Влияние низкомолекулярного хитозана на регенерацию полнослойной гнойной раны в эксперименте Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2012 БИОЛОГИЯ Вып. 3

УДК 616-002.3-089:615.468:616-006

ВЛИЯНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА НА РЕГЕНЕРАЦИЮ ПОЛНОСЛОЙНОЙ ГНОЙНОЙ РАНЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Е. В. Гладкова, И. В. Бабушкина, С. В. Белова, И. А. Мамонова,

О. В. Матвеева, Е. В. Карякина

Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, 410002, Саратов, ул. Чернышевского, 148, e-mail: [email protected]; (845)2393062

Изложена процедура формирования полнослойной кожной гнойной раны у крыс, инфицированных клиническими полиантибиотикорезистентными штаммами Staphylococcus aureus, выделенными у пациентов травматолого-ортопедического стационара. Оценены регенераторные и антибактериальные свойства раневого покрытия на основе низкомолекулярного хитозана. Показано, что использование раневого покрытия на основе хитозана у животных с полнослойной гнойной раной приводит к профилактике вторичного инфицирования и сокращению сроков ее заживления.

Ключевые слова: хитозан; Staphylococcus aureus; экспериментальная гнойная рана.

Введение

Одним из актуальных направлений в медицине, в том числе - хирургии, является разработка био-совместимых, биодеградируемых и обладающих низкой токсичностью раневых покрытий, предназначенных для применения в условиях гнойного воспаления мягких тканей. В данном контексте рассматривается возможность использования различных композиций на основе природного биополимера хитозана [Марквичева, 2002]. Биодеградация полимерных носителей на его основе при воздействии неспецифических ферментов является одним из основных преимуществ [Чернова и др., 2009]. Кроме того, известны антибактериальные и регенерирующие [Регенерирующая ..., 2005; Бауэр и др., 2011] эффекты данного полимера.

Актуальным представляется оценка влияния местного применения гидрогеля хитозана на динамику заживления полнослойной кожной раны, осложненной гнойным процессом, вызванным клиническими полиантибиотикорезистентными штаммами Staphylococcus aureus [Бесчастнов и др., 2009; Божкова, 2011]. Выбор в качестве объекта для воздействия грамположительных кокков St. aureus, как транзиторного так и облигатного происхождения, обоснован широкой его распространенностью и преобладанием в структуре послеоперационных раневых инфекций [Гайдуль, Муконин, 2005].

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение репаративной регенерации мягких тканей при использовании гидрогеля природного биополимера хитозана в условиях экспериментальной гнойной раны.

Материалы и методы

Исследование проводили на 60 белых беспородных крысах - половозрелых самцах, массой тела 190-240 г.

Животные содержались в отдельных боксиро-ванных помещениях, питание осуществлялось согласно стандартной диете. Все манипуляции производились в рамках Правил и рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Содержание животных, их питание и уход за ними проводились по «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 06.04.1973», эвтаназия экспериментальных животных осуществлялась согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение 3, 4 к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977, №755).

Формирование раны размером 20 х 20 мм осуществлялось в межлопаточной области животных

О Гладкова Е.В., Бабушкина И.В., Белова С.В., Мамонова И.А., Матвеева О.В., Карякина Е.В., 2012

66

по предварительно нанесенному трафарету и представляло собой иссечение полнослойного кожного лоскута, сопровождаемое дополнительной механической травматизацией краев и дна раны [ Van Sprang, Janssen, 2001]. Непосредственно после формирования раневой поверхности осуществлялось ее инфицирование путем зашивания в полученный дефект на 2 сут. марлевого тампона весом 0.5 г, пропитанного взвесью суточной культуры St. aureus, выделенной от пациентов с гнойными посттравма-тическими и послеоперационными осложнениями, в дозе 2-10" КОЕ/мл. По истечении указанного срока были сняты швы и удален тампон. Все клинические и лабораторные признаки полнослойной раны с выраженным гнойным воспалением отмечали на 3-5 сут. [Гайдуль, Муконин, 2005].

