CC BY
76
УДК: 616.24-006.6-033.2:539.12.047]-092.9
влияние низкодозового ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКОГО РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РоСТ И МЕТАСТАЗИРоВАНИЕ КАРЦИНоМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС
М.А. Булдаков1, Н.В. Литвяков13, И.А. Климов1, О.П. Кутенков2,
М.А. Большаков23, В.В. Ростов2, Н.В. Чердынцева1
НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск1 Институт сильноточной электроники СО РАН, г. Томск2 Томский государственный университет3 634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: buldakov@oncology.tomsk.ru1
В экспериментах изучалось влияние низкодозового импульсно-периодического рентгеновского излучения (ИПРИ) с импульсами наносекундной длительности на опухолевые клетки карциномы легких Льюис in vitro и in vivo. Установлена зависимость цито-статического и антиметастатического действия ИПРИ от частоты повторения импульсов и мощности импульса. Ингибирование пролиферативной активности опухолевых клеток карциномы легких Льюис in vitro, достигало 30-60 %. Двукратное облучение опухолевого узла ИПРИ с СОД, не превышающей 0,06 Гр, in vivo приводило к торможению роста опухоли лишь на 10-20 %. Максимальное ингибирование процесса метастизирования достигало 16 %.
Ключевые слова: низкодозовое импульсно-периодическое рентгеновское излучение, карцинома легких Льюис.
LOW-DOSE REPETITIVELY-PULSED X-RAY INFLUENCE ON LEWIS LUNG CARCINOMA GROWTH AND METASTASIS
М.А. Buldakov 1, N.V. Litviakov13, I.A. Klimov1, O.P. Kutenkov2,
М.А. Bolshakov2,3, V.V. Rostov 2, N.V. Cherdyntseva1 Tomsk Cancer Research Institute1,
Institute of High-Current Electronic, Tomsk2,
Tomsk State University3 5, Kooperativny Street, 634050-Tomsk, e-mail: buldakov@oncology.tomsk.ru1
Influence of low-dose repetitively-pulsed X-ray (RPX-ray) with nanosecond pulse duration on Lewis lung carcinoma in vitro and in vivo was studied. Cytostatic and antimetostatic effects of RPX-ray were found to depend on pulse repetition frequency and dose per pulse. Inhibition of Lewis lung carcinoma in vitro achieved 30-60 %. Two-time irradiation of tumor-bearing mice with the total dose below 0,06 Gy inhibited tumor growth only for 10-20 %. The maximum 16 % of antimetastatic effect after RPX-ray was observed.
Key words: repetitively-pulsed irradiation, Lewis lung carcinoma, low-dose.
Ранее нами было показано, что импульсно- опухолевые клетки in vitro связаны с индукцией
периодическое рентгеновское излучение (ИПРИ) с активных форм кислорода, выходом цитохрома С
импульсами наносекундной длительности способ- из митохондрий, активацией экспрессии р53 и, в
но проявлять антипролиферативную активность в конечном счете, с индукцией процесса апоптоза [9].
системе in vitro на культуре опухолевых клеток [2]. Таким образом, ИПРИ в системе in vitro способно
При этом цитостатический эффект ИПРИ в значи- оказывать «прямое» цитостатическое действие на
тельной степени зависел от используемой частоты опухолевые клетки различных линий. В системе
повторения импульсов («частотное окно» - 8, 10, in vivo действие ИПРИ на опухолевые клетки
13, 16, 25 имп/с), поглощенной дозы («дозовый может в значительной степени модифицироваться
коридор» 0,003 до 0,1 Гр) и линии опухолевых факторами организма и опухоли, такими как антиклеток. Наиболее значимое ингибирование про- оксидантная система, иммунные и эндокринные
лиферативной активности клеток мастоцитомы факторы, опухоль-стромальные взаимодействия
Р-815 выявлено при частоте излучения 10, 13, и многое другое. Настоящее исследование пред-
16 имп/с, а карциномы Эрлиха - при частотах принималось с целью определить, как изменяется
13, 16, 25 имп/с [2]. Было показано, что механиз- в системе in vivo цитостатический эффект ИПРИ,
мы антипролиферативного действия ИПРИ на установленный in vitro. Для этого была использо-
вана модель метастазирующей опухоли, при этом ингибирующей эффект на рост первичной опухоли, можно было (с определенной долей условности) связывать с «прямым» антипролиферативным действием ИПРИ, в то время как антиметастати-ческий эффект свидетельствовал бы о вовлечении факторов организма в его реализацию.
Материал и методы
В работе использована модель метастазирую-щей опухоли мышей - карциномы легких Льюис (LLC). Исследование проводилось с разрешения локального этического комитета НИИ онкологии. Дизайн исследования предполагал на первом этапе оценку антипролиферативного эффекта ИПРИ на клетки LLC в системе in vitro в различных режимах сочетания частоты повторения импульсов и мощности дозы за импульс (табл. 1), далее выбирались только те режимы ИПРИ, которые оказывали выраженный цитостатический эффект, и в системе in vivo оценивалось их действие на рост первичной опухоли и влияние на процесс метастазирования.
