели НСТ-теста увеличиваются на 5 и 14 сутки эксперимента как в спонтанных, так и в индуцированных условиях. Увеличение показателей НСТ-теста может приводить к неблагоприятным последствиям. Избыточное присутствие нейтро-филов и выработка ими активных форм кислорода, участвующих в процессах перекисного окисления липидов, может негативно повлиять на закрытие раны, за счет расширения зоны вторичной альтерации [6].

Применение ЭПО при ТТ приводит к увеличению количества палочкоядерных нейтрофилов на 5 и 14 сутки эксперимента и увеличению общего количества нейтрофилов в периферической крови на 14 сутки. Активность и интенсивность фагоцитоза при ТТ в условиях применения ЭПО на 5 и 14 сутки снижается до значений интактных животных. Активность и интенсивность в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте статистически значимо не изменяется на 5 сутки эксперимента и снижается на 14 сутки ТТ. Увеличение количества нейтрофилов в крови в условиях применения ЭПО может быть обусловлена стимуляцией миелоидного ростка костного мозга, о чем свидетельствует значительное увеличение молодых форм нейтрофилов, а также известный факт о стимуляции ЭПО эритропоэза и мегакариоци-топоэза [7]. Полагаем, что эффекты ЭПО на функциональную активность нейтрофилов обусловлены как прямым вмешательством в метаболизм через взаимодействие со специфическими рецепторами на клеточной поверхности, так и опосредованными установленными ранее эффектами ЭПО - дезинтоксикационным и антиокси-дантным - и, как следствие, восстановлением функции клеток в крови [8 ].

Таблица 1

Влияние эритропоэтина на количественный состав и функциональную активность нейтрофи-лов в периферической крови при экспериментальной термической травме (M±m).

Показатели Группа 1 -интактные (n=10) 5 сутки эксперимента 14 сутки эксперимента

Группа 2 - ТТ+АП (n=10) Группа 3 -ТТ+ЭПО (n=10) Группа 2 -ТТ+АП (n=10) Группа 3 -ТТ+ЭПО (n=10)

Нейтрофилы п/ядерные, • 109/л 0,037±0,008 0,057±0,017 0,17±0,03 # 0,068±0,018 0,17±0,04 &

Нейтрофилы с/ядерные, • 109/л 1,44±0,26 3,75±0,33 * 3,29±0,39 2,62±0,21 *# 2,69±0,13 $

Нейтрофилы всего, • 109/л 1,5±0,27 3,81±0,34 * 3,46±0,37 2,69±0,21 *# 2,86±0,15 &$

Активность фагоцитоза, % 39,11±1,79 59,40±4,36 * 37,8±1,92 # 67,78±1,65 * 33,50±0,82 &

Интенсивность фагоцитоза, уе. 0,88±0,06 3,04±0,47 * 1,04±0,12 # 2,14±0,32 *# 1,13±0,05 &

Фагоцитарное число, у.е. 2,20±0,10 4,35±0,25 * 2,70±0,16 # 2,87±0,39 *# 3,59±0,18 & $

НСТ-тест спонт., активность, % 3,40±0,37 15,50±2,53 * 18,0±1,37 18,57±4,04 * 4,20±0,95 &

НСТ-тест спонт., инт-ть, уе. 0,041±0,005 0,228±0,037 * 1,04±0,12 0,21±0,05 * 0,04±0,01 &

НСТ-тест инд., активность, % 5,5±1,05 19,11±2,52 * 15,5±3,09 19,33±1,20 * # 5,60±0,37 & $

НСТ-тест инд., интенс-ть, уе. 0,064±0,013 0,24±0,03 * 0,21±0,05 0,21±0,014 * 0,064±0,008 & $

Примечание. * - значимые (р<0,05) различия с группой интактных животных, #-с группой ТТ 5 сутки, &-с группой ТТ14 сутки, $-с группой ТТ+ЭПО 5 сутки, по критериям Манна - Уитни, Вальда - Вольфовитца.

Выводы. При ТТ на 5 и 14 сутки эксперимента наблюдается увеличение количества нейтрофилов и их функциональной активности: активно фагоцитирующих клеток, поглотительной способности одного фагоцита, интенсивности захвата объектов фагоцитоза и кислородза-висимого метаболизма.

Применение ЭПО в суммарной дозе 2500 МЕ/кг и 7000 МЕ/кг при ТТ способствует увеличению количества в крови палочкоядерных нейтрофилов на 5 и 14 сутки эксперимента соответственно и снижению активности и интенсивности фагоцитоза. Активность и интенсивность кислородзависимого метаболизма нейтрофилов

при ТТ в условиях применения ЭПО статистически значимо не изменяется на 5 сутки и снижается на 14 сутки эксперимента.

ЛИТЕРАТУРА

1. Федеральная служба государственной статистики Демографический ежегодник России - 2015 г., http://www.gks.ru/bgd/regl/B15_16/Main.htm (Дата обращения 10.08.16) .

2. Popescu F.C. et al. Macrophage response in experimental third-degree skin burns treated with allograft. Histological and immunohistochemical stady // Rom J Morfol Embriol. -2012. - vol. 53, № 4. - pp. 1027-1036

3. Осиков, М.В. Роль эритропоэтина в реализации тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А.

