CC BY
10УДК 619:615.849:579.8:615.322 DOI 10.33632/1998-698Х.2021-5-4-9
ВЛИЯНИЕ ОРГАНОМИНЕРАЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ НА РАЗВИТИЕ РАДИОИНДУЦИРОВАННОЙ АЛЛЕРГИИ
Р.Р. Гайнуллин - кандидат биологических наук, Р.Н. Низамов - доктор ветеринарных наук, профессор, Н.М. Василевский - доктор ветеринарных наук, профессор, Д.Т. Шарифуллина - кандидат биологических наук, З.Р. Камалова - аспирант
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», 420075, г. Казань, Научный городок - 2, e-mail: vnivi@mail.ru
Учитывая, что одним из ключевых механизмов лучевого поражения организма является развитие аутосенсибилизации, проводили исследования с целью оценки десенсибилизирующего действия высокодисперсной системы на основе иммуноглобулина (дисперсная фаза) и гидросиликата алюминия (дисперсионная среда).
Специфические антирадиотоксические иммуноглобулины получали путем 4-кратной иммунизации радиоантигеном (радиоаллергеном). Специфический лучевой аллерген получали путем экстрагирования облученных в дозе 400 Гр клубней картофеля. Полученный экстракт после хроматографической очистки и изолирования хиноидного радиотоксина и конъюгирования его с неполным адъювантом Фрейда, использовали в качестве иммунизирующего агента (хиноидного радиотоксина). Через 7 дней после последнего введения конъюгированного антигена (радиоаллергена) у животных брали кровь, выделяли глобулины и объединяли их с дисперсной средой (микрочастицами гидросиликата алюминия - бентонита). Высокодисперсную фракцию бентонита (600 мкм) вносили в глобулины из расчета 200 мг на 100 мл антирадиотоксических глобулинов (0,2 %-ный коллоидный раствор). Полученную дисперсную систему (коллоид) вводили однократно подкожно облученным гамма-квантами в дозе 7,7 Гр (ЛД100/30) радиосенсибилизированным белым мышам через 24 часа после облучения, а через 10 суток после облучения (разгар острой лучевой болезни) этим животным в область верхней губы также вводили лучевой аллерген (радиотоксин). Гипо- и десенсибилизирующие свойства испытуемого комплексного препарата (металлоглобулинового коллоида) оценивали по степени ингибирования развития пострадиационной аутоаллергии (индекса аллергии - ИА), по уровню синтеза специфических блокирующих антител - ^ G, снижению показателей повреждения нейтрофилов (ППН-тест), модификации течения и исхода острой лучевой болезни (ОЛБ). Установлено, что однократное подкожное применение разработанной коллоидной системы на основе глобулинов и высокодисперсных частиц монтмориллонита оказывало десенсибилизирующее и радиозащитное действие, модифицируя течение острой лучевой болезни (перевод тяжелой степени ОЛБ в легкую форму), ингибируя пострадиационную аутоаллергию, увеличивая синтез специфических («блокирующих») антител
(Ы О).
Ключевые слова: лучевая аллергия, аутосенсибилизация, десенсибилизация, радиоаллерген, радиотоксин, дисперсная система, коллоидные растворы, высокодисперсные частицы, монтмориллонит, специфические антирадиотоксические глобулины.
Введение. Поскольку в патогенезе лучевой болезни важную роль играет развитие аутосенсибилизации, обусловленной индукцией в облученном организме образованиями анафилотоксинов-радиотоксинов [7], логично предположить то, что лекарственная терапия десенсибилизирующего характера окажется эффективной для борьбы с аутоаллерги-ческими процессами при лучевой болезни.
Действительно, лечебные средства, применяемые при лучевой болезни (вещества микробного, зоогенного и фитогенного происхождения) [4; 5; 9; 10; 13; 3], наряду с различными механизмами действия, характерными для каждого из этих средств, обладают способностью воздействовать на иммунологическую реактивность облученного организма, в результате чего, изменяется форми-
рование аллергических или аутоиммунных реакций [12].
Из широкого спектра терапевтических средств лучевых поражений необходимо выделить средства в течение многих лет успешно применяющиеся при радиопатологии, в патогенезе которой большое значение придается аутоаллергическим и аутоиммунным процессам (препараты глобулинов и радиосорбентов) [10].
Среди механизмов действия глобулинов при радиационной патологии выделяют их десенсибилизирующее действие [2]. Однако сведений о влиянии антирадиотоксического глобулина в комплексе с иммуносорбентом -высокодисперсной фракции монтмориллонита (бентонита), непосредственно на радиоинду-цированные аутоаллергические (радиосенси-билизирующие) реакции не имеется.