В качестве источника наносекундного импульсно-периодического рентгеновского излучения использовалась установка «Синус-150», сконструированная в Институте сильноточной электроники СО РАН (г. Томск). Длительность импульса составляла 4 нс, энергия электронов -160 кЭв, ток пучка - 3,5 кА. Суммарная экспозиционная доза составила 1,2 Р; 4 Р; 6 Р при дозах за импульс 0,3; 1,0 и 1,5 мР/имп соответственно. Время воздействия было ограничено количеством импульсов - 4000 импульсов за сеанс - и составляло в среднем 5-6 мин. Использовались следующие частоты повторения импульсов: 8, 10, 13, 16 и 19 имп/с.
Для экспериментов in vitro опухолевые клетки LLC, извлеченные из опухолевого узла объемом 0,4-0,7 см3, помещали в культуральную среду
(RPMI-164Q с Ю % телячьей сывороткой) и через сутки инкубации во влажной атмосфере с 5 % уровнем СО2 при 37°С (в СО2-инкубаторе MCO-5AC Sanyo, Япония) готовили суспензию клеток в концентрации 1 млн/мл. Облучение клеточной суспензии проводили в пенициллиновых флаконах. Выбранные режимы облучения (частота и мощность дозы за импульс) представлены в табл. 1. Все исследования проводились в двух сериях по б исследований на каждый режим в каждой серии.
Пролиферативную активность клеток оценивали радиоизотопным методом по включению в ДНК клеток 3Н-тимидина через 24 ч после облучения [Ю] с помощью Р-счетчика (145Q MicroBeta Wal-lac Trilux, Perkin Elmer, Голландия), в качестве результата использовали значение включения 3Н-тимидина в ДНК клеток, выраженное в импульсах флуоресценции сцинтилляционного субстрата в минуту (имп/мин).
Для исследования in vivo мышам линии С57Blб (по б мышей в каждой группе) проводили трансплантацию опухолевых клеток LLC в заднюю правую лапу в количестве 3 млн на мышь. Замеры опухолевого узла проводили в 3 измерениях, начиная с б-х сут после трансплантации, по ним вычисляли объем опухоли по формуле (R1+ R^+ R3)/2 [4]. Первый сеанс облучения проводили, когда объем опухоли достигал 1 см3 (б-е сут после трансплантации), второй - через 7 дней (13-е сут после трансплантации). Воздействие ИПРИ проводилось на область опухоли, для этого животные помещались в пластиковую камеру и накрывались сверху и снизу свинцовым колпаком, при этом задняя правая конечность с опухолевым узлом находилась за пределами защитной камеры.
На 21-е сут после трансплантации опухоли животных забивали методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом и проводили
Таблица 1
Режимы сочетания частоты повторения импульсов и мощности дозы за импульс, использовавшиеся для облучения культур клеток LLC
Экспозиционная доза, Р
1,2 Р 4 Р б Р
8 имп/с; Q,3 мР/имп 8 имп/с; 1 мР/имп Не проводилось
1Q имп/с; Q,3 мР/имп 1Q имп/с; 1 мР/имп Не проводилось
13 имп/с; Q,3 мР/имп 13 имп/с; 1 мР/имп 13 имп/с; 1,5 мР/имп
16 имп/с; Q,3 мР/имп 16 имп/с; 1 мР/имп 16 имп/с; 1,5 мР/имп
19 имп/с; Q,3 мР/имп 19 имп/с; 1 мР/имп 19 имп/с; 1,5 мР/имп
вскрытие. Проводили взвешивание опухолевого узла и легких, в которых подсчитывали площадь и количество метастазов под бинокулярной лупой с измерительной шкалой. Эффективность действия ИПРИ на первичную опухоль определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО = Уконтроль-Уопыт/Уконтроль, где У - объем опухоли в мм3), для оценки антиметастатического эффекта ИПРИ вычисляли индекс ингибиции метастазирования (ИИМ = АконтрольхВконтроль - АопытхВопыт/ Аконтроль^Вконтроль, где А - процент мышей с метастазами, В - количество метастазов) и индекс торможения роста метастазов (ТРМ = ^контроль-Sопыт)/Sконтроль, где S - средняя площадь метастазов в группе).
Статистическую значимость различий между выборками оценивали при помощи критерия Манна-Уитни в программе St.atistica 6.0.
