Влияние отдельных мутаций в генах, кодирующих внутренние белки вируса гриппа a, на формирование гуморального и клеточного иммунного ответа у мышей Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Standardized detection and quantification of parodontopathogenic microorganisms in the clinical material (the contents of the periodontal pocket, saliva) using Real-Time PCR. To optimize the conditions for the analysis, a method for obtaining clinical samples of a known volume was developed, and a calibration sample was developed to obtain reliable results in the diagnosis of periodontitis. Keywords: Periodontitis, Real-Time PCR, early diagnosis, evaluation of treatment effectiveness.

Для цитирования: Баймиев Ал.Х., Швец К.Ю., Мавзютов А.Р., Тамарова Э.Р., Булгакова А.И. Количественный анализ микро-

биоты пародонтальных карманов и слюны методом ПЦР в режиме реального времени до и после лечения пародонтита. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017;35(3):103-108. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-3-103-108.

For correspondence: Aleksey H. Baymiev; Ph.D, Head of Laboratory, baymiev@mail.ru

Acknowledgments. The study had no sponsorship. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 14.11.16 Accepted 28.08.17

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017

УДК 578.832.1:578.53].083.33

Петухова Г.Д., Лосев И.В., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г.

влияние отдельных мутаций в генах, кодирующих внутренние

БЕЛКИ ВИРУСА ГРИППА A, НА ФОРМИРОВАНИЕ ГУМОРАЛьНОГО И КЛЕТОЧНОГО

ИММУННОГО ОТВЕТА У МЫШЕЙ

ФГБНУ «Институт Экспериментальной Медицины», Санкт-Петербург, 197376, ул. Академика Павлова, д. 1; Россия

Данное исследование касается актуальной проблемы вакцино-профилактики — разработки подходов к повышению иммуно-генности гриппозных вакцин, и направлено на изучение влияния мутаций, ответственных за степень аттенуации вирусов гриппа, на формирование иммунного ответа. Проведён анализ гуморального и клеточного иммунного ответа у мышей при введении штаммов вируса гриппа А, содержащих по одной и в комбинациях точечные мутации, характерные для донора аттенуации А/ Ленинград/134/17/57 (Н2№), используемого в настоящее время для приготовления отечественной живой гриппозной вакцины. В ходе исследования 13 мутантных штаммов сравнивали с донором аттенуации (содержащим все эти мутации) и его «диким» предшественником (без мутаций).

Было показано, что присутствие во внутренних генах «дикого» вируса некоторых единичных мутаций, характерных для донора аттенуации, а также их комбинаций может влиять не только на количественные показатели гуморального иммунного ответа, но и на скорость накопления специфичных к вирусу сывороточных и секреторных антител. Группа вирусов с мутациями в М1 гене выделялась по способности стимулировать Т-клеточный ответ. Перспективным подходом в отношении разработки способов повышения иммуногенных свойств живых гриппозных вакцин является дальнейший поиск сбалансированной комбинации мутаций в генах M1 и Ш2, усиливающих стимуляцию большинства изученных факторов иммунного ответа, с мутациями в генах по-лимеразного комплекса, придающими штаммам аттенуирующие свойства.

Ключевые слова: грипп, живая гриппозная вакцина, ат-тенуация, иммунитет

Для цитирования: Петухова Г.Д., Лосев И.В., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Влияние отдельных мутаций в генах, кодирующих внутренние белки вируса гриппа А, на формирование гуморального и клеточного иммунного ответа у мышей. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017;35(3):108-114. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-3-108-114.

Грипп остается одной из центральных проблем современной вирусологии. Ежегодно от этой инфекции умирают до полумиллиона человек по всему миру [1]. На сегодняшний день наиболее эффективным методом борьбы с гриппозной инфекцией признана вакцино-

Для корреспонденции: Петухова Галина Дмитриевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. отд. вирусологии ФГБНУ «ИЭМ» (197376, Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12) e-mail: gala. iem@gmail.com

профилактика [2]. Основной целью любой вакцинации является формирование иммунологической памяти, обеспечивающей быстрый и эффективный иммунный ответ при последующем контакте организма с циркулирующим вирусом. В случае гриппозной инфекции особенно актуальна стимуляция иммунного ответа в верхних отделах дыхательного тракта, так как именно слизистые оболочки верхних дыхательных путей являются первым и наиболее значимым барьером на пути проникновения респираторных инфекций [3]. В отношении индукции локального иммунитета наибольшей эффективностью обладают интраназальные живые гриппозные вакцины [4], в состав которых входят штаммы вирусов гриппа, аттенуированные (ослабленные) путем генетической реассортации актуальных циркулирующих вирусов с холодоадаптированным донором аттенуации. Однако аттенуация вирусов гриппа, происходящая в результате появления различных мутаций в его внутренних генах, может приводить к снижению их иммуногенности [5].

