CC BY
63
© Коллектив авторов, 2013 г. УДК 615.857.064.14:575
О. И. Большакова, Д. И. Родин, С. И. Тимошенко, Е. М. Латыпова, С. В. Саранцева
ВЛИЯНИЕ НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ И НЕЙРОДЕГЕНЕРА-ЦИЮ В МОЗГЕ ТРАНСГЕННЫХ йКОБОРНИА МБЬАМООАЗТБЯ. С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА АРР ЧЕЛОВЕКА
Санкт-Петербургский институт ядерной физики имени Б. П. Константинова, г. Гатчина
ВВЕДЕНИЕ
Болезнь Альцгеймера (БА) — наиболее часто встречающееся нейродегенеративное заболевание лиц пожилого возраста, основными клиническими проявлениями которого являются потеря памяти, распад психической и интеллектуальной деятельности человека. К основным нейроморфологическим маркерам заболевания относят наличие внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, экстраклеточных сенильных бляшек, число которых увеличивается с возрастом, нейродегенерацию преимущественно в гиппокампе и коре головного мозга [2]. Амилоидный пептид в (Ав), составляющий основу сенильных бляшек, является нормальным растворимым метаболитом в организме человека и образуется вследствие протеолитического разрезания большого трансмембранного белка-предшественника амилоида (АРР) двумя протеазами — в- и у-секрета-зами. Как полагают, при БА в большей степени начинает образоваться наиболее склонная к агрегации форма Ав, состоящая из 42 аминокислот. В связи с этим основные стратегии разработки лекарственной терапии для БА связаны с поиском препаратов, способных уменьшить образование Ав. К сожалению, до настоящего времени попытки антиамилои-догенной терапии не привели к успеху и сопровождались серьезными побочными эффектами. Следовательно, необходим поиск препаратов, модулирующих другие стороны патогенетического процесса, например, нейродегенерацию.
Никотиновая кислота (ниацин, витамин В3, витамин РР) участвует во многих окислительных реакциях в клетке и широко используется в клинической практике более 40 лет [6]. Недостаток ниаци-на в организме человека приводит к развитию пеллагры, для которой характерны, в том числе, за-
медленное мышление, потеря памяти. Немногочисленные исследования показывают положительный эффект применения никотиновой кислоты для предупреждения когнитивного дефицита при БА [10].
Цель работы: исследовать влияние никотиновой кислоты на выживаемость и нейродегенерацию Drosophila melanogaster с гиперэкспрессией гена АРР человека.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы трасгенные линии Drosophila melanogaster: UAS-APP, содержащая ген АРР человека; UAS-APP-Swedish, содержащая ген АРР человека с мутацией Swedish, приводящей к наследственной форме болезни Альцгеймера; UAS-BACE, содержащая ген Р-секретазы человека. Экспрессия трансгенов была проведена в системе UAS-GAL4. В качестве активатора транскрипции был использован драйвер GAL4-elavc155, обеспечивающий экспрессию генов в нервных клетках Drosophila. Линии были получены из коллекции Drosophila Bloomington Stock Center, США. Мухи содержались на стандартной дрожжевой среде при температуре 25 оС при 12-часовом световом дне. Никотиновую кислоту в концентрации 10 мМ добавляли в корм животным.
Для оценки выживаемости мух помещали в пробирки по 30 штук. Каждые 2-е суток их пересаживали на свежий корм. Одновременно производили подсчет умерших особей. В каждом эксперименте было не менее 300 мух. Каждый из вариантов эксперимента включал в себя 3 повтора.
Уровень нейродегенерации определяли на парафиновых срезах мозга, как описано ранее [13].
Статистический анализ проводили с помощью-программы «ANOVA» и критерия множественных сравнений Тьюки — Крамера (программа «Kyplot»). Статистическая значимость учитывалась при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза нейродегенеративных заболеваний, невозможно без создания моделей заболевания на животных, так как в исследованиях, проводимых in vitro, не всегда возможно воспроизвести условия целого организма. В последнее время в качестве модели для изучения нейродегенеративных заболеваний, в частности, БА, используют Drosophila melanogaster [4]. Это во многом связано с существованием эволюционного консерватизма между генами человека и дрозофилы. Кроме того, Drosophila имеет хорошо развитую центральную нервную систему и поведенческие реакции (обучение и память), что позволяет исследовать ранние эффекты, связанные с нарушением поведения
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
J и
1 3
■ I
\
л V
11 Vl
-I J b 7 к ■! I] Id iP II JH H II J' II Jn IS jr H -41
а
Рис. 1. Влияние никотиновой кислоты на выживаемость трансгенных мух: а - кривые выживаемости Drosophila melanogasteг; 1 - е1ау; АРР/ВАСЕ; 2 - е1ау; АРР/ВАСЕ + ниацин; 3 - е1ау; BACE/APP-Sw; 4 - е1ау; ВАСЕ/АРР-Sw + ниацин; 5 - е1ау; АРР; 6 - е1ау; АРР + ниацин; 7 - е1ау; APP-Sw; 8 - е1ау; APP-Sw + ниацин; б - влияние никотиновой кислоты на 50 %-ю выживаемость трансгенных Drosophila melanogasteг. По оси абцисс - генотипы линий: 1 - е1ау, АРР; 2 - е1ау, АРР^Ш; 3 - е1ау, АРР/ВАСЕ, 4 - е1ау, ВАСЕ/АРР^Ш. Различия средних величин статистически достоверны (р35,05)
и памяти при экспрессии мутантных генов, вызывающих наследственные формы БА. В то же время Drosophila является простой и удобной моделью для изучения терапевтических свойств различных соединений [11].
