ВЛИЯНИЕ ОКСИДА ГРАФЕНА НА МИКРОКЛОНЫ БЕРЕЗЫ ПУШИСТОЙ НА СТАДИИ АДАПТАЦИИ

Стрекалова Наталия Сергеевна; Захарова Ольга Владимировна; Баранчиков Петр Александрович; Гусев Александр Анатольевич

Б01: 10.34220Л88П.2222-7962/2021.2/5 УДК 57.082.261; 620.3

ВЛИЯНИЕ ОКСИДА ГРАФЕНА НА МИКРОКЛОНЫ БЕРЕЗЫ ПУШИСТОЙ

НА СТАДИИ АДАПТАЦИИ

Наталия С. Стрекалова1,kotova-ns@yandex.ru, 0000-0002-6723-3074

Ольга В. Захарова1'2'3, о^а/акИагоуа 1 <7mail.ru. 0000-0001-8590-2529

Петр А Баранчиков1, petrovi4-98@yandex.ru, 0000-0003-0565-3724

Александр А Гусев1'2'4 nanosecurity@mail.ru, 0000-0002-8699-9112

1ФГБОУ ВО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина», ул. Интернациональная, 33, г. Тамбов, 392000, Россия

2ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС», Ленинский пр-т, 4, г. Москва, 119991, Россия

3ФГБОУ ВО «Российский экономический университет имени Г. В. Плеханова», Стремянный пер., 36, г. Москва, 117997, Россия

4ФГБОУ ВО «Воронежский государственный лесотехнический университет имени Г.Ф. Морозова», ул. Тимирязева, 8, г. Воронеж, 394087, Россия

В работе проведено исследование влияния оксида графена на регенераты березы пушистой при переносе их в нестерильные тепличные условия (стадия адаптации) при клональном микроразмножении. В ходе эксперимента установлено, что раствор оксида графена в концентрациии 1,5 мкг/л оказывал благоприятное влияние на развитие листьев и адаптируемость растений (+ 8 %). Однако при повышении концентрации наномате-риала до 3 мкг/л выживаемость снижалась на 10 % относительно контроля, высота растений - на 25 %, а число адаптированных растений - на 35 %. Кроме того, общее состояние проростков данной группы оценивалось только на 3 балла по 5-балльной шкале. Исследование содержания оксида графена в органах растений не выявило выраженных очагов скопления, что может говорить об опосредованном действии наноматериала на растения через изменение условий внешней среды, например, доступности корневого питания или состава мик-робиоты в прикорневой зоне. Механизмы эколого-биологического воздействия углеродных наноматериалов на растения до конца не известны и требуют дальнейших углубленных исследований.

Ключевые слова: оксид графена, биологическое воздействие, древесные культуры, ВеМа pubëscens, бионакопление

Благодарности: Проект частично поддержан Министерством науки и высшего образования РФ (проект RFMEFI57417X0159).

Авторы благодарят рецензентов за вклад в экспертную оценку статьи.

Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Для цитирования: Влияние оксида графена на микроклоны березы пушистой на стадии адаптации / Н. С. Стрекалова, О. В. Захарова, П. А. Баранчиков, А. А. Гусев // Лесотехнический журнал. - 2021. - Т. 11. -№ 2 (42). - С. 48-58. - Библиогр.: с. 55-57 (26 назв.). - DOI: https://doi.Org/10.34220/issn.2222-7962/2021.2/5.

Поступила: 12.05.2021 Принята к публикации: 28.06.2021 Опубликована онлайн: 01.07.2021

INFLUENCE OF GRAPHENE OXIDE ON MICROCLONES OF DOWNY BIRCH AT THE ADAPTATION STAGE

Natalia S. Strekalova \kotova-ns@yandex.ru, 0000-0002-6723-3074

Olga V. Zakharova olgazakliaroval@mail.ru, 0000-0001-8590-2529

Peter A. Baranchikov \ petrovi4-98@yandex.ru, 0000-0003-0565-3724

Alexander A Gusev 1,2,4 IS1, nanosecurity@mail.ru, 0000-0002-8699-9112

'Derzhavin Tambov State University, 33, International st, Tambov, 392000, Russian Federation

