CC BY
65
УДК 636.4:615:616-091 А.А. Макеев, А.В. Сахаров, А.Е. Просенко, К.В. Жучаев, Е.И. Рябчикова
ВЛИЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ КИШЕЧНИКА СВИНЕЙ
Выявлено развитие окислительного стресса у свиней в условиях интенсивной технологии содержания, локальным проявлением которого является увеличение содержания продуктов свободнорадикального пере-кисного окисления липидов и депрессия системы антиоксидантной защиты в клетках тонкого и толстого отделов кишечника свиней. Токсичные продукты свободнорадикального перекисного окисления липидов вызывают повреждение и гибель клеток кишечника. Применение антиоксиданта тиофана снижает развитие окислительного стресса и защищает структурные элементы слизистой оболочки кишечника свиней от свободнорадикального повреждения.
Ключевые слова: окислительный стресс, антиоксидант тиофан, кишечник свиней, слизистая оболочка, повреждение, апоптоз.
A.A. Makeyev, A.V. Sakharov, A.Ye. Prosenko, K.V. Zhuchayev, Ye.I. Ryabchikova OXIDATIVE STRESS INFLUENCE ON THE STRUCTURE- FUNCTIONAL ORGANIZATION OF PIG INTESTINE
Oxidative stress development in pigs under intensive technology of maintenance is revealed. The local manifestation of oxidative stress is represented by the level of free-radical peroxide lipids oxidation products increase and depression of antioxidant protection system in the cells of pig small and large intestine. Toxic products of free-radical peroxidate lipids oxidation cause damage and destruction of the intestine cells. Antioxidant thiophan application decreases the development of oxidative stress and protects structural elements of pig intestine mucous membrane from free-radical damage.
Key words: oxidising stress, antioxidant thiophan, pig intestine, mucous membrane, damage, apoptosis.
Современные условия существования животных в условиях крупных промышленных комплексов связаны с воздействием на организм различных стрессовых факторов [2]. Согласно современным представлениям о закономерностях реализации и запуска стресс-реакции, включение механизмов свободнорадикального окисления является одним из наименее изученных звеньев системы адаптации [5]. По мнению Е.Б Мень-щиковой, Н.К. Зенкова, В.В. Абрамченко, усиление свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) и депрессия ферментов антиоксидантной защиты приводят к развитию окислительного стресса (ОС), который в свою очередь приводит к поражению внутренних органов животных. В условиях промышленной технологии содержания животных это состояние длительное время остается клинически не замеченным, и, соответственно, не проводится своевременная профилактика метаболических заболеваний у животных. В конечном итоге, ОС является одним из факторов, сдерживающим развитие свиноводства на промышленной основе.
Влияние ОС на морфофункциональное состояние желудочно-кишечного тракта, а также возможность управления процессами свободнорадикального окисления в организме свиней обуславливает актуальность настоящего исследования.
Цель исследования - изучить влияние окислительного стресса на морфофункциональное состояние слизистой оболочки кишечника поросят и возможность его коррекции антиоксидантом тиофаном.
Материал и методы исследований
У поросят при интенсивной и экстенсивной технологии содержания изучали параметры окислительного стресса в гомогенатах тканей кишечника по содержанию продуктов свободнорадикального перекисного окисления и активности системы антиоксидантной защиты. Возможность коррекции ОС оценивали путем введения в организм поросят фенольного серосодержащего антиоксиданта тиофана. В условиях промышленного комплекса ОАО «Кудряшовское» методом пар-аналогов были сформированы две группы поросят 10-суточного возраста по 30 поросят в каждой. Первую опытную группу составили животные, находившиеся в обычных условиях свинокомплекса. Животные второй опытной группы получали антиоксидант тиофан, который скармливали с 10 - до 31-суточного возраста в дозе 20 мг/кг. Контролем служили животные, содер-
жащиеся в условиях фермерского хозяйства «Петраков» Купинского района Новосибирской области. Поросята контрольной и опытных групп находились на однотипном стандартном рационе. Опытный период длился 21 сутки.
Содержание высокотоксичных продуктов СПОЛ изучали в гомогенатах тканей слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника. Уровень малонового диальдегда ^ДА) определяли в реакции с 3-хлоруксусной и тиобарбитуровой кислотами в присутствии ионов меди [6]; содержание диеновых конъюгатов (ДК) выявляли реакцией с гептан-изопропаноловой смесью [7]. Активность ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД) регистрировали по степени ингибирования хемилюминесценции в растворе с ксантиноксидазой [8]; активность каталазы (КАТ) определяли реакцией разложения перекиси водорода с добавлением молибдата аммония [4]. Содержание неферментативного антиоксиданта - восстановленного глутатиона (ВГ) - оценивали при постановке реакции с аллоксаном [В].