Ген Appl Drosophila melanogaster, ортолог гена АРР человека, не содержит последовательности, кодирующей лр. В то же время у Drosophila представлены все компоненты белкового комплекса, ответственного за активность у-секретазы, но отсутствует или является необычайно низкой активность Р-секретазы. Поэтому для генерации Ар необходимы двойные трансгены, экспрессирующие BACE и полноразмерный АРР человека. Это обстоятельство дает возможность разделения эффектов АРР и Ар, при котором достаточно сравнить трансгены АРР, содержащие и не содержащие BACE.
Мы провели экспрессию гена АРР человека, гена АРР с мутацией Swedish, а также одновременную экспрессию АРР^РР-Sw) и ВАСЕ в нервных клетках Drosophila и проанализировали кривые выживаемости этих мух. Полученные данные показаны на рис. 1. Продолжительность жизни мух с гиперэкспрессией АРР(АРР-Sw), а также совместно АР-Р^РР-Sw) и BACE не имела больших различий. Мы не увидели существенного увеличения продолжительности жизни при кормлении мух никотиновой кислотой. В то же время при кормлении никотиновой кислотой наблюдалось изменение формы кривых выживаемости, а именно — появление «плеча», что свидетельствует об уменьшении гибели молодых мух. Кроме того, во всех исследованных
линиях мы наблюдали достоверное увеличение 50 %-й выживаемости: в линиях е1ау; АРР и е1ау; АРР-Sw - на 18-30 %, а в линиях е1ау; АРР/ВАСЕ и е1ау; ВАСЕ/АРР^ - на 18-23,5 % соответственно. В то же время мы не наблюдали различий между мухами с гиперэкспрессией АРР(АРР-Sw), а также совместно АРР(АРР^) и ВАСЕ.
При гиперэкспрессии гена АРР человека в нервных клетках Drosophila на 15-й день жизни животных наблюдалась нейродегенерация в мозге, которая проявлялась в виде полостей различного диаметра и увеличивалась с возрастом [13]. На рис. 2
Рис. 2. Влияние никотиновой кислоты на уровень нейродегенерации в мозге мух с гиперэкспрессией АРР: по оси ординат -процент нейродегенерации; по оси аб-цисс - генотипы линий: 1 - е1ау; АРР; 2 - е1ау; АРР^; 3 - е1ау; АРР/ВАСЕ; 4 - е1ау; BACE/APP-Sw. Различия средних величин по отношению к контролю статистически достоверны (р35,05)
приведены данные об уровне нейродегенерации в мозге мух через 30 дней после начала эксперимента. Из рисунка следует, что площадь вакуолей в ней-ропиле центрального мозга и оптических долях достоверно ниже в опыте, чем в контроле. В линиях elav; APP/BACE и elav; BACE/APP-Sw уровень ней-родегенерации снизился на 27 — 37 %, а в линиях elav; APP и elav; APP-Sw - на 40-45 %.
Таким образом, применение никотиновой кислоты значительно повышало 50 %-ю выживаемость и несколько увеличивало продолжительность жизни. Наличие «плеча» на кривой выживаемости подопытных животных говорит об эффективности используемого препарата. Оно свидетельствует об улучшении качества жизни животного и дает возможность использования дополнительной терапии в этот временной промежуток. Снижение уровня нейродегенерации у исследованных линий дрозофилы подтверждает нейропротекторные свойства никотиновой кислоты. Следует отметить, что имеющиеся в литературе данные о терапевтических свойствах ниацина в основном касаются его применения для профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний [8], и лишь несколько исследований посвящены возможности его использования для лечения когнитивных нарушений, в частности, при БА [9, 10]. В то же время большое количество работ посвящено никотинамиду. Механизм действия никотинамида, как полагают, обусловлен его свойством ингибировать белки сиртуи-ны, которые являются гистоновыми деацетилаза-ми. Нейропротекторные свойства ингибиторов деацетилаз гистонов показаны на моделях БА [12], рассеянного склероза [1], ишемического инсульта [7] и при травмах мозга различной природы [3].
