CC BY
45
Физиология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2010, № 2 (2), с. 631-6135
УДК 591.481.1:612.014.464(021)
ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА И СОХРАНЕНИЕ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ У КРЫС
© 2010 г. О.С. Евдокимова 1, А.А. Миронов 2, Н.В. Жемарина 1
1 Нижегородская государственная медицинская академия
2 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
evdokimova_o s @таЛ. т
Поступила в редакцию 08.04.2010
Выявлен дозозависимый эффект воздействия озонированного физиологического раствора на морфофункциональное состояние головного мозга крыс при внутрибрюшинном введении. Низкие концентрации озона влияют на сохранение и воспроизведение долговременной памяти. Введение высоких концентраций озона оказывало угнетающее действие на показатели ориетировочно-исследовательской и двигательной активности крыс и выявило нарушение ответных реакций животных на новизну обстановки.
Ключсвыс слева: озон, «открытое поле», водный лабиринт Морриса, неокортекс.
Центральная регуляция функций различных органов и систем организма является актуальной проблемой современной нейробиологии. В этом процессе исключительная роль отводится функциональному состоянию головного мозга как высшего интегративного органа управления. В литературе имеются данные о применении озона у больных с нарушением церебрального кровообращения, с мигренью, с заболеваниями периферической нервной системы, но отсутствуют данные об исследовании нейро-тропного действия озона в условиях физиологической нормы [1—3]. Биологическая активность озона, а отсюда и основные принципы его применения в медицине, - результат изменения свободнорадикального статуса организма в ответ на внешний источник активной формы кислорода [4]. Известно, что низкие концентрации озона не проявляют токсического действия, т.к. свободные радикалы нейтрализуются антиокси-дантной системой защиты организма, тогда как высокие концентрации вызывают чрезмерное насыщение свободными радикалами - окислительный стресс, приводящий к токсическому эффекту [4]. При дисбалансе между интенсивностью образования активных форм кислорода и активностью антиоксидантной системы защиты возникает опасность проявления токсического действия свободных радикалов на функциональную активность мозга. Целью данной работы явилось изучение влияния озонированного физиологического раствора на динамику поведения и структуру головного мозга крыс после воздействия.
Материал и методы исследования
Эксперименты проведены на белых нелинейных крысах-самцах массой 250-300 г, содержащихся на стандартном рационе вивария. Введение озонированного физиологического раствора (ОФР) осуществляли внутрибрюшин-но в течение 12 суток через сутки в количестве 1 мл. Концентрация озона в физиологическом растворе составляла 0.7, 1.7 и 2.5 мкг/мл. В контрольной серии вводили эквивалентный объем физиологического раствора.
Для оценки поведения животных использовали установку «открытое поле», где регистрировали следующие показатели поведенческой активности крыс: горизонтальная (ГДА) и вертикальная двигательная активность (ВДА), время замирания, груминга, принюхивания животных, уровень тревожности [5]. Для исследования памяти животных использовали водный лабиринт Морриса [6].
Для световой микроскопии образцы ткани мозга фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Срезы толщиной 7 мкм изготавливали на микротоме Leica SM 2000R и окрашивали гематоксилином и эозином (обзорная окраска) и по Нисслю для выявления специфичного для нейронов нуклеопротеидного комплекса (тигрои-да), содержащегося в цитоплазме, а также других комплексов РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра) [7]. Гистологические срезы оценивали полуколичественным методом.
50
1сут 14сут ЗОсут бОсут
период наблюдения
| I контроль | ' конц. озона 0,7мкг/л киими конц. озона 1,7икг/мл
■ ■ кпнц пяпна ?5мкг/ип — — исх
Рис. 1. Влияние озонированного физиологического раствора с различными концентрациями озона на изменение горизонтальной двигательной активности крыс; * - достоверное отличие от исходного показателя, р < 0.05; # - достоверное отличие от контрольной серии, р < 0.05
Результаты исследования обработаны при помощи программ Microsoft Excel и Statistics 6.0. Для выявления различий в уровне исследуемого признака использовали F-критерий, критерий Уилкоксона, Манна - Уитни и Ньюмена - Кейлса. Различия считали достоверными при уровне значимостир < 0.05.
