CC BY
22
УДК 612.821+615.214
ВЛИЯНИЕ ОДНОКРАТНОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ ЭКЗОРФИНА С НА ПОВЕДЕНИЕ И ОБУЧЕНИЕ ДЕТЕНЫШЕЙ БЕЛЫХ КРЫС
Ю.А. Беляева, В.А. Дубынин, И.С. Стоволосов, Ю.В. Добрякова, Ж.Д. Беспалова*, А.А. Каменский
(кафедра физиологии человека и животных; e-mail: dva-msu@yandex.ru)
Оценка поведения детенышей белых крыс проводилась в "открытом поле" (возраст 21 и 35 дней), а также при обучении в лабиринте с пищевым подкреплением (возраст 36—41 день). Опиоидный фрагмент глютена пшеницы экзорфин С (YPISL) вводился хронически с 1-го по 14-й день жизни либо непосредственно перед тестированием. Показано, что однократная инъекция пептида не вызывает явных изменений поведения животных. Хроническое введение той же дозы препарата (5 мг/кг, в/б) достоверно усиливает исследовательскую активность, снижает тревожность, а также улучшает процессы обучения. Отставленные эффекты экзорфина С более выражены в случае самок.
Ключевые слова: экзорфин С, поведение, детеныши белых крыс.
Показано, что пептидные молекулы, полученные при энзиматическом гидролизе пищевых белков, могут обладать биологической активностью. Некоторые из них характеризуются опиоидными свойствами и, поскольку поступают в организм извне, по аналогии с эндорфинами нервной системы названы "экзорфины" (ТезсИетаИег, 2003). К этой группе относят пептиды, выделенные из гидроли-затов пшеничного глютена (экзорфины А, В и С) и казеинов молока (казоморфины). Сюда же примыкают фрагменты, образующиеся в ходе переваривания гемоглобина (геморфины), цитохрома С (цитохрофины) и ряда других белков.
Анализ литературы показывает, что данные о функциональных характеристиках экзорфинов (за исключением, пожалуй, казоморфинов) отрывочны и фрагментарны (Дубынин и др., 2004). В частности, проблема их влияния на ЦНС и поведение детенышей млекопитающих остается практически неизученной. Между тем она весьма актуальна, что обусловлено способностью компонентов питания, получаемого новорожденными, воздействовать на созревание и становление функций мозга.
Основной целью представленной работы стало изучение влияния острого и хронического введения экзорфина С на поведение и обучение детенышей белых крыс. Доза пептида, использованная в опытах (5 мг/кг), была выбрана на основе наших предыдущих исследований (Дубынин и др., 1998). Процедуры острого и хронического введения экзорфинов моделируют поступление пептидов пищевого происхождения в организм млекопи-
тающего в раннем постнатальном периоде. Следовательно, практическая значимость нашего исследования связана с оценкой роли различных белковых компонентов смесей (заменителей материнского молока), используемых для питания новорожденных.
Объекты и методы
Исследования проводились на животных, выращенных в виварии кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. День родов принимали за нулевой день их жизни. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и пище по одному выводку в клетке. Каждый выводок разделяли на равные по величине опытную и контрольную группы; число самцов и самок в группах также было примерно равным. Опытным детенышам внутрибрю-шинно вводили пептид в водном растворе (5 мг/кг, 1 мл/кг); контрольным — инъецировали эквивалентные объемы растворителя. Острое введение препарата подразумевало внутрибрюшинную инъекцию в день эксперимента за 10 мин до тестирования животного, хроническое — внутрибрю-шинную инъекцию в 1—14-е дни постнатального развития животных (один раз в сутки). Использованный в экспериментах экзорфин С (УРКЬ) был синтезирован в Российском кардиологическом центре РКНПК МЗ РФ под руководством Ж.Д. Беспаловой.
Уровень тревожности и исследовательской активности оценивали в тесте "открытое поле" (воз-
* Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, г. Москва.
раст 21 день и 35 дней). Обучение с положительным пищевым подкреплением проводили с 36-го по 41-й дни жизни.
