CC BY
10УДК 612.332.74.014.46
В.Е.Жуков, И.П.Скалич*
ВЛИЯНИЕ ОДНОКРАТНОГО ДЕЙСТВИЯ Т-2-ТОКСИНА НА ВСАСЫВАНИЕ АМИНОКИСЛОТ В ТОНКОМ КИШЕЧНИКЕ БЕЛЫХ БЕСПОРОДНЫХ КРЫС
ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии»
ФМБА, Волгоград
Т-2 токсин в различных дозах оказывал стимулирующий эффект на всасывание в тонком кишечнике крыс-самцов глицина, глицил-Ь-лейцина и глицил-Ь-валина, как через апикальную, так и базолатеральную мембраны кишечной клетки. Интенсивность трансмембранного переноса зависела от уровня воздействия Т-2 токсина.
Ключевые слова: Т-2-токсин, глицин, энтероцит, апикальная и базолатеральная мембраны.
Введение. Т-2 токсин относится к вторичным метаболитам грибов рода Fusarium — контами-нантам зерновых, способных поражать продовольствие на всех этапах его производства, переработки и хранения [5, 12, 13, 15].
Известно, что в основе механизма токсического действия Т-2-токсина лежит его способ -ность ингибировать синтез белка и повреждать структуру и функции мембран клеток [7, 8, 17, 18, 19, 21]. При этом независимо от пути поступления Т-2-токсина в организм основными мишенями токсического действия являются иммунная система, органы кроветворения, желудочно-кишечный тракт, центральная нервная система [3, 7, 17, 21, 23, 25, 26].
Анализ имеющихся информационных материалов выявил лишь отдельные работы, посвященные изучению влияния Т-2-токсина на процессы ассимиляции пищи. В частности, есть данные о снижение уровня усвояемости тонким кишечником триптофана, глюкозы, однако авторами оценивался только начальный этап всасывания — гидролиз и транспорт через апикальную мембрану энтероцита [26].
Преобладающими продуктами переваривания белков являются пептиды. При этом гидролиз того или иного пептида осуществляется в месте локализации соответствующей пептидазы, а перенос продуктов деструкции белков через мембрану энтероцита осуществляется как диффузионно, так и с помощью систем активного переноса [9, 10, 15, 20, 22]. В кровь белки поступают исключительно в виде аминокислот. Препарат «вывернутый отрезок» («ВО») позволяет оценивать как перенос нутриента через апикальную мембрану энтероцита, так и через базолате-ральную, т. е. дает возможность охарактеризовать процесс всасывания полностью.
* — фрагмент диссертационной работы
Материалы и методы исследования. Определение токсикометрических параметров исследуемого образца Т-2-токсина осуществляли в опытах на белых половозрелых крысах-самцах. Вещество вводили в желудок с помощью металлического зонда в виде водно-спиртового раствора. Соотношение спирта и воды составило 1:20. Т-2-токсин применяли в дозах 1, 2, 3 и 8 мг/кг.
При изучении процессов всасывания пептидов декапитацию подопытных крыс осуществляли через сутки после воздействия вещества. После применения Т-2 токсина подопытные особи, в том числе и контрольные, имели доступ только к воде.
Исследование функций всасывания пептидов проводили с помощью препарата «ВО», который приготовляли из проксимальной части тонкого кишечника [16]. В качестве субстратов использовали 10 мМ растворы глицина, глицил-Ь-лейцина и глицил-Ь-валина, приготовленные на растворе Рингера, инкубацию препаратов проводили в течение 30 мин при анаэробных условиях.
Количество глицина в ткани и в серозной полости препарата определяли с помощью биохимической методики Александровича в модификации А.М.Уголева [16]. Количество белка и белковых фракций в сыворотке крови определяли по соответствующим методикам [6].
Показатели острой токсичности рассчитывали методом пробит-анализа по Миллеру и Тейн-теру [1]. Результаты других исследований подвергали статистической обработке с использованием критерия Стьюдента, при этом статистически достоверными считались отклонения при р < 0,05 [2].
Всего было использовано 24 белых беспородных крыс-самцов.