Исходя из вышеизложенного, нами были проведены исследования, целью которых явилось изучение десенсибилизирующего действия комплексного препарата - коллоидного раствора на основе специфических антирадиотоксических глобулинов и иммуно-сорбента - высокодисперсной фракции бентонита (монтмориллонита).
Материалы и методы. В основу изготовления специфического (лучевого) аллергена положены методы получения естественного радиомиметика хиноидной природы из растительного объекта [4]. В качестве источника радиосенсибилизатора-аллергена использовали клубни картофеля, которые облучали гамма-лучами 60Со в дозе 400 Гр. Облученные клубни гомогенезировали в 96 %-ном этаноле в соотношении 1:5, экстрагировали в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Строму отделяли, экстра-гент удаляли с помощью ротационного вакуумного испарителя при температуре плюс 2830 оС. Концентрированный экстракт разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:5 и использовали как в качестве специфического аллергена (для внутрикожной лабиальной пробы), так и в качестве радиоантигена для гипериммунизации животных, и получения специфических антирадиоток-сических глобулинов. Для получения специфических антирадиотоксических сывороток, овец иммунизировали конъюгированным антигеном, используя 4-кратную схему с интервалом 2 недели между введениями. Через 7 дней после последнего введения антигена у животных брали кровь, получали сыворотку и ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИ
выделяли глобулин путем высаливания сульфатом аммония [8]. В глобулинах диспергировали микрочастицы монтмориллонита, полученные путем селективного фракционирования по З.В. Пручкиной и др. [11, 1]. Высокодисперсную фракцию бентонита вносили в глобулины из расчета 0,2:95,8 и полученный коллоидный раствор использовали в качестве десенсибилизирующего средства при радиоиндуцированной лучевой аллергии. Моделирование лучевой аллергии осуществляли путем тотального облучения белых мышей гаммаквантами в дозе 7,7 Гр (ЛД 100/30) и через 24 часа после облучения однократно подкожно вводили облученным животным глобулин-бентонитовый комплекс в дозе 25 мг/кг живой массы (0,15 мл/животное). Аллергенные свойства препарата (радиоаллергена) и антиаллергенные свойства коллоидного раствора на основе глобулина и высокодисперсного иммуно-сорбента оценивали методом лабиальной пробы по Freud J., Stone S. (1956) [14].
Десенсибилизирующие свойства коллоидного раствора (металлоглобулинового комплекса) оценивали по степени ингиби-рования индекса аллергии (ИА), уровню синтеза специфических «блокирующих» антител - Ig G, степени повреждения нейтрофилов (ППН-тест), а также по степени радиозащитного действия коллоидного раствора.
Результаты исследований. Введение радиоаллергена необлученным (здоровым, контрольным) животным не вызывало внешних изменений кожи верхней губы. Осмотр проводили через 16-24 часа и затем ежедневно в течение 15 суток. Мыши имели здоровый внешний вид, были активны и подвижны, охотно поедали корм.
Аналогичные результаты были получены и при инъекциях радиоаллергена через 24 часа после облучения. Исходя из того, что облучение проводилось летальными дозами, в этот период еще не развивались клинические проявления лучевой болезни. По внешнему виду животные не отличались от контрольных, хотя в тоже время начали регистрировать некоторые отличия живой массы (на 1, 2 г), а также появление лейкопении у животных.
Облучение животных в дозе 7,7 Гр вызывало развитие лучевой болезни тяжелой степени. Реакция на облучение вначале характеризовалась быстрым развитием болезни, сопровождаемой возбуждением животных, а у некоторых особей, проявляющееся мышечной 1В ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
дрожью. Впоследствии наблюдали нарушение координации движений, угнетение общего состояния и гиподинамию, у животных наступала общая депрессия. При дальнейшем наблюдении животные полностью отказывались от корма, активно теряли массу, у некоторых появлялись кровотечение из ноздрей.
В первые дни после облучения проводили гематологические исследования, в
результате которых обнаруживали лейкопению, лимфопению, гемоглобинемию, которые в дальнейшем прогрессировали, и на этом фоне наступала гибель животных на 23-24 дни после облучения.
Результаты аллергических исследований, проведенных на 5, 10, 15, 20, 25 и 30 сутки после облучения, представлены в таблице 1.