Наши предыдущие исследования показали, что процесс аттенуации вирусов гриппа методом генетической реассортации приводит к снижению некоторых параметров первичного и вторичного системного иммунного ответа у мышей [6]. Однако общие показатели локального иммунного ответа в НАЛТ (назоассоциированной лимфоидной ткани) на аттенуированный вирус остаются на том же уровне, что и при введении патогенного штамма [7]. В ходе дальнейшего экспериментального исследования индукции у мышей специфических к вирусу гриппа А (Н1Ш) СБ8+СБ44Ы Т-лимфоцитов памяти, нами была доказана способность аттенуированно-го реассортантного вируса увеличивать уровни Т-клеток памяти в НАЛТ мышей, однако в меньшей степени, чем патогенный вирус [8].

Отечественный донор аттенуации А/Ленинград/ 134/17/57 (Н2№) отличается от своего «дикого» предшественника рядом мутаций в генах, кодирующих внутренние белки. Процедура аттенуации штаммов вируса гриппа неизбежно сопровождается изменением качественных и количественных характеристик их иммуногенности по сравнению с естественной инфекцией. Молекулярные механизмы аттенуации вирусов гриппа для производства живых гриппозных вакцин активно изуча-

ются. Так установлено, что основную роль в аттенуации вакцинных штаммов вируса гриппа играет ряд точечных мутаций в генах его полимеразного комплекса [9]. Внесение данных мутаций в геном летального для мышей вируса А/РЯ/8/34 (Н1Ш) приводило не только к снижению его вирулентных свойств, но также оказывало влияние на индукцию таких факторов гуморального иммунного ответа, как антигемагглютинирующие антитела и иммуноглобулины классов А и G [10]. Однако в данной работе не изучались мутации, расположенные в других генах вируса, которые не ответственны за аттенуацию вакцинных вирусов, но при этом могут оказывать существенное влияние на формирование иммунного ответа после вакцинации.

Целью данного исследования было изучение влияния мутаций, ответственных за степень аттенуации вирусов гриппа, на формирование и интенсивность развития гуморального и клеточного иммунного ответа в верхних дыхательных путях при первичном и повторном контакте организма с такими вирусами.

Материал и методы

В работе использовали мутантные штаммы вируса гриппа А/Ленинград/134/57 (Н2№), полученные нами ранее при помощи целенаправленного точечного мутагенеза, содержащие во внутренних генах точечные мутации, специфичные донору аттенуации [9]. В качестве контрольных вирусов использовали штамм с полным набором мутаций донора аттенуации во внутренних генах (Ьеп/17 са) и его «дикий» предшественник без мутаций (Ьеп/134 wt). Характеристики вирусов представлены в таблице.

Характеристики мутантных штаммов, использованных в работе

Вирусы Наличие мутаций, характерных для донора аттенуации Len/17 Репродукция вирусов (lg EID50±SD)

PB2 PB1 PA NP Ml NS2 в лёгких в носо-

478 265 591 28 341 492 15 144 100 вых ходах

Len/134 Len/17

PB2-V478L

PB1-K265N

PB1-V591I

PA-L28P

PA-V341L

NP-N492S

M1-I15V

M1-F144L

NS2-M100I

PB2-V478L; PB1-K265N, V591I

M1-I15V, F144L

M1-I15V, F144L; NS2-M100I

PB2-V478L; PB1-K265N,V591I; NS2-M100I

Референс-вирусы

Вирусы с единичными мутациями

Вирусы с комбинациями мутаций

Примечание. Серым цветом обозначено наличие мутации.

Накопление вирусов гриппа проводили с использованием развивающихся куриных эмбрионов [11]. Вируссо-держащую жидкость очищали при помощи ультрацентрифугирования и хранили при температуре -70°C до использования в дальнейших экспериментах.

Инфекционный титр исследуемых вирусов гриппа определяли путем их титрования на культуре клеток MDCK стандартным методом [11]. Титры вирусов рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в виде TCID,0 [12].

Интенсивность репродукции вирусов в верхних и нижних отделах дыхательного тракта оценивалась на мышах линии CBA, интраназально инфицированных исследуемыми вирусами в дозе 5,5 lgTCID50 в 20 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера, интраназально, под легким эфирным наркозом. Изъятие тканей верхнего отдела дыхательных путей и лёгких производили на 3-и сутки после заражения. Наличие репродукции вируса в органах определяли путём титрования гомогенатов тканей в развивающихся куриных эмбрионах, после чего определяли 50% инфекционную дозу по методу Рида и Менча [12].

Титры антигемагглютинирующих антител в сыворотках крови иммунизированных животных проводили в реакции торможения гемагглютинации [11] (РТГА), с использованием в качестве антигена вируса Len/134 wt. Средние геометрические титры антител выражали в виде log2 ±SD.