2National Research Technological University (MISiS), Leninsky Prospect, 4, Moscow, '1999', Russian Federation

3Plekhanov Russian University of Economics, 36, Stremyanny per., Moscow, '17997, Russian Federation

4Voronezh State University of Forestry and Technologies named after G.F. Morozov, 8, Timiryazeva street, Voronezh, 394087, Russian Federation

Abstract

In this work, we studied the effect of graphene oxide on regenerants of downy birch when transferred to nonsterile greenhouse conditions (adaptation stage) during clonal micropropagation. During the experiment, it was found that a solution of graphene oxide at a concentration of 1.5 ^g / l had a beneficial effect on the development of leaves and plant adaptability (+ 8 %). However, with an increase in the concentration of nanomaterial to 3 ^g / L, the survival rate decreased by 10 %, the plant height - by 25 %, and the number of adapted plants - by 35 % relative to the control group. In addition, general condition of the seedlings of this group was assessed only by 3 points on a 5-point scale. The study of the content of graphene oxide in plant organs did not reveal pronounced foci of accumulation, which may indicate an indirect effect of nanomaterial on plants through changes in environmental conditions, for example, the availability of root nutrition or the composition of microbiota in the root zone. The mechanisms of ecological and biological impact of carbon nanomaterials on plants are not fully known and require further in-depth research.

Keywords: graphene oxide, biological effects, woody plantations, Betula pubescens, bioaccumulation

Acknowledgments: The project was partially supported by the Ministry of Science and Education of Russian Federation (project RFMEFI57417X0159).

The authors thank the reviewers for their contribution to the peer review of this work.

Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.

For citation: Strekalova N. S., Zakharova O. V., Baranchikov P. A., Gusev A. A. (2021) Influence of graphene oxide on downy birch microclones at the adaptation stage. Lesotekhnicheskii zhurnal [Forest Engineering journal], Vol. 11, No. 2 (42), pp. 48-58 (in Russian). DOI: https://doi.org/10.34220/issn.2222-7962/2021.2/5.

Received: 12.05.2021 Accepted for publication: 28.06.2021 Published online: 01.07.2021

Введение

Производные графена широко используются в различных областях, включая накопление энергии, наноэлектронные устройства и батареи, биомедицинские приложения, биосенсоры, визуализацию клеток, доставку лекарств и тканевую инжене-

рию [1-3]. Графеноподобные материалы могут служить «строительной платформой» для конструирования различных супрамолекулярных продуктов, которые имеют целый ряд потенциальных практических применений [4].

Оксид графена представляет собой соединение углерода, кислорода и водорода в различных соотношениях, полученное обработкой графита сильными окислителями. Обилие гидрофильных кислородосодержащих групп на поверхности делает его хорошо диспергируемым в полярных растворителях, в частности, в воде [5]. Это делает данный материал очень перспективным для медицинских и биотехнологических приложений, так как, с одной стороны, гидрофильность чешуек оксида графена повышает его биодоступность, а с другой, наличие многочисленных =0, -ОН и -СООН групп на поверхности облегчает функционализацию наномате-риала биоактивными молекулами (антибиотиками, нуклеиновыми кислотами и т.д.).

Перспективным является использование оксида графена в сельском хозяйстве и биотехнологиях для стимуляции роста и защиты растений [6-8].

В то же время имеются работы, показывающие токсическое действие оксида графена по отношению к растениям. Так, Рен с соавторами показали ингибирующее действие наноматериала в концентрации 500 мг/л на проростки кукурузы, сопровождаемое изменением концентрации Са2+, продукцией АФК и перекисным окислением липи-дов [9]. При сравнении эффектов оксида графена и графена, модифицированного амином ^-ЫН2), было обнаружено, что в высоких концентрациях (500, 1000 и 2000 мг/л) оксид графена ингибировал процесс прорастания пшеницы и рост проростков, в то время как такие же дозы G-NH2 оказывали положительное воздействие. Под воздействием оксида графена увеличивалась потеря электролитов корнями, что свидетельствует о фитотоксичности этого типа наноматериала в высоких дозировках [10]. По данным Вочиты и коллег [11], прорастание семян пшеницы подавлялось высокой дозой оксида графена (2000 мг/л), и при этой концентрации также наблюдалось небольшое угнетение удлинения корня. Помимо этого, увеличение числа хромосомных аберраций и митотических аномалий указывает на генотоксические эффекты оксида графена в корневой меристеме пшеницы.

