CC BY
11© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
Г.Е.Бримь1, А.В.Егорова1, И.О.Бугаева Г.В.Пономарев2
ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО КРАСНОГО ЛАЗЕРА НА РОСТ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS И СЕНСИБИЛИЗИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ФОТОДИТАЗИНА
'Саратовский государственный медицинский университет им. В.И.Разумовского, 2Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва
Цель. Исследовать влияние лазерного излучения красной области спектра на рост колоний метициллин-чувствительного и метициллин-резистентного штаммов Staphylococcus aureus, а также изучить фотодинамический эффект фотосенсибилизатора фотодитазина. Материалы и методы. Определяли влияние света полупроводникового красного лазера (к 660 нм, 100 мВт/см2) в дозах 30,60,90 и 180 Дж/см2 на рост колоний S. aureus. Время облучения — 5, 10, 15 и 30 мин. В отдельных сериях экспериментов бактериальные клетки предварительно сенсибилизировали водным раствором фотодитазина в концентрации 5x10"6 М. Результаты. Установлено, что излучение красного лазера вызывало отчетливое подавление бактериального роста. Этот эффект на стандартном штамме S. aureus проявлялся только при использовании относительно высоких доз облучения (180 Дж/см2). Фоточувствительность метициллин-резистентного штамма оказалась значительно выше: бактериостатическое действие красного света отмечалось уже при дозе 60 Дж/см2. Предварительная обработка бактериальных клеток фотодитазином заметно усиливала ростингибирующий эффект лазерного света.
Журн. микробиол., 2017, № 2, С. 34—37
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, лазерное излучение, фотодитазин G.E.Bril1, A.V.Egorova', I.O.Bugaeva1, G.V.Ponomarev2
EFFECT OF LOW-INTENSITY RED LASER ON GROWTH OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND SENSITIZING EFFECT OF PHOTODITAZIN
'Razumovsky Saratov State Medical University, 2Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
Aim. Study the effect of laser emission in the red spectrum on growth of methicillin-sensitive and methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus, as well as photodynamic effect of photosensitizer photoditazin. Materials and methods. Effect of light of semiconductor red laser (X 660 nm, 100 mW/cm2) at 30, 60, 90 and 180 J/cm2 on growth of S. aureus colonies was determined. Time of exposure — 5, 10, 15 and 30 minutes. In certain series of experiments bacterial cells were sensitized in advance by a water solution of photoditazin at a concentration of 5x 10~6 M. Results. Red laser emission was established to cause a pronounced suppression of bacterial growth. This effect on standard S. aureus strain only took place during use of relatively high exposure doses (180 J/cm2). Photosensitivity of methicillin-resistant strain turned out to be significantly higher: bacteriostatic effect of red light was noted already at the dose of 60 J/cm2. Treatment of bacterial cells with photoditazin in advance significantly enhanced growth-inhibiting effect of laser light.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 2, P. 34—37
Key words: Staphylococcus aureus, laser emission, photoditazin 34
ВВЕДЕНИЕ
Золотистый стафилококк является возбудителем многих заболеваний человека и до последнего времени остается наиболее частой причиной возникновения внутрибольничных инфекций [2, 4]. Особому риску подвергаются пациенты с ослабленной иммунной системой при несоблюдении персоналом больницы надлежащих санитарных правил. Лечение стафилококковых инфекций вызывает серьезные трудности, вследствие нарастающей лекарственной устойчивости возбудителя и появления метициллин-резистентных штаммов (MRSA) [1, 3, 5]. Последнее диктует необходимость изыскания новых немедикаментозных методов лечения стафилококковых поражений. В этом плане внимание исследователей привлекают различные виды низкоинтенсивного лазерного излучения. Однако считается, что бактериальные клетки мало чувствительны к свету красной области спектра.