Таблица 1- Результаты аллергометрической оценки лабиальной реакции у мышей, облученных в дозе 7,7 Гр при введении радиоаллергена в дозе 0,1 см3_
Группа животных Количество мышей, положительно реагировавших на испытуемый аллерген после облучения (сут), п=10
5 10 15 20 25 30
К - - - - - -
О 8/2 (80 %) 10/0 (100 %) 10/0 (100 %) 7/3 (70 %) 6/4 (60 %) Т
О+КО 6/4 (60 %) 4/6 (40 %) 3/7 (30 %) 2/8 (20 %) 1/9 (10 %) 0/9 (0 %)
Примечание - К - контроль; О - облученные; О+КО - облученные и получавшие коллоидный препарат. Цифры в скобках - процент реагировавших на аллерген положительно; числитель - количество реагировавших отрицательно; знаменатель - количество реагировавших положительно; Т - животные пали
Анализируя данные таблицы, необходимо отметить то, что развитие острой лучевой болезни сопровождалось аллергии-ческой перестройкой организма, которая характеризовалась появлением гиперерги-ческой реакции облученных животных на испытуемый аллерген, представляет собой радиотоксин хиноидной природы, полученный из облученного растительного материала. Как видно из таблицы, количество положительно реагирующих на радиоаллерген животных постепенно нарастало с развитием ОЛБ, достигая максимума к 10-15 суткам, и затем постепенно убывало к 20-25 суткам.
У животных, получавших иммуноглобулин-минеральный комплекс (коллоидный раствор) и подвергнутых аллергическим исследованиям в лабиальной пробе с использованием радиоаллергена фитогенного происхождения (хиноидный радиотоксин), наблюю-дали ослабление реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), которая была на 20 % (на 5 сутки) и на 60 % (на 10 сутки) меньше, чем у радиосенсиби-лизированных животных соответственно. Использование коллоидного минералло-глобу-линового комплекса наряду с десенсибилизирующим действием оказывало радиозащитный эффект, обеспечивая выживание всех использованных в опытах животных и ослабляя течение острой лучевой болезни, переводя
ее в легкую форму ОЛБ при радиационной гибели всех облученных животных.
Результаты параллельного аллергии-ческого т vitro-теста - степени повреждения нейтрофилов (ППН) на фоне облучения и применения потенциального гипо- и десенсибилизирующего средства, показали, что повышенная реакция повреждения нейтро-филов у облученных животных (III 1Н=0,77 против 0,03 в контроле), после применения испытуемого лечебного средства снизилась в 7,5 раза, составляя ППН=0,04.
Результаты дальнейших аллергических исследований, включающих тесты 2-го уровня (определение аллергенстимулирующих - ^ E-антител) показали, что использованный в опытах лечебный препарат - коллоидный минералло-глобулиновый комплекс, оказывал гипо- и десенсибилизирующее действия путем усиления синтеза блокирующих (^ G) антител и ингибирования синтеза (блокирования) аллерген-специфических (^ Е) антител.
Заключение. Исходя из результатов проведенных исследований, можно заключить, что коллоидная система, сконструированная на основе антирадиотоксического иммуноглобулина и микрочастиц природного сорбента-монтморилонита, введенного в организм подкожно, обладает выраженной десенсибилизирующей активностью, которая проявляется как по отношению к аллергическим реакциям,
так и по отношению к детерминантам выживаемости при летальном облучении организма. Реализация десенсибилизирующего эффекта осуществляется путем синтеза антиаллергических («блокирующих») антител (^ G), ингибирования аллергенспецифических анти-
тел (^ Е), защиты нейтрофилов от повреждения и выработки ими медиаторов аллергии, которые в совокупности способствуют торможению развития реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на вводимый аллерген-радиотоксин.
Литература
1. Гайнуллин, Р.Р. Применение бентонитов в качестве иммуносорбентов при конструировании противорадиационного диагностикума / Р.Р. Гайнуллин // Ветеринарный врач. -2008. - № 6. - С. 17-20.
2. Иванов, А.А. Противолучевые эффекты иммуноглобулинов / А.А. Иванов, Н.Н. Клемпарская, Г.А. Шальнова. - М.: Энергоатомиздат, 1990. - 176 с.
3. Ишмухаметов, К.Т. Разработка радиомодифицированных мутантов микроорганизмов для профилактики и лечения радиационных поражений животных / К.Т. Ишмухаметов, Р.Н. Низамов, В.Р. Саитов, Н.М. Василевский, М.М. Шакуров, А.С. Гасанов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2020. - Т. 241 (1). - С. 95-98.