Использованное нами "открытое поле" представляет собой круглую арену диаметром 80 см с деревянным полом, расчерченным восемью диаметрами и двумя концентрическими окружностями, находящимися на равном расстоянии друг от друга; высота стенки 40 см. При тестировании животное помещали в центр арены. Затем поминутно визуально регистрировались следующие показатели: горизонтальная двигательную активность (пробег; по числу пройденных сегментов), вертикальная двигательная активность (количество стоек), груминг, отходы от стенки арены и выходы в ее центр (по числу радиальных перемещений с пересечением внешней и внутренней окружностей соответственно). Над ареной на высоте 80 см находились обычная лампа накаливания (200 Вт) и красная лампа (15 Вт). Процедура тестирования была основана на методе, предложенном В.И. Родиной с соавт. (1993) и предполагающем оценку поведения в течение 5 мин. При этом 1—3 мин был включен яркий свет, затем на 1 мин включали красную лампу, после чего восстанавливали исходный уровень освещенности.
Выработку условной пищедобывательной реакции на место проводили в так называемом "сложном лабиринте" в возрасте 36—41 день. Сложный лабиринт представляет собой квадратную камеру (60 х 60 х 25 см), разделенную пятью прозрачными перегородками на шесть коридоров (рис. 1, а). В каждой перегородке имеется прямоугольное отверстие. За сутки до начала эксперимента проводилась адаптация крыс к условиям эксперимента. При этом их на 15 мин помещали в лабиринт с равномерно разбросанными по отсекам кусочками хлеба с целью угашения избыточной исследовательской реакции и снижения тревожности, а также формирования первичной ассоциации между условиями эксперимента и получением пищевого под-
Рис. 1. Схема сложного лабиринта: а — исходное положение перегородок; б — перегородки зеркально повернуты (модификация, использованная при переучивании).
Обозначения: овал — исходное положение крысы; квадрат — положение пищевого подкрепления; прерывистая линия — оптимальная траектория движения
крепления. В последующие 4 дня животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3 мин. В качестве подкрепления использовались хлебные шарики.
В процессе обучения крысу переносили в стартовый отсек (ближайший к экспериментатору коридор), после чего визуально регистрировали время реакции (латентный период взятия подкрепления); число выполненных реакций (число случаев, когда животное находило подкрепление в течение 3 мин пребывания в лабиринте); количество ошибок (число отклонений от оптимальной траектории движения, когда крыса после прохода очередного отверстия в перегородке сворачивает в "неверную" сторону), количество возвратов. Также регистрировалось количество стоек и актов груминга. После 4 дней обучения крыс переучивали в течение 2 дней в условиях лабиринта с зеркально повернутыми перегородками (рис. 1, б). В дни обучения и переучивания животных кормили один раз в сутки непосредственно после эксперимента.
При обработке результатов использовали стандартный пакет статистических программ STATISTICA. Вычисляли средние (AM), ошибки средних (SEM), дисперсии и стандартные отклонения (SD) массивов данных. При сравнении средних и формы распределений применялись параметрический критерий Стьюдента и непараметрические критерии (Ман-на—Уитни, X2, точный Фишера).
Результаты и обсуждение
Для определения уровня тревожности и исследовательской активности животных применялся тест "открытое поле". Показано, что в возрасте 21 день достоверные отличия между контрольными крысами (n = 33) и животными, которым однократно вводился экзорфин С (n = 31), отсутствовали. Также отсутствовали и половые различия в реакции детенышей на инъекцию препарата.
Напротив, в серии с хроническим введением нами выявлены значимые расхождения в поведении опытных групп в сравнении с контролем. В более яркой форме они проявились в случае самок; направленность изменений можно оценить как анксиоли-тическую, приводящую к росту исследовательской активности. На разных минутах тестирования в "открытом поле" у самок опытной группы был значимо увеличен уровень пробега (рис. 2, а), количество стоек (рис. 3, а), число отходов от стенки арены и выходов в ее центр. Общее число отходов от стенки арены за все 5 мин тестирования в контроле составило 1,4 ± 0,5;
Рис. 2. Изменение горизонтальной двигательной активности (пробега) экспериментальных животных (возраст 21 день) в "открытом поле" со сменой освещенности: а — самки; б — самцы. По горизонтали — минуты тестирования; по вертикали — условные единицы пробега.
Обозначения: сплошная линия — контроль (самки: n = 14, самцы: n = 21); прерывистая линия — опытная группа, получившая в 1—14 дни жизни инъекции экзорфина С (самки: n = 16, самцы: n = 20). Значимые отличия от контроля отмечены звездочкой (p < 0,05)
в опытной группе 4,2 ±1,2 (AM ± SEM; p < 0,05 по критерию Стьюдента). В случае выходов в центр арены достоверные отличия наблюдались на 3—5-й мин эксперимента (2,0 ± 0,7 в получившей пептид группе; 0,4 ± 0,2 в контроле; p < 0,05). Пробег и количество стоек, совершенных самцами опытной группы, от контроля не отличались (рис. 2, б; 3, б). Однако число отходов от стенки арены и выходов в ее центр проявили заметную тенденцию к снижению в случае детенышей, получавших инъекции экзорфина С (p = 0,06—0,09).