Специфичные к вирусу антитела в сыворотках крови и носовых смывах лабораторных животных определяли методом иммуноферментного анализа, используя предварительно очищенный с помощью ультрацентрифугирования на градиенте плотности сахарозы вирус Len/134 wt, с последующим измерением уровней сывороточных IgG, IgM и локальных IgA коммерчески доступными антителами, согласно рекомендациям производителей («Sigma»). Титры антител выражали в виде log2±SD.

Определение вирусспе-цифических CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов назоассоци-ированной лимфоидной ткани (НАЛТ) и селезёнки проводили методом проточной цитометрии. Для выявления специфичных к вирусу T-клеток использовали метод внутриклеточного окрашивания цитокинов (IFN-y) [13] после стимуляции клеток in vitro 12 MOI (multiplicity of infection) очищенного Len/134 wt. Для определения спонтанной интерферонопродук-ции, вместо вируса к клеткам добавляли соответствующий объём питательной среды RPMI-1640. При анализе эти данные (отрицательный контроль) вычитались из показателей, полученных для вирус-стимулированных клеток. В качестве положительного контроля использовалась

4,4 ± 1,4 1,9 ± 0,9

3,4 ± 2,0

4.7 ± 0,4 5,1 ± 1,2 5,0 ± 0,3

5.4 ± 0,2 4,6 ± 1,2

2.5 ± 1,1

4.8 ± 0,5

4.6 ± 0,4

2.4 ± 1,2

2.3 ± 0,9

1,6 ± 0,9

1.5 ± 0,6 1,2 ± 0,0 1,2 ± 0,0 1,2 ± 0,0 2,0 ± 0,3

2.4 ± 1,0 4,8 ± 0,4 2,4 ± 1,2

1,2 ± 0,0 1,2 ± 0,0

5,7 ± 0,5 4,6 ± 0,6

1,2 ± 0,0 2,0 ± 1,4

1,2 ± 0,0 1,5 ± 0,5

10,00 -| 9,00-q 8,00-И 7,00 -* 6,00-t 5,00 -Чм 4,00 -^ 3,00-1 2,001,00 -0,00 -

S

/ л/

/ #

s*5" ^ ^

^ ^

у

^ ¿г

У"

Q После первичной иммунизации (День 28)

После повторной иммунизации (День 56)

Рис. 1. Продукция сывороточных антигемагглютинирующих антител после первичной и повторной иммунизации мутантными

штаммами

Данные представлены как log2 средних геометрических титров ± стандартное отклонение.

стимуляция клеток стафилококковым энтеротоксином В, который вызывает поликлональную неспецифическую активацию Т-лимфоцитов.

Статистическую обработку результатов проводили при помощи непараметрического критерия Манна— Уитни с использованием программ «Statistica 6.0» и «GraphPad Prizm 5.0». Различия считались достоверными, если значение р не превышало 0,05.

Результаты и обсуждение Сравнение репродукции изучаемых мутантных штаммов в верхних и нижних отделах дыхательного тракта мышей проводили на 3-й день после введения вирусов (см. табл.). Вирусы Ьеп/134 wt и Ьеп/17 са, от-

личающиеся по признаку температурочувствительности [9], показали классическую картину различий между ат-тенуированным штаммом и его «диким» предшественником: размножение донора аттенуации в лёгких было существенно снижено. Мутантные вирусы, содержащие во внутренних генах единичные мутации, по характеристикам репродукции, в основном, оказались ближе к Len/134 wt, чем к Len/17 ca — большинство из них размножались в легких мышей до высоких титров (4,6—5,1 lg EID/мл), отставая по репродукции в носовых ходах (1,2—2,4 lg ЕГО50/мл). Исключение составили два вируса с мутациями в гене M1 : мутация I15V снижала титры вируса в лёгких (2,5 lg ЕГО50/мл), а мутация F144L усиливала репродукцию в носовых ходах (4,8 lg ЕГО50/мл).

6,00 -| 5,00% 4,00 g 3,00 -|

CN

en 2,00 А о

-1 1,000,00

J3

à

# о<Г

/ #

Л

Л

^ # s

Q После первичной иммунизации (День 28)

После повторной иммунизации (День 56)

Рис. 2. Продукция локальных в верхних дыхательных путях после первичной и повторной иммунизации мутантными штаммами Данные представлены как ^2 средних геометрических титров ± стандартное отклонение.