Результаты
Оценивая влияние ОФР на изменение горизонтальной двигательной активности крыс, установили достоверное снижение ГДА в группе с введением ОФР в концентрации 2.5 мкг/мл в первые и четырнадцатые сутки по сравнению с показателями в контрольных группах (рис. 1).
Таким образом, после введения ОФР максимальной концентрации наблюдается снижение двигательной активности у животных, что отражает пассивно-оборонительную тактику поведения крыс в ответ на стресс.
К первым суткам после введения ОФР наблюдается снижение ВДА во всех группах исследуемых животных. Спустя 14 суток после введения ОФР уровень ориентировочноисследовательской активности, по сравнению с контролем, достоверно ниже в группе с введением озона высокой концентрации. На 30-е сутки число вертикальных стоек у группы с минимальной концентрацией озона в ОФР резко снижается, а с высокой концентрацией озона восстанавливается. К концу эксперимента показатели опытных групп, особенно со средней
концентрацией озона, превышают значения контрольной серии (рис. 2).
На протяжении всего эксперимента время замирания у животных с введением ОФР минимальной и средней концентраций достоверно не отличалось от данного показателя в контрольной серии, значительно превышая исходное значение, что коррелирует с изменениями общей двигательной активности. В группе с введением ОФР максимальной концентрации наблюдается достоверное увеличение времени замирания в 1-е и 14-е сутки после введения по сравнению с контролем, что подтверждается гистологическими данными (рис. 3).
На первые и четырнадцатые сутки после введения ОФР с высокой концентрацией озона снижается количество реакций принюхивания у крыс, что коррелирует с изменениями общей двигательной активности и временем замирания животных (рис. 4).
Таким образом, при сравнении поведения животных после введения ОФР наблюдается тенденция к стимулирующему действию ОФР со средней концентрацией озона на нервные процессы и к подавляющему действию при применении высокой концентрации озона в физиологическом растворе. В отдаленном периоде наблюдается восстановление поведенческих процессов, особенно быстро они проходят у групп крыс с концентрацией озона в ОФР 1.7 и 0.7 мкг/мл. Резкое снижение поведенческих показателей на первые сутки после введения ОФР объясняется повторным тести-
Рис. 2. Влияние озонированного физиологического раствора с различными концентрациями озона на изменение вертикальной двигательной активности крыс; * - достоверное отличие от исходного показателя, р < 0.05; # - достоверное отличие от контрольной серии,р < 0.05
Рис. 3. Влияние озонированного физиологического раствора с различными концентрациями озонана изменение времени замирания животных; * - достоверное отличие от исходного показателя, р < 0.05; # - достоверное отличие от контрольной серии,р < 0.05
рованием в «открытом поле» в течение суток после исходного.
Для изучения влияния ОФР на сохранение научения у крыс использовали водный лабиринт Морриса. В начале эксперимента животных обучали решению вероятностной задачи при консолидации долговременной памяти при постоянном положении цели в водном лабирин-
те. После окончания обучения животным внут-рибрюшинно вводили ОФР. Сохранение долговременной памяти у животных оценивали с помощью отсроченного коэффициента сохранения (оКс). оКс - доля времени пребывания крысы в квадранте, где находилась платформа, по отношению в общему времени пребывания крысы в водном лабиринте Морриса.
Рис. 4. Влияние озонированного физиологического раствора с различными концентрациями озона на количество реакций принюхивания животных; * - достоверное отличие от исходного показателя, р < 0.05; # - достоверное отличие от контрольной серии,р < 0.05
Таблица
Значения отсроченного коэффициента сохранения долговременной памяти
Период исследования/ подруппы животных 1-е сутки 14-е сутки 30-е сутки
Интактные 29.3±1.5 27.0±1.7 24.3±1.2
Контроль 24.3±1.0* 23.3±0.9* 22.3±1.3*
Введение ОФР с конц. озона 0.7 мкг/мл 22.7±2.2* 22.0±2.4* 14.8±2.0*#
Введене ОФР с конц. озона 1.7 мкг/мл 23.7±1.7* 26.5±2.1 24.6±1.5
Введение ОФР с конц. озона 2.5 мкг/мл 20.2±0.8*# 18.4±1.6*# 17.6±2.1 *#
* - достоверное отличие от исходного показателя,р < 0.05;
# - достоверное отличие от контрольной серии,р < 0.05.
В результате исследования были получены низкие показатели оКс и одновременно фактически полное сохранение стратегии поиска цели по сравнению с интактными животными у групп с введением ОФР с концентрацией озона 2.5 мкг/мл (табл.). То есть влияния на структуры мозга, отвечающие за сохранение и воспроизведение долговременной памяти, ОФР с концентрацией 2.5 мкг/мл не оказал. Но при этом явно выражены нарушения ответных реакций на новизну обстановки, вследствие которых животные, не найдя платформы, переходят на хаотический поиск без учета прошлого опыта.