Mатериалом для проведения морфологического и гистохимического анализов служили фрагменты тощей кишки и дистального отдела толстого кишечника. Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Кислые гликозаминогликаны (ГАГ) выявляли альциановым синим по Стидмену. Распределение гликогена и гликопротеидов определяли ШИК-реакцией по Mак-Mанусу с постановкой соответствующих контролей. В исследуемых образцах тонкого и толстого кишечника определяли морфометрические показатели - высоту ворсин, глубину залегания крипт, а также площадь собственной пластинки ворсин и крипт.
Экспрессию эпителиальными клетками кишечника апоптотических, антиапоптотических белков р 53 и Bcl-2 определяли иммуногистохимически с использованием вторичных антител.
Результаты исследований
Результаты биохимического анализа образцов кишечника поросят 1 -й опытной группы показали увеличение содержания в гомогенатах тощей кишки ДК на 37,19%, а MДА на 46,48% (р<0,05), по сравнению с соответствующими образцами поросят контрольной группы. В гомогенатах толстого отдела кишечника поросят 1-й опытной группы регистрировалось превышение содержание ДК на 49,14, а M^ на 50,14% (р<0,05) по сравнению с аналогичными показателями поросят контрольной группы. Полученные результаты свидетельствуют, что у поросят в условиях промышленной технологии содержания в слизистой оболочке кишечника определяется повышенное содержание высокотоксичных продуктов СПОЛ.
Исследование образцов кишечника поросят 1-й опытной группы на активность ферментов антиоксидантной защиты показало снижение в гомогенатах тощей кишки сОд на 48,72 % (р<0,05), а в тканях толстого отдела кишечника на 50,04 % (р<0,05) по сравнению с соответствующими образцами поросят контрольной группы. Та же закономерность была обнаружена для каталазы. В гомогенатах тонкого и толстого отделов кишечника отмечалось снижение активности данного фермента по сравнению с аналогичными показателями контрольных животных на 47,86 и 52,02% (р<0,05) соответственно. Одним из представителей неферментативного звена системы антиоксидантной защиты клеток является восстановленный глутатион. В исследуемых образцах тощей кишки поросят 1-й опытной группы установлено снижение активности ВГ на 38,22% (р<0,05), а в образцах дистального отдела толстого кишечника на 56,16% (р<0,05) по сравнению с соответствующими показателями поросят контрольной группы.
Полученные результаты позволяют рассматривать повышенное содержание продуктов СПОЛ и депрессию системы антиоксидантной защиты в тканях кишечника у животных на промышленном комплексе как локальное проявлением общего ОС.
Возможность коррекции процессов СПОЛ в кишечнике изучали на поросятах 2-й опытной группы. В гомогенатах тканей тонкого и толстого отделов кишечника поросят, получавших тиофан, содержание продуктов СПОЛ и активность ферментативного и неферментативного звеньев системы антиоксидантной защиты не имели статистически достоверных различий с аналогичными показателями контрольных животных. Полученные результаты биохимического анализа позволяют обоснованно заключить: в условиях промышленной технологии содержания применение антиоксиданта тиофана нормализует показатели ОС в тканях толстого и тонкого отделов кишечника поросят.
Влияние токсичных продуктов СПОЛ на слизистую оболочку тонкого и толстого отделов кишечника поросят изучали методами морфогистохимического анализа. При исследовании образцов тощей и дистального отдела толстой кишки поросят 1-й опытной группы наиболее выраженные изменения были обнаружены в слизистой оболочке толстого отдела кишечника. Для клеток эпителия тонкого и толстого отделов кишечника характерно отсутствие полярности строения. Ядра энтероцитов и колоноцитов содержат большое количе-
ство гетерохроматина. В их цитоплазме определяются многочисленные мелкие и крупные вакуоли, заполненные бесструктурным интенсивно оксифильным веществом. В области щеточной каемки колоноцитов, в отличие от контрольных образцов, реакция на гликопротеиды слабо выражена, а реакция на кислые ГАГ - отрицательная. При постановке ШИК-реакции в цитоплазме определяются вакуоли, содержимое которых проявляет интенсивную положительную реакцию на гликопротеиды. Гликоген гистохимически не определяется.