—--—

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

Григорьев, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 10-2. - С. 285-289.

4. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и го-меостаз // Екатеринбург. - 2001.

5. Wang Y. The prognostic implication of determination of activation of leucocyte in severe burns / Y. Wang, K. Zhao, X. Wu // Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi. -1994. - Vol. 10(4). - P. 286-289.

6. Mogo^anu G.D. et al. Natural products locally modulators of the cellular response: therapeutic perspectives in skin burns // Rom J Morphol Embryol. 2012. Vol. 53. № 2. pp. 249262

7. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов и др. // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 6.; URL: http://www.science-education.ru/ra/article/view?id=7450 (дата обращения: 26.03.2016).

8. Осиков М.В., Ахматов В.Ю., Телешева Л.Ф., Федосов А.А., Агеев Ю.И., Суровяткина Л.Г. Плейотропные эффекты эритропоэтина при хронической почечной недостаточности // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 7-1. - С. 218-224; URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=31817 (дата обращения: 24.10.2016).

THE INFLUENCE OF PARENTERAL ADMINISTRATION OF ERYTHROPOIETIN ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF NEUTROPHILS OF THE PERIPHERAL BLOOD IN EXPERIMENTAL THERMAL INJURY

M.V. Osikov, E.V. Simonyan, O.T. Saedgalina, A.I. Alimov

South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russia

Annotation. The number of victims with thermal injury (TI) has not tendency to decrease. The complexity and diversity of pathogenic processes can lead to various complications, including infectious. One of the key links in the pathogenesis of TI is the modification in the quantitative composition and functional activity of neutrophils, which represent the first line of protection against microbial and other agents in TI. Interest in the treatment of TI represent endogenous biologically active substances such as erythropoietin (EPO), the immunotropic effects of its was proven in clinical and experimental conditions with different pathologies. Objective:the effect of EPO on the functional activity of neutrophils investigate in the dynamics of experimental TI. The experiment was performed on the 50 white nonlinear mature rats weighing 250±20 g. Simulation TI and IIIA degree with an area of 4%was to do by immersing of the interscapular region of the rats into purified water 98-99 degree celsius on the 12 s. EPO was administered to animals at a dose of 500 IU/kg daily. The study was performed at 5 and 14 days of TI. The number of neutrophils was determined was using the hematological analyzer "Medonic - M 16" (Sweden). The absorption capacity of neutrophils of peripheral blood was examined using particles of monodisperse polistirol latex, oxygen-dependent metabolism of neutrophils peripheral blood was examined using the NBT-test. At TI the number of neutrophils in the peripheral blood increases and their the phagocytic and NBT-reducing abilities activated at 5 and 14 day of the experiment. The use of EPO at TI leads to increase in blood the number of neutrophils on the 5th and 14th days of the experiment and to reduce the activity and intensity of phagocytosis. The activity and intensity of oxygen-dependend metabolism of neutrophils at the TI using of EPO statistically significant is not changed on the 5 th day and decreases on the 14th day of the experiment. Keywords: thermal injury, erythropoietin, NBT-test, neutrophils, innate immunity

REFERENCES

1. Federal'naja sluzhba gosudarstvennoj statistiki Demo-graficheskij ezhegodnik Rossii - 2015 g., http://www.gks.ru/bgd/regl/B15_16/Main.htm (Data obrash-henija 10.08.16)

2. Popescu F.C. et al. Macrophage response in experimental third-degree skin burns treated with allograft. Histological and immunohistochemical stady // Rom J Morfol Embriol. 2012. vol. 53. № 4. pp. 1027-1036

3. Osikov, M.V. The role of erythropoietin in the implementation of platelet-cell interactions in the blood in chronic renal failure / M.V. Osikov, T.A. Grigor'ev, A.A. Fedosov // Fun-damental'nye issledovanija. - 2012. - № 10-2. - S. 285-289.

4. Dolgushin I.I. , Buharin O.V. Neutrophils and homeostasis // Ekaterinburg. - 2001

5. Wang Y. The prognostic implication of determination of activation of leucocyte in severe burns / Y. Wang, K. Zhao,

X. Wu // Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi. -1994. - Vol. 10(4). - P. 286-289.

6. Mogo^anu G.D. et al. Natural products locally modulators of the cellular response: therapeutic perspectives in skin burns // Rom J Morphol Embryol. 2012. Vol. 53. № 2. pp. 249262

7. Osikov, M.V. Effect of erythropoietin on functional activity of platelets / M.V. Osikov, T.A. Grigor'ev, A.A. Fedosov i dr. // Sovremennye problemy nauki i obrazovanija. - 2012.

- № 6.; URL: http://www.science-education.ru/ru/arti-cle/view?id=7450 (data obrashhenija: 26.03.2016).

8. Osikov M.V., Ahmatov V.J., Telesheva L.F., Fedosov A.A., Ageev J.I., Surovjatkina L.G. Pleiotropic effects of eryth-ropoietin in chronic renal failurePleiotropic effects of erythro-poietin in chronic renal failure // Fundamental'nye issledovanija.

- 2013. - № 7-1. - S. 218-224; URL: http://fundamental-re-search.ru/ru/article/view?id=31817 (data obrashhenija: 24.10.2016).