Результаты и обсуждение. Токсикометриче-ские параметры исследуемого образца вещест-
Таблица
Нарушения белкового обмена при Т-2-токсикозе
Показатель Группа животных
контроль DL50 1/2 DL50 1/5 DL50
Транспорт глицина через апикальную мембрану энтероцита
Глицин, мМоль/мг 17,34+0,93 26,18+1,01** 24,22+1,17** 18,01+1,10
Глицил-Ь-лейцин, мМоль/мг 14,41+0,26 19,25+0,29** 18,63+1,27** 15,01+1,31
Глицил-Ь-валин, мМоль/мг 15,18+0,31 19,14+1,91** 18,39+1,18** 16,08+1,13
Транспорт глицина через базолатеральную мембрану энтероцита
Глицин, мМоль/мл 4,06+0,25 6,17+0,27** 5,71+0,27** 4,58+0,36
Глицил-Ь-лейцин, мМоль/мл 6,42+0,21 8,89+0,32** 8,28+0,19** 6,74+0,20
Глицил-Ь-валин, мМоль/мл 7,14+0,22 9,28+0,36** 8,79+0,25** 7,43+0,31
Некоторые показатели белкового обмена в сыворотке крови
Общий белок, г/л 8,02+0,26 6,99+0,19** 7,31+0,18* 7,65+0,18
Альбумин, г/л 2,94+0,20 2,02+0,10* 2,85+0,18 2,84+0,18
Глобулин, г/л 4,06+0,21 2,11+0,19** 3,32+0,21* 3,94+0,22
Примечание: * — различия статистически достоверны при р ^ 0,05
** — различия статистически достоверны при р ^ 0,05 и выходят за пределы (М+2а) физиологических показателей контрольной группы животных
ва составили: ВЬ16 = 1,6 мг/кг, БЬ50 = (2,8+0,14) мг/кг и БЬ84 = 6,3 мг/кг.
Действие Т-2-токсина на всасывание аминокислот и показатели белкового обмена сыворотки крови изучали при применении соединения в дозах БЬ50, 1/2 и 1/5 БЬ50. Полученные результаты приведены в табл. Анализ данных свидетельствует о возрастание всасывания аминокислот при уровнях воздействия, кратных БЬ50 и 1/2 БЬ50, при этом выявленные нарушения были не только статистически достоверны, но и выходили за границы физиологической нормы данного контроля (М±2о).
Так, при интоксикации Т-2 токсина на уровне БЬ50, транспорт глицина через апикальную мембрану энтероцита увеличивался на 50,98%, глицил-Ь-лейцина — на 33,59%, глицил-Ь-вали-на - на 26,09%.
При применении вещества в дозе, равной 1/2 БЬ50, всасываемость аминокислот была несколько ниже, при этом относительные величины составили: для глицина, глицил-Ь-лейцина и глицил-Ь-валина: 39,68, 29,29 и 21,15%, соответственно.
Аналогичные сдвиги обнаружены при изучении транспорта глицина через базолатераль-ную мембрану. При воздействии вещества в дозе БЬ50 возрастание составляло 51,97% (глицин), 38,47% (глицил-Ь-лейцин) и 29,97% (глицил-Ь-валин). Применение Т-2-токсина в дозе 1/2 БЬ50 приводило к увеличению активности транспорта в серозную полость глицина, глицил-Ь-лей-цин и глицил-Ь-валин препарата на 39,90, 28,97
и 23,11% соответственно.
Сравнительный анализ данных табл. позволяет также заключить, что перенос глицина через апикальную мембрану сопоставим с его переносом через базолатеральную мембрану, то есть весь глицин, поступивший в энтероцит, переносится в кровеносное русло.
Изучение действия Т-2-токсина на содержание белка и белковых фракций в сыворотке крови подопытных животных выявило статистически достоверное снижение их концентрации при воздействии вещества в дозе БЬ50, при этом за пределы нормы для данного контроля (М±2о) выходили содержание общего белка и глобулинов.
Таким образом, полученные результаты подтверждают сведения литературы о снижении концентрации белка в сыворотке крови при Т-2-токсикозе [17, 18].
Воздействие Т-2-токсина на уровне 1/5 БЬ50 не сопровождалось какими-либо сдвигами исследуемых показателей.
Изучение однократного действия Т-2-ток-сина на процессы усвоения глицинсодержащих аминокислот свидетельствовало о возрастании их всасывания, при этом наблюдалась зависимость «доза-эффект». Кроме того, полученные результаты позволили констатировать, что глицин обладает наибольшей способностью к всасываемости, в сравнении с другими пептидами. Это превышение составляло почти 40%.
