CC BY
26
УДК 66.063.62
Ульянова Ю.В., Ермоленко Ю.В., Карманова Р.А., Гридина Н.Н., Максименко О.О., Гельперина
C.Э.
ВЛИЯНИЕ ПАРАМЕТРОВ МИКРОФЛЮИДНОГО ПРОЦЕССА НА ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОСФЕР НА ОСНОВЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО СОПОЛИМЕРА МОЛОЧНОЙ И ГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТ
Ульянова Юлия Вячеславовна, аспирантка, ведущий инженер кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов; e-mail: julian5594@mail.ru;
Ермоленко Юлия Валерьевна, к.х.н., доцент кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов; Максименко Ольга Олеговна, к.х.н., зам. начальника лаборатории систем доставки лекарственных средств; Гельперина Светлана Эммануиловна, д.х.н., начальник лаборатории систем доставки лекарственных средств; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Москва, Россия; 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
Карманова Рита Александровна, м.н.с. лаборатории систем направленного транспорта; ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия; 119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр. 2.
Гридина Наталья Николаевна, к.т.н., доцент кафедры химии и технологии полимерных материалов и нанокомпозитов;
ФГБОУ ВО «Российский государственный университет им. А.Н. Косыгина», Москва, Россия; 119071, г. Москва, ул. Малая Калужская д.1.
Установлена зависимость размеров микросфер на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA) от соотношения скоростей потоков фаз, концентрации PLGA в органической фазе, вида и концентрации ПАВ в водной фазе. Увеличение концентрации PLGA в органической фазе и увеличение соотношения скоростей потоков ^о^в) позволяет получить микросферы размером от 20 до 65 мкм с коэффициентом вариации от 6% до 9%, соответственно.
Ключевые слова: микросферы; сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA); микрофлюидика; межфазное натяжение.
EFFECTS OF PROCESS PARAMETERS ON CHARACTERISTICS OF PLGA MICROSPHERES FORMED BY THE MICROFLUIDIC METHOD
Ulianova Y.V., Ermolenko Y.V, Karmanova R.A. *, Gridina N.N. **, Maksimenko O.O., Gelperina S.E.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia * I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia
** AN Kosygin Moscow State University of Design and Technology, Moscow, Russia
It was established, the sizes of PLGA microspheres depends on the flow rates ratio, PLGA concentration in the organic phase, type and concentration of surfactants in the aqueous phase. Increasing PLGA concentration in the organic phase and flow rates ratio (Qo/Qa) allows to obtain microspheres in the size range of 20-65 microns with a narrow size distribution (coefficient of variation from 6% to 9%). The reported study was funded by RFBR, project №19-015-00155.
Keywords: microspheres; poly-(lactic-co-glycolic acid) (PLGA); microfluidics; interfacial tension.
Введение
Инъекционные депо-формы на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот (РЬОА) позволяют обеспечить пролонгированное действие лекарственных средств и снизить их токсичность. Одним из ключевых параметров, определяющих скорость высвобождения активного ингредиента из микросфер, является их размер и полидисперсность [1]. Традиционные методы, основанные на эмульгировании, приводят к получению микросфер в широком диапазоне размеров. Напротив, микрофлюидные технологии позволяют точно контролировать поток жидкости в микромасштабе, преодолевая эти ограничения. Формирование капель в микрофлюидных устройствах зависит от геометрии каналов, реологических свойств эмульгируемых жидкостей и характеристик течения
фаз [2]. Целью нашей работы было установить зависимость размеров микросфер на основе PLGA от параметров микрофлюидного процесса. Особый интерес представляла возможность сравнения влияния различных по природе ПАВ на межфазное натяжение и процесс формирования капель.