Несмотря на наличие работ по оценке влияния оксида графена на сельскохозяйственные растения, исследований, показывающих воздействие

оксида графена на древесные культуры, играющие важную роль в наземных экосистемах, в открытом доступе не представлено, что обусловливает актуальность настоящего исследования. В представляемой работе показаны результаты исследования по оценке влияния оксида графена на проростки березы пушистой на этапе адаптации к нестерильным условиям теплицы.

Береза является популярным объектом для культивирования, т. к. находит широкое применение в лесовосстановлении и озеленении [12, 13].

Материалы и методы

Получение и исследование наноматериала. Наночастицы оксида графена (GO) были получены методом Хаммерса [14], путем химической эксфолиации графита. Исследование наноматериала проводили с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния на Рамановском микроскопе Thermo DXR (Thermo Scientific, США) с лазером 532 нм при мощности 1 мВт через объектив 100х, сканирующей электронной микроскопии на микроскопе Vega3, Tescan (Чешская Республика) и атомно-силовой микроскопии на приборе AIST-NT (AISTNT, Россия) в полуконтактном режиме с насадками NTMDT AFM.

Биологическое исследование. В работе использовались регенеранты березы пушистой, полученные путем клонального микроразмножения, на этапе их адаптации к условиям теплицы. На этапах введения в культуру, мультипликации и укоренения использовали питательные среды, также содержащие оксид графена в различных концентрациях. Установлено негативное влияние наноматериала на проростки в дозе более 3 мкг/л, в то же время при 1,5 мкг/л отмечены положительные эффекты [15, 16]. В связи с этим на этапе адаптации растений были использованы концентрации наноматериала 1,5 и 3 мкг/л. В эксперименте использовали выровненные растения, имеющие 4-5 листьев и корневую систему длиной не менее 2 см. Проростки высаживали в технологические кассеты (объем ячейки - 155 мл), наполненные увлажненным почвенным субстратом. Субстрат состоял из нейтрального торфа и перлита в соотношении 3:1. Растения культивировались в условиях парника в течение трёх недель при температуре 20-24 °С,

15-часовом фотопериоде, освещённости 4500 Люкс, относительной влажности воздуха 80-90 %. Для создания условий повышенной влажности в парнике применялась туманообразующая установка. Обработку проводили водными растворами оксида графена, полученными разведением исходной суспензии наноматериала дистиллированной водой до нужных концентраций. Обработку проводили в момент высадки и спустя 1,5 недели, путем введения препаратов под корень (100 мл раствора на ячейку). В качестве контролей использовались дистиллированная вода и ростовой стимулятор 2,4-эпибрассинолид, выпускаемый под коммерческим названием «Эпин» (Россия). В ходе исследования проводили учет следующих показателей: количество выживших растений, количество растений, адаптированных к нестерильным условиям, морфометрические параметры побегов (высота растений, число листьев, число увядших листьев, количество дополнительных побегов, состояние по пятибалльной шкале).

Эксперимент проводился в трёхкратной по-вторности, количество растений в каждой из

4 групп («Контроль», «Эпин», «GO 1 мкг/л» и «GO 3 мкг/л») составляло 30, выборки имели независимый характер. Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программы Microsoft Excel 2010 (пакет «Описательная статистика») с применением однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), достоверность различий вычислялась с помощью F-критерия Фишера при

5 %-м уровне значимости.

Анализ накопления оксида графена в растениях. Анализ нанкопления и распределения оксида графена в тканях экспериментальных растений осуществлялся на сканирующих электронных микроскопах Neon 40 и Merlin (Carl Zeiss, Германия) с элементным анализом. Для проведения исследования навеску растительной ткани массой 250 мг растирали в охлажденной ступке в 0,5 мл дистиллированной воды. Полученный гомогенат наносили на подложку и высушивали при комнатной температуре.