Указанный факт позволяет предположить, что транспорт исследованных аминокислот за-
висит не только от воздействия Т-2 токсина на состояния мембраны кишечной клетки, но и от структуры самой молекулы пептида. Действительно, общая структура аминокислот выглядит следующим образом: Н^—СН(Я)—СООН, где Я — радикал, объем которого различен у исследовавшихся аминокислот и возрастает в последовательности глицин — валин — лейцин [14]. Соответственно объему молекулы возрастает и молекулярная масса [14]. Так, молекулярная масса глицина составляет 59 г/моль, глицил-Ь-валина — 175 г/моль, глицил-Ь-лейцина — 189 г/моль.
Косвенным подтверждением тому, что действие Т-2-токсина на всасывание аминокислот зависит и от строения самой аминокислоты может служить снижение всасывания триптофана при Т-2 токсикозе [26]. Известно, что триптофан относится к ароматическим аминокислотам и имеет в своей молекуле объемный заместитель, при этом молекулярная масса аминокислоты равняется 204 г/моль [14].
Заключение. Нарушение всасывания пептидов при воздействии Т-2-токсина зависит не только от мембранотропных свойств вещества, но и от величины и объема молекулы аминокислоты.
Выводы. 1. Средняя смертельная доза Т-2-ток-сина при внутрижелудочном введении составила 2,8±0,14 мг/кг, что позволяет охарактеризовать исследуемый образец веществ, как чрезвычайно токсичное соединение в соответствии с классификацией ГОСТ 12.1.007-76.
2. При интоксикации Т-2-токсина повышается перенос глицинсодержащих аминокислот через энтероцит, при этом наблюдается прямая зависимость «доза-эффект».
Список литературы
1. Беленький Б.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - 2-е изд. -Л.: Медицина, 1963. - 235с.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1999. - 459 с.
3. Головчак Н.П., Тарновская А.В., Коцюмба Г.1. и др. // Психоф1зюлог1чш та в1сцеральш функци в норми I патологи: Тези допов1дей III Всеукрат-ськой науково! конференци, присвячено1 70-р1ччю з дня нарождення Г.М.Чайченко. Кшв, 4—6 жовтня, 2006. - С. 26.
4. Захарова Л.П., Седова И.Б., Обольский О.Л. // Угрозы здоровью человека и пути их решения: Материалы Пленума Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации. Москва. 15-16 декабря, 2002. - М., 2002. - С. 94-96.
5. Захарова Л.П., Обольский О.Л., Львова Л. С. и др. // Вопр. питания, 1995. - № 2. - С. 26-29.
6. Камышников В. С. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. Справочник в двух томах. - Минск: Интер прессервис, 2003. - Т. 1. -С. 171-195.
7. Кораблев Е.Ю. Некоторые механизмы действия радиации и Т-2-токсина при комбинированном поражении и выбор средств защиты // Ав-тореф. дисс. канд. биол. наук - Казань: Всерос. н.-ин-т,, 2004. - 129 с.
8. Кравченко Л.В., Морозов С.В., Лаврентьева Л.И. // Угрозы здоровью человека и пути их решения: Материалы Пленума Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации. Москва. 15-16 декабря, 2002. - М., 2002. - С. 157-159.
9. Кушак Р.И., Басова Н.Л. //Физиол. ж. СССР,
1986. - LXXII. - № 4.
10. Кушак Р.И. Пищеварительно-транспорт-ная система энтероцитов. - Рига: Зинанте, 1983. - 233 с.
11. Левитин М.М. // Успехи медицинской микологии, 2003. - Т. 1. - Гл. 4. - С. 148-150.
12. Мусин Р.Р., Госманов Р.Г., Тремасов М.Я. и др. // Микология и фитопатол., 2004. - Т. 38. -№ 3. - С. 46-49.
13. Седова И.Б. Изучение частоты и уровня контаминации продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки некоторыми фу-зариотоксинами. // Автореф. дис. канд. биол. наук. - М.: НИИ экол. человека и гигиены окружающей среды РАМН, 2005. - 23 с.
14. Страйер Л. Биохимия. - М.: Мир, 1984. -Т. 1. - С. 18-38.
15. Уголев Л.М., Иезуитова Н.И., Цветкова В.Л. Структурная и функциональная организация мембранного пищеварения. Мембранный гидролиз и транстпорт. - Л., 1986. - С. 7-44.
16. Уголев Л.М., Иезуитова Н.И., Тимофеева Н.М. и др. Исследования пищеварительного тракта человека - Л.: Наука, 1963. - 237с.
17. Agrelo C.E., Schoental R. // Toxicol. Lett., 1990. - V. 5. - № 2. - P. 155-160.
18. Fairhurst S, Marrs T. C. et al. // Toxicology,
1987. - V. 43. - № 1. - P. 31-49.