Экспериментальная часть
Получение микросфер на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA). В работе применяли микрофлюидную установку
производства Dolomite Microfluidics
(Великобритания). В качестве органической фазы (ОФ) использовали раствор PLGA (Resomer® 756S, D,L-lactide/glycolide = 75:25; Mw 76 - 115 кДа, n = 0.91 дл/г, Evonik Röhm GmbH, Германия) в этилацетате с концентрацией 0,5, 1, 2 и 3%; в
качестве водной фазы (ВФ) - раствор поливинилового спирта (ПВС, 9-10 кДа, степень гидролиза 80%, Sigma-Aldrich, Германия) с концентрацией 0,5, 1, 2 и 3%. Полученные растворы фильтровали через мембранный фильтр из политетрафторэтилена с размером пор 0.45 мкм. Формирование микросфер проводили в режиме фокусировки потока в кварцевом чипе с шириной канала 100 мкм. Скорость потока ОФ (Оо) поддерживали постоянной 2.5 мкл/мин, тогда как скорость потока ВФ (Ов) изменяли в диапазоне от 30 до 140 мкл/мин. Микросферы собирали в приемник с 1% раствором ПВС при комнатной температуре и постоянном перемешивании при 370 об/мин в течение 60 минут, после чего суспензию микросфер оставляли перемешиваться при 400 об/мин в течение 12 ч. Сформированные микросферы промывали дистиллированной водой 3x25 мл. После этого суспензию замораживали (-80оС) и высушивали лиофильно. В качестве стабилизатора использовали помимо ПВС также фармацевтические ПАВ: Kolliphor® P188 (BASF, Германия), додецилсульфат натрия (SDS, Sigma-Aldrich, Германия), Твин 80 (Sigma-Aldrich, Германия).
Определение физико-химических параметров микросфер. Размер определяли с помощью оптического микроскопа High Speed Digital Microscope (Dolomite, Великобритания),
морфологию - с помощью сканирующего электронного (растрового) микроскопа JSM-6510LV (JEOL, Япония). Анализ полученных данных проводили в программе ImageJ и MicrosoftExcel 2010. Статистические данные (средний диаметр микросфер, стандартное отклонение, коэффициент вариации) получали при обработке не менее 200 микросфер.
Измерение межфазного натяжения.
Определение межфазного натяжения в системе, состоящей из 1% раствора PLGA в этилацетате и 2% раствора ПАВ, проводили методом висящей капли на приборе для измерения контактного угла
70
M »
а
й-зо
:о
ю
i
EasyDrap DSA20E (KRUSS GmbH, Германия) с системой автодозирования при температуре 20°С. Программное обеспечение DSA1. Исследования выполнены на оборудовании Центра коллективного пользования РХТУ им. Д.И. Менделеева
Результаты и их обсуждение
В данной работе мы исследовали влияние таких параметров, как соотношение скоростей потоков ОФ и ВФ ^о^в), концентрация PLGA в ОФ, а также вид и концентрация ПАВ в ВФ на процесс формирования капель в микроканале и на конечный размер микросфер.
Образование капель в микрофлюидном чипе происходило в режиме фокусировки потока: ОФ, состоящую из растворов PLGA различной концентрации в этилацетате, подавали во внутренний канал, тогда как ВФ, состоящая из 2% водного раствора ПВС, поступала с двух сторон во внешние каналы, тем самым обеспечивая отрыв капли в месте пересечения двух фаз. Скорость потока ОФ поддерживали постоянной 2.5 мкл/мин на протяжении всех экспериментов. Для изучения влияния отношения скоростей потоков и концентрации PLGA в ОФ на диаметр микросфер скорость потока ВФ варьировали от 30 мкл/мин до 140 мкл/мин. В результате проведенных экспериментов установлено, что с уменьшением 0о/0в, то есть с увеличением расхода ВФ, размер микросфер уменьшался (рис.1, А).
Следует отметить, что при большом значении Qо/Qв, равным 0,082, коэффициент вариации составлял порядка 10%. Это связано с тем, что диаметр капли в данном случае соизмерим с шириной канала, поэтому существенное влияние на гидродинамику капли оказывает пристеночный эффект [3]. Для низких значений Qо/Qв коэффициент вариации во всех образцах не превышал 6%, что указывает на узкое распределение по размерам (рис. 2).