Результаты и обсуждение

Результаты анализа образца оксида графена. Исследование методом рамановской спектроскопии подтвердило принадлежность полученного материала к оксиду графена - были зафиксированы основные линии, характерные для данного нанома-териала D (1338 см-1) и G (1590 см-1) [17-19]. Методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что образец имеет пластинчатую структуру без каких-либо других видов частиц кристаллизованной фазы. Анализ образца методом атомно-силовой микроскопии показал, что поперечный размер чешуек варьируется от 0,1 до 3 мкм, в то время как их средняя толщина менее 1 нм. Таким образом, анализ полученного образца оксида гра-фена показал, что материал имеет характерную пластинчатую морфологию с размером отдельных чешуек от 0,1 до 3 мкм и толщиной менее 1 нм.

Влияние оксида графена на проростки березы пушистой. Результаты исследования влияния оксида графена на проростки березы пушистой показали, что оксид графена в концентрации 1,5 мкг/л не оказал достоверного влияния на выживаемость растений, однако при повышении концентрации до

3 мкг/л показатель уменьшался до 10 % относительно контроля (рис. 1). Максимальный показатель выживаемости наблюдался при обработке растений стимулятором роста - +5 %.

Максимальная высота растений наблюдалась в группе, обработанной Эпином - 4,4 см против

4 см в контроле. При 1,5 мкг/л оксида графена значения высоты побегов были на уровне контрольных, а при 3 мгк/л показатель уменьшился на 25 % и составил в среднем 3 см (рис. 2).

Внесение оксида графена в концентрации 1,5 мкг/л благоприятно сказалось на развитии листьев. В этом варианте увеличилось среднее количество листьев на одном растении (+1), а также изменилось соотношение нормальных листьев к увядшим (рис. 3). На 6 развившихся листьев отмечалось 3 увядших, в то время как в контроле из

5 листьев увядало 4. Худшие показатели зафиксированы в варианте 3 мкг/л оксида графена - на 4 листа 4 увядших.

SÜ

= 60 s

ï

Is ?û

V S. = Œ л h« s '

1 5 S - 30 £ Л о

? 20 ?

Й

Ifl

Контроль Control

Элин Epic.

GO 1.5 un i: GO 5 мкг/л GOl.SpigiL Q03|igfL

Рис. 1. Влияние оксида графена на выживаемость

регенерантов березы пушистой Figure 1. Effect of graphene oxide on the survival rate of downy birch regenerated Источник: собственные вычисления авторов Source: own calculations

E ^

2 J

j и

Oft I .J нп/j Cl[')3 uii ti

GO 1.5 црЪ GO 3 ¡¡e/L

Рис. 2. Влияние оксида графена на рост регенерантов березы пушистой Figure 2. Effect of graphene oxide on the growth

of downy birch regenerants Источник: собственные вычисления авторов Source: own calculations

При оценке адапрированности растений к нестерильным условиям также установлено положительное влияние оксида графена в дозе 1,5 мкг/л. Число адаптированных растений составило 60 % (на уровне регулятора роста) при 52 % в контрольном варианте (рис. 4). При повышении концентрации наноматериала число адаптированных растений снизилось на 35 %.

•Увядших -тастьед Withered leave;. Рис. 3. Состояние вегетативных органов

регенерантов березы пушистой Figure 3. The state of the vegetative organs of the downy birch regenerated Источник: собственные вычисления авторов Source: own calculations

Рис. 4. Эффективность адаптации регенерантов березы пушистой Figure 4. The efficiency of adaptation of downy birch regenerated

Источник: собственные вычисления авторов Source: own calculations

Наилучшее состояние растений было в группе, культивируемой с применением стимулятора, худшее состояние отмечено в варианте 3 мкг/л оксида графена (табл. 1). Дополнительных побегов не образовалось ни в одном из вариантов.