В ходе эксперимента оценивали характер течения раневого процесса: наличие и особенности воспалительной реакции, состояние краев и дна раны, сроки очищения раны от некротических тканей, сроки появления грануляций и их особенности, сроки эпителизации ран, планиметрические характеристики на 3-j, 5-, 7-, 10- и 14-е сутки. Всем животным были произведены исследования основных гематологических показателей с использованием гематологического анализатора Micros 60 АВХ (Франция), цитологические характеристики мазков-отпечатков ран, окрашенных («Лейкодиф» 200) с использованием микроскопа Revelation III (США), с подсчетом количества нейтрофильных лейкоцитов, макрофагов и фиброзных элементов из расчета на 100 клеток (иммерсионный объектив 10x100). а также бактериологических исследований обсемененности раневой поверхности с использованием микробиологического анализатора BD BBL Cristal Aytoreader, а также метода разведения с использованием стандартных сред.

Проводилось определение вязкости гидрогеля хитозана с помощью «SV-10 Vibro -viscorer».

Экспериментальные животные были разделены на 3 группы по 20 крыс в каждой: 1 группа - ин-тактные животные; 2 группа - опытная (животные с полнослойной гнойной раной, однократно покрытой гидрогелем хитозана; 3 группа - сравнения, животные с полнослойной гнойной раной, которую однократно обрабатывали 0.9%-ным изотоническим раствором хлорида натрия. Гидрогель хитозана готовили непосредственно перед нанесением на экспериментальную поверхность путем растворения навески хитозана массой 1 г в предварительно подогретом до 37Ш стерильном изотоническом 0.9%-ном растворе натрия хлорида.

В работе был использован хитозан пищевой^ произведенный ЗАО « Б ИО П РО ГР Е С С ». г. Москва. Нанесение гидрогеля осуществлялось однократно равномерным слоем посредством накожной аппликации в количестве 1 г (рис. 1).

Статистическую обработку полученных данных

Рис. 1. Экспериментальная рана с нанесенным гидрогелем хитозана

Результаты и обсуждения

На третьи сутки с момента формирования полнослойной гнойной раны у животных отмечено снижение веса и аппетита, уменьшение общей активности. При визуальном осмотре отмечалась гиперемия и отечность краев и дна раны, появление на ее поверхности экссудата, а у ряда животных (около 30%) от их общего числа - наличие гнойного отделяемого. У всех крыс опытной группы и группы сравнения при проведении бактериологического исследования констатировали наличие St. aureus в количестве не менее 3 • 10s КОЕ/ мл.

У животных группы сравнения отмечалась гиперемия краев раны, наличие отдельных участков некроза, с частичным отторжением струпа, гнойным отделяемым (рис. 2).

Рис. 2. Экспериментальная гнойная рана у животного группы сравнения на 14-е сутки

К 14-м сут. отмечалась лишь частичная эпите-лизация и незначительная положительная динамика по уменьшению площади раны (табл. 1). Отмечено статистически значимое (р<0.05) уменьшение площади раны у животных опытной группы по сравнению с группой сравнения, уже начиная с 5-х

проводили с помощью программы «Medstat», предназначенной для обработки результатов медицинских и биологических наблюдений.

сут. наблюдения. Данная тенденция сохранялась и в дальнейшем.

У крыс опытной группы после нанесения гидрогеля хитозана на раневую поверхность уже к 6-м сут. отмечено уменьшение площади поверхности раны, чем у крыс группы сравнения (табл. 1). На 10-е сут. отмечено отсутствие признаков воспаления и выраженное уменьшение площади раневой поверхности. На 14-е сут. после формирования полнослойной инфицированной раны у большинства животных опытной групп отмечалось формирование раневого струпа, состоятельная эпителизация, частичное восстановление волосяного покрова (рис. 3).

Таблица 1

Изменение площади раневой поверхности у экспериментальных животных

Сутки ис-следо-ва-ния Группа сравнения, п = 20 Применение гидрогеля хитозана, п = 20

1 396.3 ± 5.4 399.2 ±5.8

3 368.8 ± 7.3 353.6 ±7.1

5 329.1 ± 17.4 277.2 ± 11.4 р < 0.05*

7 288.3 ± 18.4 202.1 ±23.5 р < 0.01*

10 235.6 ±23.7 149.8 + 20.6 р < 0.01*

14 195.3 ±23.6 88.9 ± 18.7 р< 0.001*

Р _ уровень достоверности различии показателей опытной группы по отношению к группе сравнения.

У оставшихся представителей опытной группы полная эпителизация и восстановление волосяного покрова имелись на 16-е сут.

В установленные сроки животным было произведено бактериологическое исследование отделяемого ран. У животных группы сравнения вплоть до завершения процесса эпителизации отмечалось выявление St. aureus от 3 10 6 КОЕ к 7-м суткам до 3 • 103 КОЕ к 20-22-м суткам наблюдения. Кроме того, у 8 крыс была отмечена вторичная контаминация Щ coli в количестве 2 х 104 КОЕ.