Исследования, проведенные на модели болезни Паркинсона на Drosophila melanogaster, показали, что добавление больших доз никотинамида в пищу уменьшает окислительно-восстановительный стресс и улучшает моторные функции животных [5]. Полученные нами данные показывают нейропротек-торный эффект никотиновый кислоты на модели БА Drosophila melanogaster. Мы полагаем, что в его основе также лежит снижение окислительно-восстановительного стресса, развитие которого сопровождает БА. Хотя полученные результаты должны быть подкреплены данными по использованию никотиновой кислоты на моделях нейро-дегенеративных заболеваний, в частности, БА, на других животных, мы предполагаем, что использование ниацина может способствовать снижению нейродегенеративных изменений при БА.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gray S. G., Dangond F. Rationale for the use of histone deacetylase inhibitors as a dual therapeutic modality in multiple sclerosis // Epigenetics. - 2006. № 1 (2). - Р. 67-75.
2. Haass C., Schlossmacher M. G., Hung A. Y. et al. Amyloid beta-peptide is produced by cultured cells during normal metabolism // Nature. - 1992. - № 359. -Р. 322-325.
3. Hoane M. R., Tan A. A., Pierce J. L. et al. Nicotinamide treatment reduces behavioral impairments and provides cortical protection after fluid percussion injury in the rat // J. Neurotrauma. - 2006. - № 23 (10). - Р. 1535-1548.
4. Jeibmann A., Paulus W. Drosophila melanogaster as a Model Organism of Brain Diseases.// Int. J. Mol. Sci. - 2009. - № 10. -Р. 407-440.
5. Jia H., Li X., Gao H. et al. High doses of nicotinamide prevent oxidative mitochondrial dysfunction in a cellular model and improve motor deficit in a Drosophila model of Parkinson's disease // J. Neurosci. Res. - 2008. - №86 (9). -Р. 2083-2090.
6. Knip M., Douek I. F., Moore W. P. et al. European Nicotinamide Diabetes Intervention Trial Group. Safety of high-dose nicotinamide: a review // Diabetologia. - 2000. - № 43 (11). -Р. 1337-45.
7. Liu D., Gharavi R., Pitta M. et al. Nicotinamide Prevents NAD+ Depletion and Protects Neurons Against Excitotoxicity and Cerebral Ischemia: NAD+ Consumption by SIRT1 may Endanger Energetically Compromised Neurons // Neuromo-lecular Med. - 2009. - № 11 (1). - Р. 28-42.
8. MacKayD., Hathcock J., GuarneriE. Niacin: chemical forms, bioavailability, and health effects // Nutr. Rev. - 2012. -№ 70 (6). - Р. 357-366.
9. Morris M. C., Evans D. A., Bienias J. L. et al. Dietary niacin and the risk of incident Alzheimer's disease and of cognitive decline // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. - 2004. - № 75 (8). - Р. 1093-1099.
10. Morris M. C., Schneider J. A., Tangney C. C. Thoughts on B-vitamins and dementia // J. Alzheimers. Dis. - 2006. - № 9 (4). - Р. 429-433.
11. Pandey U. B., Nichols C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery // Pharmacol. Rev. - 2011. - № 63 (2). -Р. 411-436.
12. Ricobaraza A., Cuadrado-TejedorM., Perez-Mediavilla A. et al. Phenylbutyrate Ameliorates Cognitive Deficit and Reduces Tau Pathology in an Alzheimer's Disease Mouse Model // Neuropsychopharmacology. - 2009. - № 34. -P. 1721 - 1732.
13. Sarantseva S., Timoshenko S., Bolshakova O. et al. Apolipoprotein E-mimetics inhibit neurodegeneration and restore cognitive functions in a transgenic Drosophila model of Alzheimer's disease // PLoS One. - 2009. - № 4 (12). -P. 8191.
РЕЗЮМЕ
О. И. Большакова, Д. И. Родин,, С. И. Тимошенко, Е. М. Латыпова, С. В. Саранцева
Влияние никотиновой кислоты на выживаемость и нейро-дегенерацию в мозге трансгенных Drosophila melanogaster с гиперэкспрессией гена АРР человека
На трансгенных линиях Drosophila melanogaster, воспроизводящих основные нейроморфологические признаки болезни Альцгеймера, исследованы нейропротекторные свойства никотиновой кислоты. Показано, что никотиновая кислота увеличила выживаемость всех исследованных линий и снизила уровень нейродегенерации в мозге 30-дневных мух.