Целью настоящей работы явилось изучение прямого бактериостатическо-го действия на S. aureus низкоинтенсивного красного лазера и фотодинамического эффекта фотосенсибилизатора фотодитазина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали клетки стандартного (метициллин-чувствительного, MSSA) и клинического (метициллин-резистентного, MRSA) штаммов S. aureus 209Р, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СГМУ им. В.И. Разумовского. Для культивирования бактерий использовали ГРМ-агар (ГНЦ ПМБ, Оболенск). Для облучения культур микроорганизмов использовали полупроводниковый лазер (EMRED Оу, Финляндия), генерирующий излучение красной области спектра (А, 660 нм) в непрерывном режиме. Плотность мощности составляла 100 мВт/см2, время облучения — 5,10,15 и 30 мин. При этом суммарная энергетическая доза облучения составляла соответственно 30,60,90 и 180 Дж/см2. Для сенсибилизации бактериальных клеток использовали водный раствор фотодитазина (N-диметилглюкаминовая соль хлорина Е6) в концентрации 5х10"6 М (производитель ООО ВЕТА-ГРАНД, Москва). Фотосенсибилизатор был предоставлен проф. Г.В.Пономаревым (Москва). Пик поглощения молекулы фотодитазина совпадает с длиной волны используемого лазера. Для создания асептических условий полистирольный 96-луночный планшет для иммунологических исследований помещали в стерильный пластиковый корпус. Источник излучения располагали над ячейками планшета.
Бактериальную взвесь готовили в стерильном физиологическом растворе по международному оптическому стандарту мутности 5 ед. (ГИСК им. Л.А.Тарасевича); конечная концентрация составила 103 м.к./мл. Из разведения микроорганизмов 104 м.к./мл 0,1 мл взвеси вносили в 0,9 мл раствора фотосенсибилизатора и инкубировали в течение 30 мин без доступа света. Из конечного разведения, а также из раствора фотосенсибилизатора бактериальную взвесь в объеме 0,2 мл вносили в ячейки планшета. Облучение находящихся в ячейках бактериальных клеток проводили, последовательно увеличивая дозу. Из каждой ячейки высевали по 0,2 мл взвеси на чашки Петри с плотной питательной средой и равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Контролем служили взвеси бактерий, не обработанные фотосенсибилизатором и не подвергнутые облучению. Посевы контрольных и облученных микроорганизмов инкубировали в течение 48 часов при 37°С. Оценку
роста бактерий проводили путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Все эксперименты проводили в пятикратных повторностях. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием U-теста Манна-Уитни. Достоверными считали различия средних при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Среднее количество колоний при росте метициллин-чувствительного штамма в контроле (без воздействия) составило 373,6±46,2. После лазерного облучения в суммарной дозе 30, 60 и 90 Дж/см2 количество колоний слегка уменьшалось, но эти изменения были статистически не достоверны (р>0,1). Однако фотовоздействие в дозе 180 Дж/см2 вызывало уменьшение числа колоний до 238,8+21,8, т.е. на 36% (р<0,02).
Иные закономерности были обнаружены при использовании метициллин-резистентного штамма золотистого стафилококка. Среднее количество колоний этого штамма в контроле составило 320,6+69,9, что достоверно не отличалось от роста стандартного штамма (р>0,5). После облучения лазером в суммарной дозе 30 Дж/см2 прослеживалась тенденция к угнетению клеточного роста (р>0,05). Увеличение дозы фотовоздействия приводило к отчетливому подавлению бактериального роста. Так, при использовании дозы 60 Дж/ см2 число колоний уменьшилось до 143,2± 19,6 (на 55%, р<0,05), при 90 Дж/ см2 - до 126,4± 16,8 (на 61%, р<0,05), при 180 Дж/см2 - до 107,2+14,8 (р<0,02). То есть при максимальной дозе облучения, использованной в наших опытах, угнетение роста бактерий достигало 67%.
Следовательно, низкоинтенсивное лазерное излучение красной области спектра оказывает ингибирующее влияние на рост колоний S. aureus, причем этот эффект на стандартном штамме проявляется только при использовании относительно высоких доз облучения (180 Дж/см2). Фоточувствительность метициллин-резистентного штамма оказалась значительно выше: бактерио-статическое действие красного света отмечалось уже при дозе 60 Дж/см2.