Таблица 2

Показатели эффективности адаптации побегов березы пушистой

Table 2

Indicators of adaptation efficiency of downy birch shoots

Вариант | Varaint Число дополнительных побегов, шт. Состояние микроклонов

Number of extra shoots, pcs. по 5-балльной шкале | Condition of microclones on a 5-point scale

Контроль | Control 0 4

Эпин | Epin 0 5

GO 1,5 мкг/л | GO 1.5 ^g/L 0 4

GO 3 мкг/л | GO 3 |ig/L 0 3

Источник: собственные вычисления автор(ов)

Source: own calculations

Таким образом, в ходе эксперимента показано, что раствор оксида графена с концентрацией 1,5 мкг/л оказывал благоприятное влияние на появление листьев и на адаптируемость растений (+8 %). Однако при повышении концентрации на-номатериала до 3 мкг/л выживаемость снизилась на 10 % относительно контроля, высота растений - на 25 %, а число адаптированных растений - на 35 %. Кроме того, общее состояние проростков данной группы оценивалось только на 3 балла. Разнонаправленное действие оксида графена показано и другими авторами. Например, Наир и др. [20] показали, что проростки риса, проросшие в присутствии графена, показали лучшую жизнеспособность и рост по сравнению с необработанными проростками. Точно так же всхожесть семян томатов увеличивалась порошкообразным графеном, возможно, из-за способности графена улучшать поглощение воды через кожуру семян [21]. С другой стороны, в нескольких исследованиях сообщалось, что прорастание семян задерживалось или подавлялось нанесением графена или оксида графена [22]. В другом краткосрочном исследовании графен способствовал значительному удлинению корня, но ингибировал развитие корневых волосков, что может быть связано с индуцированным графеном окислительным стрессом в корнях проростков пшеницы [23].

Анализ накопления оксида графена в растениях. Для электронно-микроскопического исследования были взяты растения, обработанные раство-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ром оксида графена в концентрации 3 мкг/л, а также растения контрольной группы.

Анализ накопления частиц оксида графена в корнях растений березы не выявил частиц нанома-териала (рис. 5).

а) | а) б) | Ь)

Рис. 5. Микрофотографии корня березы: а) контроль, б) группа 3 мкг/л

Figure 5. Micrographs of the birch root: a) control, b) group 3 ^g/L Источник: собственное исследование авторов Source: author's study

Электронно-микроскопическое исследование накопления оксида графена в стеблях березы также показало отсутствие наночастиц (рис. 6).

Для подтверждения результатов электронно-микроскопического исследования бионакопления и более детального анализа содержания углерода в тканях растений было проведено картирование элемента (рис. 7).

a)|a) fi)|b)

Рис. 6. Микрофотографии стебля березы пушистой: а) контроль, б) группа 3 мкг/л Figure 6. Micrographs of the birch stem: a) control, b) group 3 д/L Источник: собственное исследование авторов Source: author's study

I a)

Г Кл1.?

б)|Ъ)

в) I с)

г) |d)

Рис. 7. Распределение углерода в тканях корня и стебля березы пушистой: а) корень растений контрольной группы в) стебель растений контрольной группы, б) корень растений группы

3 мкг/л, г) стебель растений группы 3 мкг/л Figure 7. Distribution of carbon in the tissues of the downy birch root and stem: a) the root of the plants in the control group, b) the root of the plants in the 3 ^g/L group, c) the stem of the plants in the control group, d) the stem of the plants in the 3 ^g/L group Источник: собственное исследование авторов Source: author's study

Как видно из представленных микрофотографий, во всех случаях углерод характеризовался

равномерным распределением по образцу, независимо от обработки растений оксидом графена.

Таким образом, наше исследование показало отсутствие биоаккумуляции оксида графена в побегах березы пушистой. Стоит сказать, что другими авторами показано проникновение наноматериала в растения, например, в проростки гороха [24, 25] или шелуху семян томата [21]. Можно предположить, что отмеченные различия связаны с разным размером чешуек и используемыми концентрациями оксида графена, а также с видовыми особенностями растений.