1,8-|

1,6-

1,4-

t 1,2-

Z

LL 1,0-

+

"О 0,8-

О

0s 0,6-

0,4-

0,2-

0,0

LL +

■ЯГ "О

о

Селезенка

123456789 10 11 К

Селезенка

1,8-|

1,6-

1,4-

1,2-

t

Z 1,0-

LL

+ 0,8-

■<fr

о 0,6-

go

0,4-

0,2-

0,0-

° Mean IMean+SF

z

LL +

■ЯГ "О

О

123456789 10 11 К

□ Mean IMean+SF

-0,2

16 -, 14 12 -10 -8 -6 -4 2 -0 --2

НАЛТ

123456789 10 11 К

НАЛТ

° Mean IMean+SF

123456789 10 11 К

□ Mean IMean+SF

Рис. 3. CD4+ и CD8+ Т-клетки (%) в селезёнке и НАЛТ после повторной иммунизации вирусами с единичными мутациями.

1 — ЬЕП^; 2 — ЬЕ№са; 3 — РВ2^478Ь; 4 — РВ1-К265М 5 — РВ1-У5911; 6 — РА-Ь28Р; 7 — РА^341Ь; 8 — NP-N492S; 9 — М1-115^ 10 -

M1-F144L; 11 — ^2-М1001; К — интактные мыши.

Штаммы с комбинациями мутаций в генах M1 и NS2 также не проявляли аттенуирующих свойств. Вирусы же с мутациями в полимеразных генах, напротив, по репродукции оказались ближе к донору аттенуации. Таким образом, большинство вирусов, несущих во внутренних генах единичные мутации, характерные для донора аттенуации, имели non-att-фенотип. Att-фенотип начинал проявляться только при одновременном внесении мутаций в гены PB1 и PB2. Эти данные хорошо коррелируют с результатами, полученными при введении исследуемых мутаций в PB1 и PB2 гены вирулентного штамма А/ PR/8/34 (H1N1): одновременное их введение приводило к полной аттенуации вируса для мышей [10].

Оценку продукции антител у мышей в ответ на введение исследуемых вирусов мы начали с классической реакции РТГА с сыворотками крови (рис. 1). Единичные мутации PB1-K265N и NP-N492S несколько снижали титры антител через 28 дней после иммунизации по сравнению с «диким» вирусом, в то время как M1-F144L и NS2-M100I не уступали по этому параметру Len/134 wt (5,66 log^^), существенно превышая показатели Len/17 ca (4,16 log2CFr) (p = 0.018). После первичного введения вирусов с комбинациями мутаций, уровни сывороточных антигемагглютинирующих антител к 28-му дню достигали 5,32—6,57 log2CrX При повторной иммунизации, в ответ на введение всех вирусов наблюдалась усиленная продукция антител. Наименее выраженной она была у штаммов с мутациями PB2-V468L,

М1-И44Ь и П82-М1001, которые вызвали наиболее существенный прирост антител сразу после первой иммунизации. Повторное введение вирусов приводило к увеличению титров сывороточных антител еще на 0,5— 1,75 log2СГТ, и при этом большинство изученных вирусов не уступало Ьеп/134 по этому показателю. Исключение составил штамм с мутациями в генах РВ1 и РВ2, существенно уступавший по этому параметру как Ьеп/134 О = 0,003), так и Ьеп/17 са О = 0,004), что хорошо коррелирует с его сниженной способностью к репродукции в верхних и нижних дыхательных путях мышей. Также обращает на себя внимание вирус с мутациями в генах М1 и N82, достоверно превысивший показатели Ьеп/134 ф = 0,032) и Ьеп/17 са ф = 0,003).

Титры антигемагглютинирующих антител к вирусам с единичными мутациями через 28 дней после первой иммунизации коррелировали с уровнями специфичных к вирусу сыворотчных IgG, но не ^М (данные не приведены).

В отношении гриппозной инфекции очень актуален вопрос формирования локальных антител во входных воротах инфекции (верхних дыхательных путях). Поэтому далее нами были изучены различия в стимуляции изучаемыми штаммами локальных ^А в смывах верхних дыхательных путей (рис. 2).

Нами были отмечены единичные мутации в М-гене (М1-115У и М1-И44Ь — оказавшие влияние на репродукцию вируса в легких и носовых ходах соответствен-

но), которые приводили к более интенсивной продукции антител, чем аттенуированный вирус Ьеп/17 са. При этом штамм с мутацией М1-115У, снижавшей репродукцию вируса в лёгких, стимулировал ^А так же хорошо, как и Ьеп/134 wt. Присутствие одновременно двух мутаций в гене М1, а также добавление мутации в гене приводило к ускоренному накоплению локальных ^А при первичном иммунном ответе. После повторного введения вирусов уровни антител к этим вирусам были ниже, чем у штаммов, отстававших после первичной иммунизации. Вирус с мутациями в полимеразных генах (РВ1 и РВ2) вел себя сходно с донором аттенуации, однако

дополнительное внесение мутации в ген ^2 меняло его поведение, ускоряя выработку локальных ^А при первичном, и снижая при повторном иммунном ответе.