4. Конюхов, Г.В. К проблеме поиска средств защиты при поражении животных ионизирующими излучениями / Г.В. Конюхов, Р.Д. Гареев, Р.М. Асланов, Н.Б. Тарасова, В.И. Великанов, К.В. Сычев // Ветеринарный врач. - 2012. - № 6. - С. 20-23.
5. Конюхов, Г.В. Радиозащитная эффективность композиций на основе метаболитов E.coli,
B.bifidum и иммуномодуляторов нового поколения / Г.В. Конюхов, Р.Н. Низамов, Д.Т. Шарифуллина // Ветеринарный врач. - 2016. - № 6. - С. 36-38.
6. Копылов, В.А. Проблема радиотоксинов / В.А. Копылов, А.М. Кузин // Биофизика сложных систем и радиационных излучений. - М.: Наука, 1974. - С. 176-188.
7. Кузин, А.М. Радиотоксины / А.М. Кузин, В.А.Копылов. - М.: Наука, 1983. - 174 с.
8. Кэбот, Е. Экспериментальная иммунохимия / Е. Кэбот, М.Мейер. - М., 1968. - С. 500-501.
9. Низамов, Р.Н. Пути создания радиозащитных средств на основе изучения молекулярно-биологических и патогенетических механизмов лучевого поражения организма / Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов, Л.М. Сургучева, А.С. Титов, А.Ш. Хафизов // Ветеринарный врач. - 2005. - № 1. -
C.35-40.
10. Низамов, Р.Н. Радиозащитный эффект веществ зоогенного происхождения / Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов, Д.Т. Шарифуллина // Ветеринарный врач. - 2019. - № 2. - С. 62-67.
11. Патент № 952260 СССР, МНЛ А 61 К 39/00. Способ получения диагностикума для проведения бентонитовой флокуляции: заявл. 01.04.1981 опубл. 23.08.1982. / З.В. Пручкина, Г.П. Сомов, Л.В. Краснова, Е.Н. Ненода. - 3 с.
12. Хаитов, Р.М. О сниженных анафилактогенных свойствах аллергоида, конъюгированного с синтетическим полимером / Р.М. Хаитов, В.Н. Федосеева, В.И. Некрасов // Иммунология. - 1996. -№ 6. - С. 40-42.
13. Шарифуллина, Д.Т. Разработка технологии конструирования биорадиопротектора на основе веществ микробного и фитогенного происхождения / Д.Т. Шарифуллина, Р.Н. Низамов, М.М. Шакуров // Ветеринарный врач. - 2020. - № 6. - С. 68-73.
14. Freund, J. Arthus reaction in the mouse and the rat after intralabial injection antigens / J. Freund, S. Stone // J. Immunol. - 1956. -Т. 71.- N 2. - P. 138-145.
IMPACT OF ORGANOMINERAL COMPOSITION ON THE DEVELOPMENT OF RADIO-INDUCED ALLERGY
R.R. Gainullin - Candidate of Biological Sciences, R.N. Nizamov - Doctor of Veterinary Sciences, Professor, N.M. Vasilevsky - Doctor of Veterinary Sciences, Professor, D.T. Sharifullina -Candidate of Biological Sciences, Z.R. Kamalova - graduate student
FSBSI «Federal Center for Toxicological, ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИОНАЛОВ ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
Radiation and Biological Safety», 420075, Kazan , Nauchny gorodok-2, e-mail: vnivi@mail. ru
Considering that one of the key mechanisms of radiation damage of the organism is the development of autosensitization, we carried out the research to assess the desensitizing effect of a highly dispersed system based on immunoglobulin (dispersedphase) and aluminum hydrosilicate (dispersion medium).
Specific antiradiotoxic immunoglobulins were obtained by 4-fold immunization with a radioantigen (radioallergen). A specific radiation allergen was obtained by extracting potato tubers irradiated at a dose of 400 Gy. The extract obtained after chromatographic purification and isolation of the quinoid radiotoxin and its conjugation with incomplete Freud's adjuvant was used as an immunizing agent (quinoid radiotoxin). 7 days after the last injection of the conjugated antigen (radioallergen), blood was taken from the animals, globulins were isolated and combined with a dispersed medium (microparticles of aluminum hydrosilicate -bentonite).A highly dispersed fraction of bentonite (600 ¡¡m) was added to globulins at the rate of200 mg per 100 ml of antiradiotoxic globulins (0,2% colloidal solution). The resulting dispersed system (colloid) was injected once subcutaneously with gamma quanta at a dose of 7,7 Gy (LD100/30) to radiosensitized white mice 24 hours after irradiation, and 10 days after irradiation (the height of acute radiation sickness) into the upper lip was also injected with a radiation allergen (radiotoxin).The hypo- and desensitizing properties of the tested complex preparation (metallobulin colloid) were assessed according to the degree of inhibition of the development of post-radiation autoallergy (allergy index - IA), according to the level of synthesis of specific (blocking antibodies - Ig G, decrease in neutrophil damage indicators (PPN-test), modification of the course and the outcome of ARS.