Ключевые слова: никотиновая кислота, дрозофила, болезнь Альцгеймера.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
SUMMARY
O. I. Bolshakova, D. I. Rodin, S. I. Timoshenko, E. M. Latypova, S. V. Sarantseva
Effect of nicotinic acid on the survival rate, and neurodegeneration of transgenic Drosophila melanogasterwith overexpression of human APP gene
Transgenic Drosophila melanogaster lines modeling the main neuromorphological markers of Alzheimer's disease were used to study the neuroprotective properties of nicotinic acid. Thirty days old flies treated with nicotinic acid showed better survival rate and reduced neurodegeneration.
Key words: nicotinic acid, Drosophila melanogaster, Alzheimer's disease.
© В. Н. Очколяс, 2013 г.
УДК [616.83]-005.1-06:616.831.31-009.24]-08.739.6
В. Н. Очколяс
ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИИ AMPA-РЕЦЕПТОРОВ ГЛЮТА-МАТА ПРИ УЛУЧШЕНИИ МОЗГОВОГО КРОВОТОКА В БАССЕЙНЕ ВНУТРЕННЕЙ СОННОЙ АРТЕРИИ У БОЛЬНЫХ С ПОСТИНСУЛЬТНОЙ ЭПИЛЕПСИЕЙ
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
Снижение мозгового кровотока при острой церебральной ишемии вследствие стеноза или окклюзии брахиоцефальных артерий при отсутствии структурных и функциональных механизмов компенсации мозгового кровотока приводит к функциональной и аноксической деполяризации нейронов в пораженном сосудистом бассейне [7]. Основным патогенетическим механизмом формирования ишемического очага при критическом снижении мозгового кровотока является феномен эксайтоток-сичности [15]. Данный патогенетический механизм реализуется через глутамат-кальциевый каскад: избыточное высвобождение глутамата из окончаний ишемизированных нейронов в межклеточное пространство и синаптическую щель приводит к активации и последующей альтерации NMDA-(N-methyl-D-aspartate) и AMPA- (a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) рецепторов глютамата [9, 11].
Согласно современным представлениям о механизмах эпилептогенеза, в основе эпилептического разряда лежит формирование пароксизмального деполяризационного сдвига (ПДС) мембранного потенциала [13]. Большая роль в формировании ПДС отводится ионным каналам натрия и кальция АМРА-рецепторов глютамата [1, 2, 4, 14].
По данным аналитических работ, оперирующих большим количеством клинических наблюдений, у лиц старше 60 лет развитие эпилептических припадков в 30 % случаев связано с нарушением мозгового кровообращения [10, 12]. Частота встречаемости постинсультной эпилепсии составляет от 4,12 до 9,8 % [5, 6].
Целью исследования является изучение особенностей альтерации и темпа восстановления AMPA-рецепторов глютамата у больных с постинсультной эпилепсией в условиях улучшения кровотока в бассейне внутренней сонной артерии (ВСА).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обследованы 92 больных с ишемической болезнью головного мозга, оперированных по поводу гемодинамически значимых стенозов ВСА в отделении сердечно-сосудистой хирургии городской больницы № 26 Санкт-Петербурга. Мужчин было 70 (76,1 %), женщин -22 (23,9 %). Возраст больных варьировал от 36 до 74 лет, средний возраст — 58,5±8,1 года. Исследуемую группу составили 8 (8,7 %) больных, в клинической картине заболевания которых регистрировались эпилептические припадки, контрольную — 84 (91,3 %) больных, у которых эпилептических припадков не наблюдалось.
Больные обследованы в рамках диагностического комплекса, включающего оценку соматического и неврологического статуса (n = 92), КТ (n = 50), МРТ с МР-ангиографией (n = 42), УЗДГ с определением параметров цереброваскулярной реактивности (n = 92), дуплексное сканирование (n = 38), ЭЭГ (n = 42), церебральную ангиографию (n = 92).
Больным была произведена каротидная эндар-терэктомия (КЭАЭ) по классической и эверзион-ной методике [8]. Время пережатия ВСА составило 35,42 ±0,69 мин при классической КЭАЭ и 33,82±0,63 мин при эверзионной КЭАЭ.
Достоверных различий в группах по полу, возрасту, стороне поражения, тактике и технике оперативных вмешательств не выявлено.
В качестве оценки степени альтерации AMPA-рецепторов глютамата использован иммунофер-ментный метод полуколичественного определения уровня аутоантител в периферической крови (ААТ) к GluR1-субъединице AMPA-рецепторов (GluR1) —