Результаты и обсуждение
Для исследования влияния ИПРИ на культуру опухолевых клеток LLC были выбраны частоты повторения импульсов 8; 10; 13; 16; 19 имп/с и мощность дозы за импульс 0,3; 1; 1,5 мР/имп (табл. 1), поскольку именно при таких частотах и мощностях наблюдался выраженный цитостатический эффект на других опухолевых линиях [1, 2, 3, 9].
Уровень пролиферации клеток LLC в течение 24 ч после облучения ИПРИ статистически значимо увеличивался или уменьшался по сравнению с контролем (клетки LLC с ложным облучением) в 5 случаях. Ингибирование пролиферативной
активности опухолевых клеток отмечалось при использовании частот повторения импульсов 1Q имп/с (Q,3 мР/имп); 16 имп/с (1 мР/имп) и 13 имп/с (1,5 мР/имп) и составляло 46, 5Q и 65 % соответственно от уровня контроля (табл. 2). Статистически значимая стимуляция процессов клеточной пролиферации отмечалась в 2 случаях - при воздействии с частотой повторения импульсов 1б имп/с (Q,3 мР/ имп) - на 45 % и более чем в 2 раза при использовании частоты повторения импульсов 19 имп/с (1,5 мР/имп). Облучение опухолевых клеток на других режимах не влияло на их пролиферацию.
Полученные на культуре клеток данные позволили выбрать только три эффективных режима для дальнейшей оценки действия ИПРИ in vivo, на трансплантированную LLC - 1Q имп/с при Q,3 мР/ имп (группа А); 13 имп/с при 1,5 мР/имп (группа Б); 1б имп/с при 1 мР/имп (группа В). В течение 3 сут после локального облучения первичной опухоли (с б-х по 9-е сут после трансплантации LLC) не отмечалось никаких различий по объему опухолевого узла ни в одной группе животных по сравнению с группой контроля. Начиная с Ю-х сут статистически значимое торможение роста опухоли наблюдалось в группах А и Б и составляло от 12 до 23 %, после второго облучения статистически значимое торможение роста опухоли было отмечено и в группе В, но на 2q^ и 21-е сут (через неделю после облучения) отличия с контролем сохранялись только в группах животных А и Б (рис. 1).
Рис. 1. Динамика торможения роста первичной опухоли КЬС.
Примечание: по оси ординат - индекс ТРО, %; по оси абсцисс - сутки после трансплантации опухоли; * - различия группы А с контролем статистически значимы, р < 0,05; А - различия группы Б с контролем статистически значимы, р < 0,05; ° - различия группы В с контролем
статистически значимы, р < 0,05
зо
Рис. 2. Влияние ИПРИ на метастазирование LLC.
Примечание: по оси ординат представлены индекс ингибиции метастазирования (ИИM) и индекс торможения роста метастазов (ТPM) в процентах
Использование 3 режимов воздействия, показавших на культуре клеток LLC цитостатический эффект на уровне 46-65 %, не позволило получить такой же высокой эффект при локальном облучении опухоли, трансплантированной мышам. Mожно только констатировать, что цитостатический эффект, отмеченный для 3 режимов ИПРИ в системе in vitro, сохранялся и в системе in vivo, но значительно снижался. Это может быть обусловлено низкой проникающей способностью ИПРИ при облучении ткани опухоли и большим количеством опухолевых клеток, по сравнению с клеточной культурой. Нельзя исключать роль организма в снижении цитостатического эффекта ИПРИ по сравнению с клеточной культурой. Тем не менее исследование подтвердило возможность «прямого» повреждающего действия ИПРИ на рост первичной опухоли.
Влияние различных режимов ИПРИ на метаста-зирование LLC (как показателя действия ИПРИ, опосредованного факторами организма) оказалось
разнонаправленным. Выраженный эффект отмечался на интенсивность метастазирования (число метастазов в легких и частоту метастазирования). В группе, получавшей ИПРИ в режиме 10 имп/с при 0,3 мР/имп (группа А), индекс ингибиции метастазирования, рассчитанный с учетом частоты и числа метастазировавших колоний в легких, составил 16 %, тогда как в других группах (Б и В) отмечалась стимуляция процесса метастазирова-ния (рис. 2). Подсчет площади метастазов показал незначительное торможение роста метастазов (ТРМ) в группе А, в то время как в других группах площадь метастатических колоний в легких была больше, чем в контроле (рис. 2). Особенно сильный стимулирующий эффект на процесс метастазиро-вания оказало использование ИПРИ с частотой повторения импульсов 13 имп/с (группа Б).