Выводы (Заключение)

Таким образом, в ходе эксперимента установлено разнонаправленное действие оксида гра-фена на регенеранты березы пушистой. При обработке побегов раствором наноматериала с концентрацией 1,5 мкг/л отмечено благоприятное влияние на развитие листьев и адаптируемость растений. В то же время при повышении концентрации вещества до 3 мкг/л снижалась выживаемость и высота побегов, а также число адаптированных растений. С учетом того, что методом электронной микроскопии не зафиксировано бионакопления наноча-стиц, можно говорить, что отмеченные эффекты не связаны с проникновением наноматериала в ткани растений. Например, группа ученых [26] установила, что графеновые квантовые точки (GQD) могут способствовать поглощению воды и питательных веществ за счет увеличения эффективных площадей поверхности эпидермальных (ризодер-мальных) клеток корня. Разработанная ими схематическая модель показывает, что GQD непосредственно прикрепляются к поверхности клеток корня растений, увеличивая область поглощения ионов на поверхности корня.

Среди возможных механизмов токсического действия оксида графена, не связанных с его проникновением в ткани растений, можно выделить непрямое воздействие через изменение окружающей среды - например, доступности корневого питания или состава микробиоты в прикорневой зоне.

Проведенное исследование, а также результаты работ других авторов свидетельствуют о том, что механизмы воздействия оксида графена на растения требуют дальнейшего изучения. Результаты

нашей работы могут быть использованы в биотех- при переведении их из стерильных лабораторных

нологии клонального микроразмножения растений условий в грунт.

Список литературы

1. Ou L., Song B., Liang H. (et al.) Toxicity of graphene-family nanoparticles: a general review of the origins and mechanisms. Particle and Fibre Toxicology. 2016; 13: 57. DOI: 10.1186/s12989-016-0168-y.

2. Sun Y., Sun M., Xie D. Graphene Electronic Devices. Graphene. Fabrication, haracterizations, Properties and Applications. 2018; 103. DOI: 10.1016/B978-0-12-812651-6.00005-7.

3. Ye M., Zhang Zh., Zhao Y., Qu L. Graphene Platforms for Smart Energy Generation and Storage. Joule. 2018; 2 (2): 245-268. DOI: 10.1016/j.joule.2017.11.011.

4. Zhou J., Chen M., Diao G. Calix[4,6,8]arenesulfonates functionalized reduced graphene oxide with high supramolecular recognition capability: Fabrication and application for enhanced host-guest electrochemical recognition. ACS Applied Materials Interfaces. 2013; 5: 828-836. DOI: 10.1021/am302289v.

5. Dreyer D. R., Park S., Bielawski C. W., Ruoff R. S. The chemistry of graphene oxide. Chemical Society Reviews. 2010; 39 (1): 228-240. DOI: 10.1039/B917103G.

6. Park S., Choi K. S., Kim S., Gwon Y., Kim J. Graphene Oxide-Assisted Promotion of Plant Growthand Stability. Nanomaterials. 2020; 10: 758. DOI: 10.3390/nano10040758.

7. Kabiri Sh., Degryse F., Tran D.N.H. (et al.) Graphene Oxide: A New Carrier for Slow Release of Plant Micronutrients. ACS Applied Materials Interfaces. 2017; 9 (49): 43325-43335. DOI: 10.1021/acsami.7b07890.

8. Wang X., Xie H., Wang Zh., Hea K., Jing D. Graphene oxide as a multifunctional synergist of insecticides against lepidopteran insect. Environmental Science: Nano. 2019; 6: 75-84. DOI: 10.1039/C8EN00902C.

9. Ren W., Chang H., Teng Y. Sulfonated graphene-induced hormesis is mediated through oxidative stress in the roots of maize seedlings. Science of the Total Environment. 2016; 572: 926-934. DOI: 10.1016/j.scitotenv.2016.07.214.

10. Chen J., Yang L., Li S., Ding W. Various Physiological Response to Graphene Oxide and Amine-Functionalized Graphene Oxide in Wheat (Triticum aestivum). Molecules. 2018; 23: 1104. DOI: 10.3390/molecules23051104.