і

f. , 3

Ч. го л

s из Л

>— г»»

—_ чп-г

• : ' и“* я

Ги

СП"

Л

СО І

Рис. 3. Экспериментальная гнойная рана у животного опытной группы

При исследовании раневого отделяемого у всех животных опытной группы в первые 14 дней наблюдения отмечалось наличие St. aureus в ране, средняя концентрация которого достигала 3-10' КОЕ; в дальнейшем зафиксировано ее снижение. К моменту полного заживления ран (16-18-е сут.) лишь у 3 животных отмечалось наличие St. aureus в концентрации 3 102 КОЕ. Посевы с поверхности ран остальных животных опытной группы роста не давали.

В те же сроки производилась оценка лейкоцитарной формулы периферической крови, полученной при подрезании кончика хвоста (табл. 2).

Таблица 2

Динамика изменений содержания лейкоцитарной формулы у крыс различных групп

Сутки Серия Лейкоциты, общее содержание П/я нейтр. С/я нейтр. Лимфоциты

3 Контрольная группа 11.7 : 3.4-КГ/л 3.3 ±0.8 25.1 ±3.7 67.4 ±6.9

Группа сравнения 29.4 • 5.2 107.1 19.7 ± 1.7 38.1 ±2.1 39.1 ± 1.4

Г идрогель хитозана 27.3 ±8.1-107л 16.5 ± 1.2 40.8 ±2.3 39.0 ±3.7

5 Контрольная группа 10.2 ± 2.8- 107л 4.1 ± 1.1 23.3 ±2.8 69.3 ±5.1

Группа сравнения 34.3 ± 12.3 107.1 13.7 ± 1.6 32.1 ± 1.4 48.5 ±2.2

Г идрогель хитозана 27.8 ±5.3-107л 11.0 ±0.8 38.6 ± 1.5 р< 0.001* 45.4 ±2.3

7 Контрольная группа 11.8 ± 3.1- 107л 3.7 ±0.9 21.3 ±2.8 65.4 ±7.3

Группа сравнения 21.3 : 2.8107л 10.6 ± 1.2 32.0 ± 1.6 53,3 ±2.6

Г идрогель хитозана 14.9 ±4.4- 107л 6.2 ± 1.6 р < 0.05* 29.8 ± 1.5 57.4 ± 1.5

' р - уровень достоверности различии показателей опытной группы по отношению к группе сравнения.

Динамика изменения цитологических характеристик раневых отпечатков представлена в табл. 3.

При изучении относительного содержания ключевых показателей лейкоцитарной формулы отме-

чена положительная динамика содержания сегментоядерных нейтрофилов в группе животных, получавших лечение гидрогелем хитозана по отношению к группе сравнения уже на 5-е сут. В те же

сроки наблюдения у животных группы сравнения сохранялся дегенеративно-воспалительный тип цитограммы (рис. 4). Статистически значимые различия в содержании палочкоядерных нейтро филов отмечены к 7-м сут.

Таблица 3

Цитологические показатели дна раневых отпечатков экспериментальных животных в различные сроки заживления

Показатели Группа сравне- Опытная группа.

ния, n = 20 n = 20

1-е сут. наблюдения

нейтро филы 97.6 ±7.2 93.5 ±6.3

макрофаги 2.1 ±2.3 0.9 ±2.3

фибробласты 1.1 ±2.9 2.1 ±0.9

и фиброциты

3-й сут. наблюдения

нейтро филы 89.3 ±3.9 93.4 ±6.4

макрофаги 10.1 ±7.3 7.6 ±2.1

фибробласты 0.9 ±3.9 1.1+ 1.8

и фиброциты

5-е сут. наблюдения

нейтро филы 82.0 ± 1.9 79.8 ±2.3

макрофаги 10.0 ±7.6 10.2 ±6.2

фибробласты 6.9 ±4.9 8.1 ±4.8

и фиброциты

7-е сут. наблюдения

нейтро филы 76.1 ± 13.2 72.1 ±9.2

макрофаги 5.8 ±6.4 4.9 ±7.3

фибробласты 17.4 ±2.2 22.0 ±2.2

и фиброциты

14-е сут. наблюдения

нейтро филы 25.7 ± 3.8 30.1 ± 1.8

макрофаги 8.9 ±6.2 12.2 ±2.3

фибробласты 63.2 ± 1.2 59.8 ±2.1

и фиброциты

Рис. 4. Отпечаток гнойной раны у животного группы сравнения на 5-е сут. Скопление измененных нейтрофилов и микроорганизмов

Цитологическое исследование клеточного состава раневого дна показало наличие в течение

первых суток развития патологического процесса, преобладание дегенеративно измененных сегментоядерных нейтрофилов в сочетании с элементами крови и нитями фибрина.