Таким образом, при локальном облучении ИПРИ мышей в области первичной опухоли в двух группах отмечалось влияние на процесс гематогенного метастазирования. В группе А при частоте 10 имп/с 0,3 мР/имп рентгеновское излучение ингибировало процесс метастазирования ЬЬС, а в группе Б при частоте 13 имп/с при 1,5 мР/имп наблюдалось увеличение частоты, интенсивности и размеров метастатических колоний в легких. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении факторов организма в реализацию влияния ИПРИ на процесс метастазирования ЬЬС. Наиболее вероятным фактором является иммунная система, определенные звенья которой могут быть активированы после облучения и способны как ингибировать метастазиро-вание, так и стимулировать рост метастатических колоний. Возможность активации системы иммунитета при локальном облучении в «малых» дозах (СОД 0,1-0,2 Гр) показана в работах ряда авторов. Отмечается стимуляция натуральных киллеров, ма-
Таблица 2
Уровень включения зн-тимидина в Днк клеток LLC через 24 ч после облучения
Q,3 мР/имп 1 мР/имп 1,5 мР/имп
Контроль 24Q5± 288 24Q5± 288 3785±515
8 имп/с 2162±578 2392 ± 258 Не проводилось
1Q имп/с 1317±13Q* 1617±11Q Не проводилось
13 имп/с 242Q± 387 2734 ± 254 1348±2QQ*
16 имп/с 35Q9±256* 1221±133* 3448±1Q41
19 имп/с 373Q±528 1877± 87 785Q±359*
Примечание: * - различия с группой контроля статистически значимы (р<0,05). СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2011. №6 (48)
ВЛИЯНИЕ НИЗКОДОЗОВОГО ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКОГО РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ...
-------------------------------------------------------------------------------- З1
крофагов, цитотоксических Т-лимфоцитов, СD8+. экспрессия ИФН-у и ФНО [5-7, 8].
Заключение
Цитостатический эффект, отмеченный для трех режимов ИПРИ в системе in vitro, сохранялся и при локальном облучении опухоли в системе in vivo. ИПРИ ингибировало рост первичной опухоли LLC, но эффект был значительно ниже, чем его анти-пролиферативное действие на клетки в культуре in vitro. ИПРИ оказывало влияние на процесс гематогенного метастазирования LLC. В одной группе отмечалось ингибирование, в другой группе - стимуляция частоты, интенсивности и размеров метастатических колоний в легких, что свидетельствует о вовлечении факторов организма в реализацию влияния ИПРИ на процесс метастазирования. В дальнейшем планируется исследовать причины снижения антипролиферативного действия ИПРИ на первичную опухоль и изучить механизмы его влияния на метастазирование.
Работа поддержана проектами АВЦП № 2.1.1/2777 и 2.1.1/13778.
ЛИТЕРАТУРА
1. Жаркова Л.П. Реализация окислительных процессов в печени и крови после кратковременного воздействия наносекундных
импульсно-периодических электромагнитных излучений: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Томск, 2010. 24 с.
2. Литвяков Н.В., Ростов В.В., БулдаковМ.А. и др. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток импульсно-периодическим рентгеновским излучением // Сибирский онкологический журнал. 2006. № 1 (17). С. 24-31.
3. Литвяков Н.В., Булдаков М.А., Чердынцева Н.В. и др. Влияние импульсно-периодического СВЧ-излучения на синтез нуклеиновых кислот в опухолевых клетках // Радиационная биология. Радиоэкология. 2005. Т. 45, № 4. С. 491-494.
4. Camphausen K., Moses M.A., Menard C. et al. Radiation abscopal antitumor effect is mediated through p53 // Cancer Res. 2003. Vol. 63. P 1990-1993.
5. Cheda A., Nowosielska EM., Wrembel-Wargocka J. et al. Production of cytokines by peritoneal macrophages and splenocytes after exposure of mice to low doses of X-ray // Radiat. Environ. Biophys. 2008. Vol. 47 (2). P. 275-283.
6. Cheda A., Wrembel-Wargocka J., Lisiak E. et al. Single low doses of X Rays inhibit the development of experimental tumor metastases and trigger the activities of NK cells in mice // Radiat. Res. 2004a. Vol. 161 (3). P. 335-340.
7. Cheda A., Wrembel-Wargocka J., Lisiak E. Inhibition of the development of pulmonary tumour nodules and stimulation of the activity of NK cells and macrophages in mice by single low doses of low-LET radiation // Int. J. Low Radiation. 2004b. Vol. 1. P. 171-179.
8. Hashimoto S., Shirato H., Hosokawa M. The suppression of me-tastases and the change in host immune responded after low-dose total-body irradiation in tumor-bearing rats // Radiat. Res. 1999. Vol. 151 (6). P. 717-724.
9. Litvyakov N.V, Rostov V.V., Bolshakov M.A. et al. Apoptosis-induced effects of pulse periodic X-ray on tumor cells // Biophysics. 2005. Vol. 50 (1). P. S51-S58.
10. SeoH.-R., ChungH.-Y., Lee Y.-J. et al. p27Cip/Kip is involved in Hsp25 or inducible Hsp70 mediated adaptive response by low dose radiation // J. Radiat. Res. 2006. Vol. 47. Р. 83-90.
Поступила 23.09.11