19. Chang I.-V., Mar W.-C. // Toxicol. Lett.,
1988. - V. 40-33. - Р. 275-280.
20. Cheesvan C.J. // Can. J. Physiol. and Pharmacol., 1980. - V. 58. - № 11. - P. 1326-1333.
21. Guseva N.V. // 9th Int. Conf. «Diseases Fish and Sytllfish», Rhodes, 19-24 Sept., 1999: Book Abstr. Rhodes, 1999. - Р. P300.
22. Haring J.M., Barry J.A., Rajendran V.M. et al. //Amer. J. Physiol., 1989. - V 256. - № 3. - Pt. 1. -Р. g618-623.
23. Parent-Massin D. // Toxicol. Lett., 2004. - V. 153. - P. 75-81.
24. Masood A., Ranjan K.S. // Biomed. Lett.,
1994. - V. 49. - № 195. - Р. 213-217.
25. Minervini F., Fornelli F., Lucivero G. et al. // Toxicology, 2005. - V. 210. - P. 1. - № 5. - P. 8191.
26. Williams Ph.P. // Arch. Environ. Contam. and Toxicol., 1989. - V. 18. - № 3. - P. 374-387.
Материал поступил в редакцию 18.10.07.
V.Ye.Zhukov, I.P.Skalich
EFFECT OF A SINGLE EXPOSURE TO T-2 TOXIN ON ABSORPTION OF AMINO ACIDS IN THE SMALL INTESTINE OF WHITE RATS
Research Institute of Hygiene, Toxicology, Occupational Pathology, Volgograd
In small intestine of male rats, T-2 toxin in different doses caused an increased absorption of glycin; glycil-L-leicin and glycil-L-valin both through apical and basolateral membranes of intestine cells. Intensity of transmembrane transport depended on T-2 toxin exposure level.
УДК 615.9.07
М.Ю.Еропкин, Е.М.Еропкина
МОДЕЛЬ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ IN VITRO: ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИИ ПЕЧЕНИ S9 НА ТОКСИЧНОСТЬ РЯДА ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ
ГУ НИИ гриппа РАМН, С.-Петербург
На клеточной культуре А-549 ряда изучена токсичность противовирусных препаратов — рибавирина, триазави-рина, ремантадина, арбидола, бетулиновой кислоты при их инкубации с фракцией микросом печени крыс (фракция S9) после индукции у экспериментальных животных ферментов биотрансформации смесью полихлорирован-ных бифенилов (Совол). Показано, что эффект фрации S9 является разнонаправленным, вызывая достоверное снижение токсичности липофильных и сравнительно токсичных соединений (арбидол, ремантадин, бетулиновая кислота) и резкое повышение токсичности водорастворимых малотоксичных in vitro препаратов (триазавирин, ри-бавирин).
Ключевые слова: токсичность in vitro, противовирусные препараты, фракция S9.
Введение. Наиболее уязвимым моментом использования в токсикологических исследованиях клеточных культур является почти полное отсутствие в них активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков, особенно ферментов фазы I [2, 7]. Это относится не только к постоянным клеточным линиям, но даже к первич-но-трипсинизированным культурам: например, в культуре первичных гепатоцитов активность ферментов семейства цитохрома Р-450 сравнительно высока, но быстро снижается с увеличением срока культивирования. По мере увеличения числа пассажей эта активность резко падает и после 4-5 пассажей почти не отличается от фонового крайне низкого уровня, характерного для перевиваемых клеточных линий. Получение генно-инженерными методами клеточных линий, экспрессирующих отдельные ферменты метаболизма ксенобиотиков, также не способно полностью решить проблему, так как у каждой из таких линий экспрессируется только ка-
кой-то один конкретный фермент, например, одна из многочисленных изоформ цитохрома Р-450.
Одним из путей учета вклада биотрансформации в биологическую активность и токсичность ксенобиотиков может служить использование фракции микросом печени, точнее — суперна-танта после центрифугирования гомогената печени при 9.000 g (т.наз. фракции S9), особенно при условии предварительной индукции ферментов биотрансформации у подопытного животного смесью полихлорированных бифенилов (Ароклор 1254), которая повышает активность ферментов семейства цит.Р-450 в десятки раз [5]. Эта система давно с успехом применяется в тесте Эймса на мутагенную активность веществ с использованием бактерий Salmonella typhimurium [3]. В то же время, нет никаких принципиальных противопоказаний для ее использования с клеточными культурами млекопитающих [6, 9, 12].
Целью данной работы было исследование