При изучении последствий острого введения экзорфина С в возрасте 35 дней какие-либо отличия опытной и контрольной групп, а также половые различия вновь отсутствовали. При повторном помещении в "открытое поле" самок, получивших хронические инъекции пептида, обнаружено почти полное исчезновение выявленных ранее (в возрасте 21 день) эффектов. Пробег и количество стоек в опытных и контрольных группах практически совпадали. Значимого уровня достигло лишь различие в числе отходов от стенки арены на 1 мин
тестирования (0,7 ± 0,2 в опытной группе; 0,1 ± 0,1 в контроле; р < 0,05). В случае самцов тенденция к повышению тревожности сменилась на признаки ее снижения: число отходов от стенки арены на 5 мин тестирования в опытной группе составило 0,5 ± 0,2; в контроле 0,1 ± 0,1 (р < 0,05).
Анализ результатов обучения и переучивания в сложном лабиринте (возраст животных 36—41 день; острое введение экзорфина С) выявил минимальные различия между опытной и контрольной группами. Единственным достоверным эффектом, свидетельствующим о некотором улучшении выработки навыка у получивших пептид животных, оказалось увеличение доли относительно хорошо обучившихся детенышей во второй день эксперимента. В опытной группе почти все крысы (41 из 42) выполнили не менее 3 реакций взятия подкрепления; в контроле таковых оказалось 32 из 40 (р < 0,02 по точному критерию Фишера).
При тестировании в сложном лабиринте животных, получивших хронические инъекции экзорфи-на С в 1—14 дни жизни, выявлено более выраженное улучшение обучения по сравнению с контролем. В первую очередь (рис. 4, а) следует отметить рост числа выполненных реакций на начальной стадии эксперимента: в первый день выработки навыка в опытной группе 35 крыс из 40 находили подкрепление не менее 2 раз, в контроле — 26 из 38
Рис. 3. Изменение вертикальной двигательной активности экспериментальных животных (возраст 21 день) в "открытом поле" со сменой освещенности: а — самки; б — самцы.
По горизонтали — минуты тестирования; по вертикали — количество стоек. Обозначения те же, что и на рис. 2
Рис. 4. Число выполненных реакций (а) и латентный период взятия пищевого подкрепления (б) у детенышей белых крыс при обучении в сложном лабиринте.
По горизонтали — дни обучения; по вертикали: а — число реакций; б — сек.
Обозначения: темные столбики — контроль; светлые столбики — опытная группа (хронические инъекции экзорфина С). Значимые отличия от контроля отмечены звездочкой (р < 0,05; пояснения см. в тексте)
(р < 0,05 по критерию %2); во второй день 38 крыс из 40 в опытной группе совершили не менее 4 реакций взятия подкрепления, в контроле — 30 из 38 (р < 0,05 по критерию %2). В данном случае изменения в подгруппах самцов и самок были одно-направлены, хотя и сохраняли у самок несколько большую выраженность. Время взятия подкрепления в опытной группе было снижено (рис. 4, б). Этот эффект достиг уровня значимости у самцов и самок при первом помещении в лабиринт в первый день опыта, а также у самок при третьем помещении в лабиринт во второй день опыта. При переучивании каких-либо однонаправленных изменений исследованных показателей в сторону увеличения либо снижения скорости переделки навыка не выявлено.
Можно заключить, что острое введение экзорфина С не привело к заметным изменениям поведения детенышей белых крыс; использованная доза (5 мг/кг) оказалась практически неэффективна во всех возрастных группах. Интересно сопоставить данный вывод с результатами экспериментов, проведенных на половозрелых животных (Дубынин и др., 1998). Показано, что в дозе 20 мг/кг экзор-фин С воздействует на болевую чувствительность самцов белых крыс, вызывая некоторую гипераль-гезию; к ослаблению выраженности различных компонентов поведения в "открытом поле" со сменой
освещения приводит введение доз 5 и 20 мг/кг. В целом наблюдались эффекты, характерные скорее для антагониста эндогенных опиоидов, в чем определенную роль сыграло, видимо, сходство первичной структуры экзорфина С и тетрапептида PPIS — фрагмента кортиколиберина, обладающего доказанными анксиогенными и проконвульсантными свойствами (Nomizu, Miyamoto, 1989). Судя по данным литературы, в случае одного из фрагментов глюте-на экзорфина А5 (GYYPT) выявлена более типичная для опиоидов анксиолитическая активность: пептид ослаблял стресс-вызванную анальгезию в дозах 100 и 300 мг/кг (Takahashi et al., 2000). Способность снижать тревожность детенышей белых крыс является хорошо доказанным свойством р-ка-зоморфинов (Дубынин и др., 2004); она значимо проявляется начиная с возраста 28 дней (доза 5 мг/кг).