Заключительным этапом настоящей работы явилось исследование Т-клеточной иммунологической памяти в назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ) и селезёнке мышей. На первом этапе работы мы проанализировали вирусы с единичными мутациями. Было показано, что введение всех этих штаммов приводит к достоверному увеличению уровней CD4+ и CD8+ Т-клеток как в НАЛТ, так и в селезёнке по отношению к контрольной (неиммунизированной) группе мышей

С04

07-1

021-1

0,5 -| 1,0-1

а> > 0,4- аз > 0,8-

I

ю о 0,3- И о 0,6-

а. т о.

■г. 0,2- _ I I г 0,4-

и. I " I и.

чР 0,1 - ■ чР 0,2-

0,0- —I- -1-1-1- м 0,0-

1 — Ьеп/134 «Л

2 — 1_еп/17 са

3 — РВ2Л/4781_; РВ1-К265М, У5911

4 — РВ2Л/4781_

5 —М1-И5У, Р144\.

6 —М1-И5Ч Р144Ц М82-М1001

7 — РВ2-У478Ь; РВ1-К265М, У5911; М32-М1001

1 2 3 4 5 6 7 К

1 2 3 4 5 6 7 К

03-2

07-2

021-2

1,5

I

1,0-

о о.

г-

¡1 0,50,0-

I К

1 2 3 4 5 6 7 К

2,0 п 2,0 п

1,5- I I 55 1,5-

1,0 0,5- ! I- а. гг у. чР в4 1,00,5- \ 1

0,0- -л-1—¥— 0,0 -

1 5

I I

1 2 3 4 5 6 7 К

1 2 3 4 5 6 7 К

С08

Зп

Оау 7-1

1 2 3 4 5 6 7 К

6 и

% 4-о о.

2-

Оау 21-1

I I I

1 2 3 4 5 6 7 К

1 — 1_еп/134«Л

2 — 1_еп/17 са

3 — РВ2-\/478Ь; РВ1-К265М, У5911

4 — РВ2Л/4781_

5 —М1-115Ч Р1441.

6 —М1-И5У, Р144Ц М52-М1001

7 — РВ2Л/4781_; РВ1-К265М, У5911; М32-М1001

Оау 3-2

1 2 3 4 5 6 7 К

20 -|

аз

■.ё 15 н

1050

Оау 7-2

1 2 3 4 5 6 7 К

15-1

Ъ 10

о

о.

5-

Рау 21-2

1-1

1 2 3 4 5 6 7 К

Рис. 4. Динамические изменения уровней СБ4+ и СБ8+ Т-клеток (%) в селезенке мышей при первичном и вторичном иммунном

ответе на вирусы с комбинациями мутаций. К — интактные мыши.

(рис. 3). На основании этих результатов было выделено 2 группы штаммов: 1-я группа - вирусы с мутациями в M1, NP и NS2 генах, которые стимулировали формирование как локальных (НАЛТ), так и системных (селезёнка) Т-лимфоцитов в 2—3 раза активнее, чем Len/134 wt; 2-я группа вирусы с мутациями в PB1 (PB1-K256N и PB1-V591I), которые совершенно по-разному воздействовали на формирование Т-клеток в селезёнке, но обе не оказывали никакого влияния на локальные Т-клетки.

На 2-м этапе мы провели более подробное исследование имевшихся в наборе штаммов, содержащих мутации 1-й группы в комбинациях с мутациями в генах полимеразного комплекса. На рис. 4 представлены динамические изменения содержания специфичных к вирусу CD4+IFNy+ и CD8+IFNy+ Т-клеток в селезёнке мышей на 7-е и 21-е сутки после первичного и на 3, 7 и 21-е сутки после повторного введения вирусов (интерфе-ронопродукцию измеряли после стимуляции клеток in vitro вирусом Len/134 wt). Группа вирусов с мутациями в M1 гене, как и в случае с единичными мутациями, превосходила все остальные вирусы по способности стимулировать Т-клетки, проявляя эту особенность как при первичном, так и при вторичном иммунном ответе. Это относится как к штамму, содержащему обе мутации в M1 гене, так и к штамму с дополнительной мутацией в NS2 (вирусы 5 и 6 на рис. 4). Комбинации мутаций в генах полимеразного комплекса, напротив, чаще всего снижали эту способность относительно вирусов сравнения. Добавление мутации в NS2 приводило к усилению продукции Т-лимфоцитов на поздних сроках иммунного ответа (вирусы 3 и 7 на рис. 4).