Если на 3-5-е сут. отмечалось преобладание измененных нейтрофилов, то к 9-м - неизмененных нейтрофилов, единичных лимфоцитов и моноцитов. что сопровождалось снижением экссудации и началом формирования грануляционной ткани. К 15-м сут. в препаратах обнаруживали профи-бробласты на фоне снижения содержания полиморфноядерных нейтрофилов до 19-22 в поле зрения.

Выводы

Результаты проведенного исследования свидетельствуют об антибактериальном и регенерирующем эффектах гидрогеля хитозана в условиях экспериментальной гнойной раны, вызванной клиническими полиантибиотикорезистентными штаммами St. aureus.

Библиографический список

Бауэр Л.М. и др. Регенерация тканей преддверья рта при использовании геля хитозана // Медицина и образование в Сибири. 2011. № 5: электрон. науч. изд. Сибир. гос. мед. ун-та. URL: http://www.ngmu.ra/cozo/mos/article/text_full.php '.’id 529

Бесчастнов В.В. и др. Результаты микробиологического мониторинга лечения гнойных ран в условиях общехирургического стационара // Совр. технологии в медицине. 2009. № 2. С. 53-56. Божкова fijf. Современные принципы диагностики и антибактериальной терапии инфекции протезированных суставов (обзор литературы) // Травматология и ортопедия России. 2011. № 3 (61). С. 128-136.

Гайдулъ КВ., Мукопин АЛ. Раневая инфекция: этиология, диагностика и антимикробная терапия: краткое пособие для практических врачей. Б.м.: Б.и.. 2005. 32 с.

Марквичева 1. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. С. 315-326.

Регенерирующая активность и антибактериальное действие низкомолекулярного хитозана / T.Ä. Байтукалов, ().. 1. Богословская, П.П. Ольховская и др. // Изв. РАН. Сер. биология. 2005. №6. С. 659-663.

Чернова В.В. и др. Деструкция хитозана под действием фермента гиалуронидазы // Вестн. Башкир. ун-та. 2009. Т 14, № 1. С. 44-47.

¥ап Sprang PA., Janssen С.R. Toxicity identification of metals: development of toxicity identification fingerprints // Environmental toxicology and chemistry. 2001. Vol. 20, № 11. P. 2604-2610.

Поступила в редакцию 04.09.2012

Low-Molecular Chitosan Effect on the Regeneration of a Full-Layer Purulent Wound in the Experiment

E. V. Gladkova, candidate of biology, Head of the Department I. V. Babushkina, candidate of medicine, Senior Research Assistant S. V. Belova, candidate of biology, Senior Research Assistant

I. A. Mamonova, Junior Research Assistant О. V. Matveeva, doctor of Clinicodiagnostic Laboratory E. V. Karjakina, doctor of medicine, professor, Chief Research Assistant Department of Fundamental and Clinical Experimental Investigations FGBU “Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopaedics” of Ministry of Public Health and Social Development of the Russian Federation. 148, Chemyshevsky street, Saratov, Russia, 610002; [email protected]: (845)2393062

The procedure of the formation of a full-layer purulent wound infected with clinic polvantibiotic resistant strait Staphylococcus aureus extracted from patients of a traumatologic and orthopedic hospital in rats is represented. Regenerative and antibacterial properties of the wound covering based on low-molecular chitosan are assessed. It is demonstrated that the use of the wound covering based on chitosan in animals with full-layer purulent wounds prevents from reinfection and abbreviates the time for their healing.

Key words: chitosan; Staphylococcus aureus; experimental purulent wound.

Гладкова Екатерина Вячеславовна, кандидат биологических наук, начальник отдела Бабушкина Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Белова Светлана Вячеславовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Мамонова Ирина Александровна, младший научный сотрудник Матвеева О. В., врач клинико-диагностической лаборатории

Карякина Елена Викторовна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Отдел фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Мишдравсоцразвития России