Отсутствие изменений поведения после однократной инъекции экзорфина С детенышам крыс связано, скорее всего, с относительной незрелостью опиоидной системы их мозга, а также малой (в сравнении с фрагментами казеинов) устойчивостью последовательности YPISL к ферментативной деградации. С учетом этого особый интерес представляют изложенные выше последствия хронического введения, наличие которых доказывает, что в первые дни жизни действие экзорфина С реализуется через особые типы рецепторов, воспринимающих опиоиды как факторы роста (Zagon et al., 2000). Ранее сходные результаты получены для р-ка-зоморфина-7, после применения которого в раннем постнатальном периоде отличия в поведении опытных и контрольных групп оставались значимы в течение двух и более месяцев (Malinovskaya et al., 2000; Дубынин и др., 2000). Общая направленность эффектов совпадает с выявленной для экзорфина С (снижение тревожности, улучшение обучения в сложном лабиринте), однако они более длительны и ярче выражены в подгруппе самцов. В случае экзорфина С достоверные изменения обнаружены в основном в подгруппе самок. В качестве вероятного объяснения подобного расхождения можно указать на различия в первичной структуре опиоидных фрагментов р-казеина и глютена, а также на относительную ц-селективность первых и 8-селективность вторых (Fukudome, Yoshikawa, 1993; Fukudome et al., 1997).
В возрасте 35 дней хроническое применение экзорфина С уже не сказывается на поведении крыс в "открытом поле", однако выработка у них пи-щедобывательного навыка достоверно ускоряется. Это в очередной раз свидетельствует о том, что скорость и качество обучения отличаются повышенной чувствительностью к действию нейротропных соединений. Данные предыдущих экспериментов с р-казоморфинами позволяют утверждать, что уве-
личение под влиянием опиоидного фрагмента глю-тена числа выполненных реакций и сокращение времени нахождения подкрепления может быть следствием ослабления тревожности экспериментальных животных (Маклакова и др., 1995).
В литературе нередко обсуждаются гипотезы о неблагоприятном действии экзорфинов на созревание и функции нервной системы — вплоть до облегчения развития аутизма и синдрома внезапной остановки дыхания (Ramabadran, Bansmath, 1988; Leboyer et al., 1993). Однако получаемые нами на протяжении последних лет результаты не дают оснований говорить о каких-либо явных негативных последствиях острого и особенно хронического введения опиоидных фрагментов пищевых белков в раннем постнатальном периоде. Напротив, в большинстве случаев обнаруживаются рост ис-
следовательской активности и скорости обучения, снижение оборонительной мотивации. Это в свою очередь указывает на способность экзорфинов (как компонентов питания) снижать значимость стрес-согенных факторов и тем самым облегчать адаптацию новорожденных к условиям окружающей среды. У взрослых млекопитающих по мере созревания гематоэнцефалического и прочих барьеров организма данная функция экзорфинов, по-видимому, ослабевает.
* * *
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 05—04—49761) и Программой фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Дубынин В.А., Асмакова Л.С., Соха-ненкова Н.Ю., Беспалова Ж.Д., Незави-батько В.Н., Каменский А.А. 1998. Сравнительный анализ нейротропной активности экзорфинов — производных пищевых белков // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 125. № 2. 153—157.
Дубынин В.А., Земская Н.Ю., И в л е -ва Ю.А., Каменский А.А., Шестакова С.В., Малиновская И.В., Гончаренко Е.Н., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф. 1999. Отставленные нейротропные эффекты р-казоморфина-7, хронически вводимого новорожденным белым крысам // Докл. РАН. 364. № 6. 839—842.
Дубынин В.А., Ивлева Ю.А., Каменский А. А. 2004. Нейротропная активность опиоидных пептидов пищевого происхождения р-казоморфинов // Усп. физиол. наук. 35. № 1. 83—101.
Дубынин В.А., Малиновская И.В., Ивлева Ю.А., Андреева Л.А., Каменский А.А., Ашмарин И.П. 2000. Зависимость отставленных поведенческих эффектов р-казоморфина-7 от возраста и пола детенышей белых крыс // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 130. № 11. 488—492.