Интересно, что мутации в генах M1 и NS2 не влияли на формирование температурочувствительного фенотипа донора аттенуации [9]. Кроме того, изучение на хорьках одногенных реассортантов, содержащих M и NS гены от донора аттенуации Len/17 ca, а остальные гены — от вирулентного штамма, показали, что мутации в этих генах не отвечают за аттенуирующие свойства вируса [14]. Таким образом можно предположить, что эти мутации являются компенсаторными и возникли в вирусе Len/17 ca в процессе его холодовой адаптации для «смягчения» эффекта от значительного нарушения иммуногенных свойств вируса, обусловленного появлением аттенуиру-ющих мутаций в генах полимеразного комплекса. Обнаруженный в данной работе эффект усиления иммунного ответа за счёт введения Len/17-специфичных мутаций в M и NS гены «дикого» вируса имеет важное значение в контексте обсуждаемой в последнее время возможности повышения эффективности живых гриппозных вакцин за счёт введения в геном реассортантных вакцинных штаммов дополнительного гена от эпидемического родителя (т. е. формула генома 5:3) [15]. Исходя из полученных нами результатов можно предположить, что включение в геном вакцинного штамма M или NS генов от эпидемического вируса, не содержащего изучаемых мутаций, может негативно сказаться на иммуногенности вакцины, а следственно, и ее эффективности.

Подробные исследования локального иммунного ответа проводятся европейскими учеными на материале, полученном после тонзилэктомии. В этих работах было показано наличие локальной иммунологической памяти к циркулирующим вирусам гриппа в верхних дыхательных путях [16] и доказано, что B- и Т-клетки памяти присутстуют в слизистых оболочках верхних дыхательных путей не менее года [17]. Однако такие исследования жестко ограничены по этическим причинам: невозможно провести на людях полноценное изучение влияния степени патогенности возбудителя на

иммунный ответ, а также сравнить иммунный ответ в различных лимфоидных органах. В этом смысле наше исследование локального клеточного иммунного ответа не было лимитировано, так как выполнялось с использованием клеток назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ) и спленоцитов мышей. Иммунизация животных различными по свойствам вирусами гриппа позволило нам проанализировать развитие иммунного ответа на все интересовавшие нас штаммы.

В данной работе мы показали, что присутствие единичных мутаций, характерных для донора аттенуации, и их комбинаций может оказывать влияние на продукцию сывороточных антител, секреторных антител в слизистой оболочке верхних дыхательных путей, а также Т-лимфоцитов назоассоциированной лимфоидной так-ни (НАЛТ) и селезёнки. Это касается не только количественных показателей, но и скорости накопления специфичных к вирусу антител и Т-лимфоцитов. Полученные данные свидетельствуют о том, что не прослеживается очевидной зависимости между размножением мутант-ных штаммов в верхних и нижних отделах респираторного тракта мышей и их способностью стимулировать гуморальный и клеточный иммунный ответ.

Обобщая представленные данные можно отметить, что взаимосвязь между свойствами донора аттенуации и мутациями, придающими ему эти свойства, является сложным, комплексным процессом, который зависит не только от наличия определённых мутаций, но и от их взаимного влияния на иммунный ответ. Полученные результаты определили направление дальнейших исследований для развития подходов к оптимизации иммуно-генности живых гриппозных вакцин — поиск мутаций, которые позволят повысить иммуногенность аттенуи-рованных штаммов при сохранении их авирулентности. Перспективным подходом в этом отношении нам видится дальнейший поиск сбалансированной комбинации мутаций в генах M1 и NS2, усиливающих стимуляцию большинства изученных факторов иммунного ответа, с мутациями в генах полимеразного комплекса, придающими штаммам аттенуирующие свойства.

Финансирование. Данное исследование было поддержано грантом РФФИ № 14-04-32250.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Nisholson K.G., Wood J.M., Zambonet M. Influenza. Lancet. 2003; 362: 1733—45.

2. World Health Organization. Global Action Plan for Influenza Vaccines. Geneva; 2016.

3. Kraehenbuhl J.-P., Neutra M.R. Mucosal vaccines: where do we stand? Curr. Top. Med Chem. 2013; 13: 2609—28.

4. Rose M.A., Zielen S., Baumann U. Mucosal immunity and nasal influenza vaccination. ExpertRev. Vaccines. 2012; 5: 595—607.

5. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука; 1994.

6. Донина С.А., Найхин А.Н., Петухова Г.Д., Баранцева И.Б., Чиркова Т.В., Григорьева Е.П. и др. Системный гуморальный и клеточный иммунный ответ при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации. Медицинская иммунология. 2006; 8(1): 31—6.

7. Petukhova G., Naikhin A., Chirkova Т., Donina S., Korenkov D., Rudenko L. Comparative studies of local antibody and cellular immune responses to influenza infection and vaccination with live attenuated reassortant influenza vaccine (LAIV) utilizing a mouse nasal-associated lymphoid tissue (NALT) separation method. Vaccine. 2009; 27: 2580—7.