Самое большое влияние на сохранение и воспроизведение долговременной памяти и, как следствие, на сформированную стратегию по-
иска цели в водном лабиринте оказал ОФР с концентрацией озона 0.7 мкг/мл. В отсроченных тестах на сохранение долговременной памяти животные данных подгрупп вели себя наиболее неуверенно и тревожно, что выразилось в большем количестве пересечений клеток места бассейна и отсутствии выраженной стратегии поиска цели.
Данные групп с введением ОФР с концентрацией озона 1.7 мкг/мл позволяют предположить незначительное влияние введенного озона на структуры мозга, отвечающие за воспроизведение долговременной памяти, так как с течением времени значение оКс и выраженность стратегии поиска цели увеличились, то есть сохранение долговременной памяти осталось неизменным.
Воздействие ОФР на структуру нейронов и ткани мозга оценивали по степени выраженности периваскулярного, перинейронального и пери-нуклеарного отека, а также по расположению хроматина в ядре, наличию ядрышек. Исследования показали, что изменения структуры неокор-текса носят дозозависимый характер и наиболее выражены через 14 суток после применения ОФР: выраженные отеки, агрегация хроматина, отсутствие ядрышек, в некоторых случаях при введении ОФР с высокой концентрацией озона -выпадение нейронов. Через 30 дней отмечалась тенденция к уменьшению отека, увеличению активно функционирующих нейронов. К 60 суткам структура коры головного мозга не отличалась от исходной после введения ОФР с низкими концентрациями озона, тогда как при применении высокой концентрации озона сохранялся умеренно выраженный отек.
Список литературы
1. Перетягин С.П., Костина О.В., Кузьмина Е.И. и др. Методика индивидуального подбора
лекарственных препаратов с антиоксидантной активностью в комплексной терапии ожоговой болезни // Матер. 4-ой науч.-практ. конф. «Озон и методы эфферентной терапии в медицине». Н. Новгород, 2000. С. 173.
2. Bocci D. // J. Int. Med. Res. 1992. V. 22. P. 131144.
3. Sartori H.E. Ozon the eternal purifier of the Earth and cleanser of all living beings. // Life Science Foundation. 1994. V. 3. P. 556 .
4. Конторщикова К.Н. Биохимические основы эффективности озонотерапии // Матер. 4-ой науч.-практ. конф. «Озон и методы эфферентной терапии в медицине». Н. Новгород, 1995. С. 8.
5. Родина В.И., Крупина Н.А., Крыжанов-ский Г.Н., Окнина Н.Б. Новый метод оценки тревож-но-фобических состояний у крыс // Высш. нервн. деят. 1992. Т. 43. № 5. С. 1006-1017.
6. Morris R. // J. Neurosci. Methods. 1984. V. 11. P. 47-60.
7. Микроскопическая техника / Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Петрова. М.: Медицина, 1967. 544 с.
THE INFLUENCE OF THE OZONATED PHYSIOLOGICAL SOLUTION ON THE MORPHOFUNCTIONAL STATE OF THE BRAIN AND PRESERVATION OF THE LONG-TERM MEMORY IN RATS
O.S. Evdokimova, A. A Mironov, N. V. Zhemarina
Our experiments revealed a dose-dependent effect of the ozonated physiological solution (OPS) on the morpho-functional state of the rat’s brain. It was found that intraperitoneal introduction of the OPS with a low concentration of ozone favours preservation and reproduction of the long-term memory. High ozone concentrations were found to inhibit orientation reflexes and the motor activity of rats, and animals’ response failure to new environment was revealed.
Keywords: ozone, “open field”, water maze of Morris, neocortex.