The research established that a single subcutaneous application of the developed colloidal system based on globulins and highly dispersed particles of montmorillonite had a desensitizing and radioprotective effect, modifying the course of acute radiation disease (transferring severe ARS to a mild form), inhibiting post-radiation autoallergy (blocking the synthesis of specific antibodies) (Ig G).
Keywords: radiation allergy, autosensitization, desensitization, radioallergen, radiotoxin, dispersed system, colloidal solutions, fine particles, montmorillonite, specific antiradiotoxic globulins
References
1. Gainullin, R.R. The use of bentonites as immunosorbents in the design of anti-radiation diagnosticum / R.R. Gainullin // Veterinarian. -2008. - No. 6. - P. 17-20, ISSN 1998-698X.
2. Ivanov, A.A. Protivol uchevye effects of immunoglobulins / A.A. Ivanov. Ivanov, N.N. Klemparskaya, G.A. Shalnova. - M.: Energoatomizdat, 1990.- 176 p.
3. Ishmukhametov, K.T. Development of radiomodified mutants of microorganisms for the prevention and treatment of radiation injuries to animals / K.T. Ishmukhametov, R.N. Nizamov, V.R. Saitov, N.M. Vasilevsky, M.M. Shakurov, A.S. Hasanov // Scientific Notes of the Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after V.I. N.E. Bauman. - 2020. - T. 241. - No. 1. - P. 95-98, ISSN 2413-4201 /
4. Konyukhov, G.V. On the problem of searching for means of protection in case of damage to animals by ionizing radiation / G.V. Konyukhov, R.D. Gareev, R.M. Aslanov, N.B. Tarasova, V.I. Velikanov, K.V. Sychev // Veterinarian. - 2012. - No. 6. - P. 20-23, ISSN 1998-698X.
5. Konyukhov, G.V. Radioprotective efficacy of compositions based on metabolites of E. coli, B. bifidum and new generation immunomodulators / G.V. Konyukhov, R.N. Nizamov, D.T. Sharifullina // Veterinarian. - 2016. - No. 6. - P. 36-38, ISSN 1998-698X.
6. Kopylov, V.A. The problem of radiotoxins / V.A. Kopylov, A.M. Kuzin // Biophysics of complex systems and radiation. - M.: Nauka, 1974. - S. 176-188.
7. Kuzin, A.M. Radiotoxins / A.M. Kuzin, V.A. Kopylov. - Moscow: Nauka, 1983. - 174 p.
8. Cabot, E. Experimental immunochemistry / E. Cabot, M. Meyer. - M., 1968. - P. 500-501.
9. Nizamov, R.N. Ways of creating radioprotective agents based on the study of molecular biological and pathogenetic mechanisms of radiation damage to the body / R.N. Nizamov, G.V. Konyukhov, L.M. Surgucheva, A.S. Titov, A. Sh. Khafizov // Veterinarian. - 2005. - No. 1. - P. 35-40.
10. Nizamov, R.N. Radioprotective effect of substances of zoogenic origin / R.N. Nizamov, G.V. Konyukhov, D.T. Sharifullina // Veterinarian. - 2019. - No. 2. - P. 62-67, ISSN 1998-698X.
11. Patent No. 952260 USSR MNL A 61 K 39/00. Method of obtaining diagnosticum for bentonite flocculation: publ. 08/23/1982. / Z.V. Pruchkina, G.P. Somov, L.V. Krasnova, E.N. Nenoda. - Bull. No. 31.
12. Khaitov, R.M. On the reduced anaphylactogenic properties of an allergoid conjugated with a synthetic polymer / R.M. Khaitov, V.N. Fedoseeva, V.I. Nekrasov // Immunology. - 1996. - No. 6. -P. 40-42.
13. Sharifullina, D.T. Development of technology for constructing a bioradioprotector based on substances of microbial and phytogenic origin / D.T. Sharifullina, R.N. Nizamov, M.M. Shakurov // Veterinarian. - 2020. - No. 6. - P. 68-73, ISSN 1998-698X.
14. Freund, J. Arthus reaction in the mouse and the rat after intralabial injection antigens / J. Freund, S. Stone // J. Immunol. - 1956. -T. 71. - No. 2. - P. 138-145.