8. Найхин А.Н., Кореньков Д.А., Чиркова Т.В., Петухова Г.Д., Донина С.А., Руденко Л.Г. Оценка у людей и экспериментальных животных иммунологической памяти по тестированию трогоци-тоза вирусспецифических Т-лимфоцитов. Вопр. вирусол. 2011; 5: 15—21.

9. Isakova-Sivak I., Chen L.M., Matsuoka Y., Voeten J.T., Kiseleva I., Heldens J.G. et al. Genetic bases of the temperature-sensitive phenotype of a master donor virus used in live attenuated influenza vaccines: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2). Virology. 2011; 412(2): 297—305.

10. Кузнецова С.А., Исакова-Сивак И.Н., Кузнецова В.А., Петухова Г.Д., Лосев И.В., Донина С.А. и др. Влияние точечных мутаций в генах полимеразного комплекса вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) на иммунный ответ мышей. Вопр. вирусол. 2015; 2: 25—31.

11. Cottey R., Rowe C.A., Bender B.S. Influenza virus. In: Current Protocols in Immunology. Wiley Press; 2004: 19.11.1—32.

12. Matsuoka Y., Lamirande E.W., Subbarao K. Mouse model for influenza. In: Current Protocols in Microbiology. Wiley Interscience; 2009: 15G.3.20—30.

13. Foster B., Prussan C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. In: Current Protocols in Immunology. Wiley press; 2004: 6.24.1—16.

14. Kiseleva I., Klimov A., Su Q., Szymkowiak C., Toner T.J., Kwan W.-S. et al. Role of individual genes of the A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) cold-adapted donor strain in manifestation of the temperature-sensitive phenotype of reassortant influenza A viruses. In: Options for the Control of Influenza V. Proceedings of the International Conference on Options for the Control of Influenza V held in Okinawa, Japan, October 7—11, 2003. Elsevier; 2004: 547—51.

15. Isakova-Sivak I., Korenkov D., Rudenko L. Reassortant viruses for influenza vaccines: is it time to reconsider their genome structures? Expert Rev. Vaccines. 2016; 15(5): @565—657.

16. Mahallawi W.H., Kasbekar A.V., McCormick M.S., Hoschler K., Temperton N., Leong S.C. et al. Infection with 2009 H1N1 influenza virus primes for immunological memory in human nose-associated lymphoid tissue, offering cross-reactive immunity to H1N1 and avian H5N1 viruses. J. Virol. 2013; 87: 5331—9.

17. Mohn K.G., Bredholt G., Brokstad K.A., Pathirana R.D., Aarstad

H.J., T0ndel C., Cox R.J. Longevity of B-cell and T-cell responses after live attenuated influenza vaccination in children. J. Infect. Dis. 2015; 211(10): 1541—9.

REFERENCES

1. Nisholson K.G., Wood J.M., Zambonet M. Influenza. Lancet. 2003; 362: 1733—45.

2. World Health Organization. Global Action Plan for Influenza Vaccines. Geneva; 2016.

3. Kraehenbuhl J.-P., Neutra M.R. Mucosal vaccines: where do we stand? Curr. Top. Med. Chem. 2013; 13: 2609—28.

4. Rose M.A., Zielen S., Baumann U. Mucosal immunity and nasal influenza vaccination. Expert Rev. Vaccines. 2012; 5: 595—607.

5. Aleksandrova G.I., Klimov A.I. [Zhivaya vaktsinaprotivgrippa.] St. Petersburg: Nauka; 1994. ( in Russian)

6. Donina S.A., Naykhin A.N., Petukhova G.D., Barantseva I.B., Chirkova T.V., Grigor'eva E.P. et al. [Sistemnyy gumoral'nyy i kletochnyy immunnyy otvet pri eksperimental'noy grippoznoy infektsii i vaktsinatsii]. Meditsinskaya immunologiya. 2006; 8(1): 31—6. (in Russian)

7. Petukhova G., Naikhin A., Chirkova Т., Donina S., Korenkov D., Rudenko L. Comparative studies of local antibody and cellular immune responses to influenza infection and vaccination with live attenuated reassortant influenza vaccine (LAIV) utilizing a mouse nasal-associated lymphoid tissue (NALL) separation method. Vaccine. 2009; 27: 2580—7.

8. Naykhin A.N., Koren'kov D.A., Chirkova Т.У, Petukhova G.D., Donina S.A., Rudenko L.G. [Otsenka u lyudey i jeksperimental'nykh zhivotnykh immunologicheskoy pamyati po testirovaniyu trogotsitoza virusspecificheskikh Т-limfotsitov.] Vopr. virusol. 2011; (5): 15—21. (in Russian)

9. Isakova-Sivak I., Chen L.M., Matsuoka Y., Voeten JT., Kiseleva

I., Heldens J.G. et al. Genetic bases of the temperature-sensitive phenotype of a master donor virus used in live attenuated influenza vaccines: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2). Virology. 2011; 412(2): 297—305.