Изменение тинкториальных свойств клеток в области щеточной каемки, наличие в цитоплазме вакуолей, заполненных гликозилированными белками, а также отрицательная реакция на гликоген свидетельствуют о нарушении и белково-углеводного и энергетического обмена.
Результаты иммунохимического анализа показали, что у поросят 1-й опытной группы гибель клеток эпителия слизистой оболочки кишечника путем апоптоза в большей степени затрагивает колоноциты дистального отдела толстой кишки по сравнению с энтероцитами тощей кишки. У поросят 1-й опытной группы экспрессия апоптотического белка гена р 53 в колоноцитах крипт на 56,03% (р<0,05) превышает соответствующий показатель поросят контрольной групп. Экспрессия белка гена Bcl-2 статистически достоверно снижена на 47,98% (р<0,05), по сравнению с контрольными образцами.
Развитие деструктивных процессов в колоноцитах и их высокая гибель сочетались с изменением структуры крипт. Данные морфометрии показали, что увеличение глубины залегания крипт в исследуемых образцах тканей поросят 1 -й опытной группы по сравнению с контролем происходит за счет увеличения количества клеток на единицу площади. Усиленная пролиферация низкодифференцированных клеток в стволовых компартментах крипт может рассматриваться в качестве ответной реакции на свободнорадикальное повреждение эпителиальных клеток кишки при ОС. Можно полагать, что в условиях хронического ОС нагрузка на структурные элементы кишечника с течением времени может привести к истощению пролиферативного потенциала клеток эпителия.
У поросят, получавших антиоксидант тиофан, структура эпителия слизистой оболочки не имела выраженных морфологических различий с контрольными образцами. В эпителии отсутствовали клетки с признаками деструкции. При постановке гистохимической реакции на суммарные ГАГ и гликопротеиды апикальная поверхность колоноцитов характеризовалась интенсивной альциан- и шик-позитивной реакцией. Введение в корм поросятам 2-й опытной группы тиофана позволило снизить гибель колоноцитов крипт путем апоптоза на 55,36 % (р<0,05) по сравнению с аналогичными образцами поросят 1 опытной группы. Результаты морфометрического анализа показали, что у поросят, получавших тиофан, глубина залегания крипт не имела достоверных различий от образцов животных контрольной группы.
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что в условиях промышленной технологии содержания у животных развивается окислительный стресс, локальным проявлением которого является нарушение структурно-функциональной организации тонкого и толстого отделов кишечника и высокая гибель эпителиальных клеток. Цитотоксическое повреждение продуктами СПОЛ и гибель клеток при ОС наиболее выражены в эпителии толстого отдела кишечника и корректируются антиоксидантом тиофаном.
Выводы
1. Повышенное содержание продуктов СПОЛ и депрессия системы антиоксидантной защиты в тканях кишечника у животных в условиях промышленного содержания является локальным проявлением общего ОС.
2. Локальным проявлением ОС является нарушение структурно-функциональной организации тонкого и толстого отделов кишечника и высокая гибель эпителиальных клеток путем апоптоза.
3. Применение антиоксиданта тиофана в условиях промышленной технологии содержания нормализует показатели ОС в тканях толстого и тонкого отделов кишечника поросят и оказывает протективный эффект на клетки эпителия слизистой оболочки кишечника поросят.
Литература
1. Абрамченко, В.В. Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве / В.В. Абрамченко. - СПб.: ДЕАН,
2001. - 400 с.
2. Гуськов, А.Н. Влияние стресс-фактора на состояние сельскохозяйственных животных / А.Н. Гуськов. -
М.: Агропромиздат, 1994. - 91с.
3. Зенков, Н.К. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты / Н.К. Зенков,
В.З. Ланкин, Е.Б. Меньшикова. - М.: Наука, 2001. - 340 с.
4. Королюк, М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк // Лаборатор. дело. - 1988. -№1. - С.16-19.
5. Меньщикова, Е.Б. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания / Е.Б. Меньшикова [и др.]. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
6. Определение резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови: метод. рекомендации / сост. Ю.И. Разина, М.И. Душкин. - Новосибирск, 1998. - 11с.
7. Стальная, И.Д. Современные методы в биохимии / И.Д. Стальная. - М.: Медицина, 1977. - 391 с.
8. Laihia, J.K. Lucigenin and linoleate enhanced chemiluminescent assay for superoxide dismutase activity / J.K. Laihia, C.T. Jansen, M. Ahotupa// Free Radic. Biol. Med.- 1993.- Vol. 14.- P. 457-461.
'--------♦------------