11. Vochita G., Opric L., Gherghel D. (et al.) Graphene oxide effects in early ontogenetic stages of Triticum aestivum L. seedlings. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2019; 181: 345-352. DOI: 10.1016/j.ecoenv.2019.06.026.

12. Попов В. К., Табацкая Т. М., Сиволапов А. И. Регенеранты березы и тополя, полученные in vitro в плантационных культурах под Воронежем. Биотехнология в ФЦП "Интеграция": Тез. докл. 1999: 36-37.

13. Шапкин О. М., Погиба С. П., Казанцева Е. В. Популяционно-генетический анализ карельской берёзы и вегетативное размножение её ценных форм. Лесохозяйственная информация ; ВНИИЦлесресурс. 1996; 9: 4-15.

14. Hummers W. S., Offeman R. E. Preparation of graphitic oxide. Journal of the American Chemical Society. 1958; 1339. DOI: 10.1021/ja01539a017.

15. Zakharova O., Kolesnikova E., Muratov D. S. (et al.) Effects of graphene oxide on white poplar x aspen (Populus alba х Populus tremula) hybrid microsprouts at various growth stages. IOP Conf. Series: Materials Science and Engineering. 2019; 693: 012037. DOI: 10.1088/1757-899X/693/1/012037.

16. Zakharova O., Kolesnikova E., Muratov D., Gusev A. Stimulating and toxic effects of graphene oxide on Betula pubescens microclones. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2020; 595: 012010. DOI: 10.1088/1755-1315/595/1/012010.

17. Muzyka R., Drewniak S., Pustelny T., Chrubasik M., Gryglewicz G. Characterization of Graphite Oxide and Reduced Graphene Oxide Obtained from Different Graphite Precursors and Oxidized by Different Methods Using Raman Spectroscopy. Materials. 2018; 11 (7): 1050. DOI: 10.3390/ma11071050.

18. Oh W-Ch., Zhang F-J. Preparation and characterization of graphene oxide reduced from a mild chemical method. Asian Journal of Chemistry. 2011; 23 (2): 875-879.

19. Rattana, Chaiyakun S., Wititanun N. (et al.) Preparation and characterization of graphene oxide nanosheets. Procedia Engineering. 2012; 32: 759-764. DOI: 10.1016/j.proeng.2012.02.009.

20. Nair R., Mohamed M. S., Gao W. (et al.) Effect of carbon nanomaterials on the germination and growth of rice plants. Journal of nanoscience and nanotechnology. 2012; 12: 2212-2220. DOI: 10.1166/jnn.2012.5775.

21. Zhang M., Gao B., Chen J., Li Y. Effects of graphene on seed germination and seedling growth. Journal of Nanoparticle Research. 2015; 17: 78. DOI: 10.1007/s11051-015-2885-9.

22. Liu S., Wei H., Li Z. (et al.) Effects of graphene on germination and seedling morphology in rice. Journal of nanoscience and nanotechnology. 2015; 15: 2695-2701. DOI: 10.1166/jnn.2015.9254.

23. Zhang P., Zhang R., Fang X. (et al.) Toxic effects of graphene on the growth and nutritional levels of wheat (Triticum aestivum L.): Short-and longterm exposure studies. Journal of hazardous materials. 2016; 317: 543-551. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2016.06.019.

24. Chen L., Wang C., Yang S. (et al.) Chemical reduction of graphene enhances in vivo translocation and photosynthetic inhibition in pea plants. Environmental science. Nano. 2019; 6: 1077-1088. DOI: 10.1039/C8EN01426D.

25. Park S., Kim T., Gwon Y. (et al.) Graphene-Layered Eggshell Membrane as a Flexible and Functional Scaffold for Enhanced Proliferation and Differentiation of Stem Cells. ACS Applied Bio Materials. 2019; 2: 4242-4248. DOI: 10.1021/acsabm.9b00525.

26. Xu Y., Lu Y., Li J., Liu R., Zhu X. Effect of graphene quantum dot size on plant growth. Nanoscale. 2020; 12: 15045-15049. DOI:10.1039/D0NR01913E.

References