О,os: Q.ÛiS 0.04Й 0,0,19 O.OJi 0,0.10 0,024 0.018 Qo.'Qn
■ 0,3%PLCjA 1% PLGA ■ ïïiPLGA 1% PLGA
1,0% 2,0K 3,0%
Конигнтрврии 1ШС.5Ч01Яа P138
Рис. 1. Зависимость среднего диаметра микросфер от отношения скоростей потоков ^о^в) и концентрации РЬСЛ в дисперсной фазе (А); зависимость среднего диаметра микросфер от концентрации ПАВ в ВФ (Б)
Рис. 2. Микрофотографии микросфер, полученные с помощью оптической микроскопии (А) и СЭМ (Б)
Известно, что на диаметр микрочастиц влияет концентрация полимера в дисперсной фазе [4]. Нами было проведено исследование зависимости размера микросфер от концентрации РЬОЛ в ОФ. Из рис. 1 видно, что с увеличением концентрации РЬОЛ средний диаметр микросфер увеличивался. Таким образом, например, при соотношении скоростей потоков 0,035 при изменении содержания РЬОЛ от 0,5 до 3% можно получить микросферы с диаметром от 26±2 мкм до 43±2 мкм и коэффициентом вариации 6%.
Еще одним параметром, влияющим на процесс формирования капель, является состав непрерывной ВФ [5]. В качестве стабилизаторов эмульсии мы использовали четыре ПАВ различной природы: ПВС, КоШрЬог® Р188, БОБ и Твин 80. Формирование капель проводили при скорости потока ОФ 2,5 мкл/мин, скорости потока ВФ 83 мкл/мин. Однако, при использовании БОБ и Твин 80 отрыва капли в пределах выходного канала чипа не наблюдали, по сравнению с ПВС и КоШрЬог® Р188. Это может быть связано с тем, что на формирование капли, помимо исследуемых в этой работе параметров, влияет межфазное натяжение на границе раздела фаз: чем меньше его величина, тем раньше происходит отрыв капли. Значения измеренного межфазного натяжения на границе 1% раствора РЬОЛ в этилацетате и 2% водного раствора используемых ПАВ представлены в таблице 1.
Таблица 1. Межфазное натяжение (а, мН/м) в гетерофазной системе жидкость-жидкость, состоящей из
ПАВ о, мН/м
Твин 80 2,71
SDS 2,46
Kolliphor® P188 2,24
ПВС 1,26
Интересно отметить, что значения межфазного натяжения для ПВС и КоШрЬог® Р188 оказались ниже, чем для других ПАВ, что, по-видимому, позволяет формировать капли в пределах выходного канала чипа. Исследованная нами зависимость размера микросфер от концентрации ПВС и
Kolliphor® P188. показала, что при увеличении концентрации ПАВ от 0.5 до 3% диаметр микросфер изменяется незначительно (рис. 1, Б).
Выводы
Таким образом, в результате исследования установлено, что на размер микросфер на основе высокомолекулярного PLGA существенное влияние оказывают следующие параметры: соотношение скоростей потоков водной и органической фаз и концентрация PLGA в органической фазе, тогда как концентрация ПВС и Kolliphor® P188 в водной фазе незначительно влияет на размер микросфер. Увеличение концентрации PLGA в органической фазе и увеличение соотношения скоростей потоков ^о^в) позволяет получить микросферы размером от 20 до 65 мкм с коэффициентом вариации 6% и 9%, соответственно. Полученные результаты могут быть использованы при разработке депо-форм лекарственных веществ на основе микросфер из PLGA с помощью микрофлюидной технологии.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №19015-00155.
Список литературы
1. Amoyav B., Benny O. Controlled and tunable polymer particles' production using a single microfluidic device // Appl. Nanosci. - 2018. -Vol. 8. № 4. - P. 905-914.
2. Wang J. et al. Droplet microfluidics for the production of microparticles and nanoparticles // Micromachines. - 2017. - Vol. 8. № 1. - P. 1-23.
3. Zhu P., Wang L. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review // Lab Chip. - 2017. - Vol. 17. - P. 34-75.
4. Hung L.H. et al. PLGA micro/nanosphere synthesis by droplet microfluidic solvent evaporation and extraction approaches // Lab Chip. - 2010. - Vol. 10. № 14. - P. 1820-1825.
5. Kovalchuk N.M. et al. Effect of surfactant on emulsification in microchannels // Chem. Eng. Sci. - 2018. - Vol. 176. - P. 139-152.