М а к л а к о в а А . С ., Назаренко И.В., Дубынин В.А., Незавибатько В.Н., Алфе-ева Л.А., Каменский А.А. 1995. Влияние р-ка-зоморфина-7 на уровень пищевой и оборонительной мотиваций при различных видах обучения // Журн. ВНД им. И.П. Павлова. 45. № 6. 1143—1150.
Родина В.И., Крупина Н.А., Крыжа-новский Г.Н., Окнина Н.Б. 1993. Мультипа-раметрический метод комплексной оценки тревожно-фо-бического состояния крыс // Журн. ВНД им. И.П. Павлова. 43. № 5. 1006—1017.
Fukudome S., Jinsmaa Y., Matsukawa T., Sasaki R., Yoshikawa M. 1997. Release of opioid peptides, gluten exorphins by the action of pancreatic elas-tase // FEBS Lett. 412. N 3. 475-479.
Fukudome S., Yoshikawa M. 1993. Gluten exorphin C. A novel opioid peptide derived from wheat gluten // FEBS Lett. 316. N 1. 17-19.
Leboyer M., Bouvard M.P., Launay J.M. 1993. Opiate hypothesis in infantile autism? Therapeutic trials with naltrexone // Encephale. 19. N 2. 95—102.
Malinovskaia I.V., Dubynin V.A., Ivle -va Yu.A., Andreeva L.A., Kamenskii A.A. 2000. The delayed influence of p-casomorphin-7 (YPFPGPI) on albino rat's learning ability // Regul. Peptides. 89. N 1—3. 73.
Nomizu M., Miyamoto M. 1989. Convulsant peptides related to corticotropin-releasing factor (CRF) // Brain Res. 505. N 2. 326—328.
Ramabadran K., Bansinath M. 1988. Opioid peptides from milk as a possible cause of sudden infant death syndrome // Med. Hypotheses. 27. N 3. 181—187.
Takahashi M., Fukunaga H., Kaneto H., Fukudome S., Yoshikawa M. 2000. Behavioral and pharmacological studies on gluten exorphin A5, a newly isolated bioactive food protein fragment, in mice // Jpn. J. Pharmacol. 84. N 3. 259—265.
Teschemacher H. 2003. Opioid receptor ligands derived from food proteins // Curr. Pharm. Des. 9. N 16. 1331—1344.
Zagon I.S., Verderame M.F., Allen S.S., McLaughlin P.J. 2000. Cloning, sequencing, chromosomal location, and function of cDNAs encoding an opioid growth factor receptor (OGFr) in humans // Brain Res. 856. N 1—2. 75—83.
Поступила в редакцию 25.12.07
INFLUENCE OF ACUTE AND CHRONIC ADMINISTRATION OF EXORPHIN C
ON BEHAVIOR AND LEARNING ABILITY OF WHITE RAT PUPS
Yu.A. Belyaeva, V.A. Dubynin, I.S. Stovolosov,
Yu.V. Dobryakova, J.D. Bespalova, A.A. Kamenskii
Monitoring of white rat pups behavior was hold in "open field" (21 days old) and in maze with food reinforcement (36—41 days old). Opioid fragment of wheat gluten exorphin C was injected acute (10 min before testing) and chronically (1—14 days after birth). As shown, acute administration didn't provide pronounced influence on rat's behavior. In chronic series same peptide dose (5 mg/kg, i/p) increased orientative-trying activity, learning ability and decreased anxiety. Delayed effects of exorphin C were more expressed in female groups.
Key words: exorphin C, behavior, white rat pups.
Сведения об авторах
Беляева Юлия Андреевна — аспирантка кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. 939-28-95; e-mail: skitanic@mail.ru
Дубинин Вячеслав Альбертович — докт. биол. наук, ст. науч. сотр., проф. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. 939-28-95; e-mail: dva-msu@yandex.ru
Стоволосов Игорь Сергеевич — аспирант кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. 939-28-95; e-mail: istovolosov@yandex.ru
Добрякова Юлия Владимировна — аспирантка кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. 939-28-95; e-mail: julkadobr@gmail.com
Беспалова Жанна Дмитриевна — канд. хим. наук, зав. лабораторией. Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий. Тел. 149-03-11; e-mail: dva-msu@yandex.ru Каменский Андрей Александрович — докт. биол. наук, проф., зав. кафедрой физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. 939-28-95; e-mail: dva-msu@yandex.ru