Далее мы определили, не влияет ли на рост стафилококков предварительная инкубация бактериальных клеток с фотосенсибилизатором фотодитази-ном. Как оказалось, этот препарат не оказывает существенного влияния на рост бактерий. Число колоний штамма MSSA при использовании фотодитазина в концентрации 5хЮ~6М составляло 338,8+36,0 (р>0,5), штамма MRSA — 296,4+63,1 (р>0,5).
Следующим этапом нашей работы явилось изучение фотодинамического действия фотодитазина на S. aureus. С этой целью микробные клетки, предварительно обработанные фотосенсибилизатором, подвергались лазерному воздействию.
Опыты, проведенные со штаммом MSSA, подвергнутым действию фотодитазина, показали, что лазерное облучение уже в малой дозе (30 Дж/см2) снижает число колоний до 235,2±35,0 (р<0,05). Однако степень этого снижения достоверно не отличается от действия самого лазерного облучения (р>0,05), т.е. отчетливого фотодинамического эффекта не наблюдается. Увеличение дозы фотовоздействия до 60 Дж/см2 вызывает еще большее угнетение роста бактерий (до 128,0+17,7 колоний, р<0,01). В этом проявляется явное фотодинамическое действие, поскольку степень ингибиции роста бактерий достоверно превышает лазерный эффект (р<0,01). В дальнейшем по мере увеличения дозы облучения наблюдается прогрессирующее угнетение роста колоний: при облучении в дозах 90 и 180 Дж/см2 количество колоний
уменьшается до 102,8+15,5 (р<0,001) и 69,6±13,8 (р<0,001) соответственно, что также заметно превышает степень торможения бактериального роста при воздействии только лазера (р<0,01 и р<0,001) и свидетельствует о фотодинамическом эффекте фотодитазина.
В опытах со штаммом MRSA предварительная обработка фотодитазином с последующим лазерным облучением в дозах 30 и 60 Дж/см2 достоверно не влияли на число колоний. Так, при использовании дозы облучения 30 Дж/см2 число колоний составило 248,2±52,5 (р>0,2), при 60 Дж/см2 — 151,8±34,0 (р>0,05). При дальнейшем увеличении дозы облучения регистрировалось отчетливое угнетение клеточного роста: число колоний при дозе облучения 90 Дж/см2 уменьшалось до 66,4±16,2 (р<0,01), при 180 Дж/см2 — до 34,4±12,8 (р<0,01). Причем при действии двух последних доз лазерного облучения выявлялся отчетливый фотодинамический эффект: степень угнетение роста бактериальных колоний была значительно выше после предварительного действия фотодитазина, чем при действии только лазера (р<0,05 и р<0,01 соответственно).
Таким образом, лазерное излучение красного диапазона спектра оказывает непосредственное бактериостатическое действие на рост метициллин-чувствительного и метициллин-резистентного штаммов S. aureus, причем этот эффект более выражен на резистентном штамме. Предварительная сенсибилизация бактериальных клеток фотодитазином заметно усиливает ростинги-бирующий эффект.
ЛИТЕРАТУРА
1. Braga E.D., Aguiar-Alves F., de Freitas M.F. et al. High prevalence of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant S. aureus colonization among healthy children attending public daycare centers in informal settlements in a large urban center in Brazil. BMC Infect. Dis. 2014, 6 (14): 538.
2. Carrel M., Schweizer M.L., Sarrazin M.V. et al. Residential proximity to large numbers of swine in feeding operations is associated with increased risk of methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization at time of hospital admission in rural Iowa veterans. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 2014, 35 (2): 190-193.
3. Dissemond J., Goos M., Esser S. Pathogenetic significance of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in chronic wounds. Vasa. 2003, 32 (3): 131-138.
4. McKinnell J.A., Miller L.G., Eells S.J. et al. A systematic literature review and metaanalysis of factors associated with methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization at time of hospital or intensive care unit admission. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 2013,34(10): 1077-1086.
5. Miller R.M., Price J.R., Batty E.M. et al. Healthcare-associated outbreak of meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia: role of a cryptic variant of an epidemic clone. J. Hosp. Infect. 2014, 86 (2): 83-89.
Поступила 10.10.16
Контактная информация: Егорова Анна Валериевна, к.м.н., 410012, Саратов, ул. Б.Казачья, 112, р.т. (8917)210-69-80