10. Kuznetsova S.A., Isakova-Sivak I.N., Kuznetsova V.A., Petukhova G.D., Losev I.V., Donina S.A. et al. [Vliyanie tochechnykh mutatsiy v genakh polimeraznogo kompleksa virusa grippa A/PR/8/34 (H1N1) na immunnyy otvet myshey. Vopr. virusol. 2015; (2): 25—31. (in Russian)

11. Cottey R., Rowe C.A., Bender B.S. Influenza virus. In: Current Protocols in Immunology. Wiley Press; 2004: 19.11.1—32.

12. Matsuoka Y., Lamirande E.W., Subbarao K. Mouse model for

influenza. In: Current Protocols in Microbiology. Wiley Interscience; 2009: 15G.3.20—30.

13. Foster B., Prussan C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. In: Current Protocols in Immunology. Wiley press; 2004: 6.24.1—16.

14. Kiseleva I., Klimov A., Su Q., Szymkowiak C., Toner T.J., Kwan W.-S. et al. Role of individual genes of the A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) cold-adapted donor strain in manifestation of the temperature-sensitive phenotype of reassortant influenza A viruses. In: Options for the Control of Influenza V. Proceedings of the International Conference on Options for the Control of Influenza V held in Okinawa, Japan, October 7—11, 2003. Elsevier; 2004: 547—51.

15. Isakova-Sivak I., Korenkov D., Rudenko L. Reassortant viruses for influenza vaccines: is it time to reconsider their genome structures? Expert Rev. Vaccines. 2016; 15(5): @565—657.

16. Mahallawi W.H., Kasbekar A.V., McCormick M.S., Hoschler K., Temperton N., Leong S.C. et al. Infection with 2009 H1N1 influenza virus primes for immunological memory in human nose-associated lymphoid tissue, offering cross-reactive immunity to H1N1 and avian H5N1 viruses. J. Virol. 2013; 87: 5331—9.

17. Mohn K.G., Bredholt G., Brokstad K.A., Pathirana R.D., Aarstad H.J., T0ndel C., Cox R.J. Longevity of B-cell and T-cell responses after live attenuated influenza vaccination in children. J. Infect. Dis. 2015; 211(10): 1541—9.

Petukhova G.D., Losev I.V., Isakova-Sivak I.N., Rudenko L.G.

EFFECT OF SINGLE MUTATIONS IN THE INTERNAL PROTEIN GENES OF INFLUENZA A VIRUS ON THE ANTIBODY AND CELLULAR IMMUNE RESPONSES IN MICE

FSBSI «IEM», Saint-Petersburg, 197376, Academic Pavlov str. 12,

Russia

This work is related to one of the urgent virological problems: search of the approaches to enhance the immunogenicity of influenza vaccines. In this study we used (i) A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) master donor virus (Len 17/ ca), which is currently used for Russian Live Attenuated Influenza Vaccine production, (ii) it's wild-type parent (Len 134/ wt) without mutations and (iii) 13 mutant strains containing single mutations (and their combinations) specific to Len 17/ ca.

It was shown that point mutations could have an impact on quantitative parameters and on the dynamics of antibody immune response. Viruses with mutations in M1 gene were able to increase virus-specific T-cells in spleen significantly.

We consider that further search of a balanced combination of mutations in M1 and NS2 genes showed the most effect on immune responses with mutations in polymerase genes (which are responsible for attenuation) is the promising way to reach better immunogenicity of Live Attenuated Influenza Vaccine.

Keywords: influenza, live attenuated influenza vaccine, attenuation, immunity

For citation: Petukhova G.D., Losev I.V., Isakova-Sivak I.N., Rudenko L.G. Effect of single mutations in the internal protein genes of Influenza A virus on the antibody and cellular immune responses in mice. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(3): 108114 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-3-108-114.

For correspondence: Galina D. Petukhova, PhD, senior researcher of the Dept. of Virology FSBSI «IEM» (197376, Academic Pavlov str. 12, Saint-Petersburg, Russia) e-mail: gala.iem@gmail.com Information about authors:

Petukhova G.D., http://orcid.org/0000-0001-9312-4739

LosevI.V., http://orcid.org/0000-0002-5245-7315

Isakova-Sivak I.N., http://orcid.org/0000-0002-2801-1508

RudenkoL.G., http://orcid.org/0000-0002-0107-9959

Acknowledgments. This work was supported by the Russian Foundation

for basic research № 14-04-32250.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 14.11.16 Accepted 27.05.17