CC BY
28
УДК 611-013.7/.8:612.014.1:616-003.725 DOI: 10.22141/2224-0713.8.86.2016.90913
ВАСИЛЬСВА 1.Г., ОЛЕКСЕНКО Н.П., ЧОПИК Н.Г., ЦЮБКО O.I., ГАЛАНТА О.С., СН1ЦАР H.A., ШУБА I.M. ДУ «1нститутнейрох/рургИim. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра/'ни», м. Ки/в, Укра/на
ВПЛИВ НЕЙРОТРОФ1ЧНИХ OAKTOPiB НА ПОПУЛЯЩЮ СЕРОТОЫНЕРПЧНИХ НЕЙРОЫВ N.RAPHE В УМОВАХ
КУЛЬТИВУВАННЯ
Резюме. Актуальнкть. Молекулярш мехашзми спещалзацП серотонiнергiчних нейрошв зi стовбурових i прогенторних нервових клтин вивчеш далеко не повшстю. Мета дослгдження — визначення найбльш ефективних нейроiндукторiв, що niдтримують життездатнкть та функцюнальну активнкть серотонiнергiчних нейрошв та ¡х детермнованих попередни^в. Як критери оцнки були обраш: експреая вiдповiдних гешв, загальний вмст серотошну та чисельшсть серотонiнергiчних нейрошв, в1зуал1зованихза допомогою гiстохiмiчно¡реакци. Матергали та методи. Робота була виконана на суспензшнш культурi клтин зони и.гарНв з використанням гiстохiмiчних методiв, iмуноферментного анал1зу та полiмеразно¡ ланцюговог реакци. Результати. Установлено, що БЛИГта ЙОГстимулюють збльшення чисельностi серотонiнергiчних нейрошв у дисоцтовант культурi в 1,6 та 2рази порiвняно з контрольними зразками. Додавання в культуральне середовище БЛИГ та ретиноевоI кислоти призводить до зростання вмисту серотошну в культуральному матерiалi. Експреая гена Икх 2.2, що е маркером мтотично-активних попередни^в серотонiнергiчних нейрошв, тдтримуеться за наявностiВЛИПзбыьшуеться тд впливом ЕОГ та ЕОЕЪ. Експреая гена Рв(1, що свiдчить про наявшсть детермтованих прогенiторiв серотонiнергiчних нейрошв, тдтримуеться вама до^джуваними факторами, за виключенням екзогенного серотошну. Експреая гена ТрН1, маркера початку синтезу серотошну, спостеркаеться тд впливом ГОГЪ, ЕОГ та ЙОГ. Висновки. Таким чином, нашi дан показали, що вищевказаш нейрондуктори впливають на р1зш фази серотошнгенезу i можуть бути використат для його регуляцп.
Ключовi слова: серотонн; серотоншергiчний нейрон; культура нервових клтин; ЙОГ; БЛИГ; ЕОГ; ГОГЪ; ретиноева кислота
ш
М1ЖНАРОДНИЙ НЕВРОПОГ1ЧНИЙ ЖУРНАЛ
international neurological journal |
международный неврологический журнал ОРИГШАЛЬШ ДОСЛЩЖЕННЯ /ORIGINAL RESEARCHES/
Вступ
В останне десятирiччя в нейробюлоги велика увага придшяеться порушенню генезу серотоншерпчно! системи у зв'язку з розширенням уявлення про ii значну роль у розвитку невролопчних та психiатричних хвороб, а також поширенням застосування фармаколопчних препарапв, що впливають на актившсть зворотного захвату серотошну. Не викликае сумшву, що в основi багатьох невролопчних розладiв лежать молекулярно-генетичш порушення метаболiзму серотоншерпчних нейрошв, що не дiагностуються морфолопчно, але
мають складт наслщки для оргашзму з огляду на ште-гративш функцй' серотошну як нейромедiатора та його рецептор1в [1]. Отже, створення принципово нових пiдходiв до лшування невролопчних хвороб неможливо без досконалого розумшня процешв серотошнгенезу та пошутв засобiв його корекцй' на молекулярно-генетич-ному рiвнi, одним з яких е клггинна терашя.
На сьогодш встановлеш основш каскади гешв, що регулюють генерацш серотоншерпчних нейрошв вщ прогенiторiв до термшальних стадiй диференцiювання [2—4]. Вiдомi деякi з трофiчних факторiв, що активують
© <^жнародний неврологiчний журнал», 2016 © «International Neurological Journal», 2016
© Видавець Заславський О.Ю., 2016 © Publisher Zaslavsky O.Yu., 2016
Для кореспонденцп: Васильева 1рина Георгпвна, Державна установа «1нститут нейрохiрурriT iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни», вул. Платона Майбороди, 32, м. КиТв, 04050, УкраТна; e-mail: redact@i.ua
For correspondence: Iryna Vasileva, State Institution «Institute of neurosurgery named after academician A.P. Romodanov of NAMS of Ukraine», Platona Mayborody st., 32, Kyiv, 04050, Ukraine; e-mail: redact@i.ua
експресiю вказаних вище гешв [5—7]. Щ данi створюють можливостi для здшснення направленого впливу на популяцш сeротонiнeргiчних нeйронiв як in vitro, так i in vivo.
Отже, в сучаснш науковiй практицi юнуе необхщ-нiсть дослiдити можливостi застосування нейрошдук-торiв для отримання in vitro популяци' фетальних клiтин, збагачено! сeротонiнeргiчними нейронами та ïx детермь нованими попередниками, здiйснюючи монiторинг сту-пеня зрiлостi на генетичному та молекулярному рiвняx.
Мета дослщження — визначення найбтьш ефектив-них нeйроiндукторiв, що здатнi здiйснювати направлене диференцшвання прогeнiторниx клiтин нервово! сис-теми по серотоншерпчному типу, а також шдтримувати життездатнiсть i функцiональну активнють серотоншер-гiчниx нeйронiв.
Матерiали та методи
Для культивування використовували суспензш не-рвових клiтин зони ядер шва фетального мозку щурiв стада Е16. Пiд час експериментального утримання ла-бораторних тварин манiпуляцiï, що з ними проводились, вщповщали протоколу комггету з медично! етики ДУ «1нститут нейрохирурги' iм. акад. А.П. Ромоданова» (№ 1 вiд 19.04.2013 р.), розробленому вщповщно до чинного законодавства.
Протягом першого тижня зразки культивували на сeрeдовищi 1гла (РАА, Австрш) iз додаванням 10% тер-мошактивовано! фетально! телячо! сироватки (РАА, Австрiя), збагаченому факторами EGF (epidermal growth factor) та FGFb (fibroblast growth factor) у концентраций 40 нг/мл (Sigma, США). З 8-ï по 14-ту добу культивування проводилося на сeрeдовищi 1гла (РАА, Авсщя) та 10% фетально! телячо!' сироватки (РАА, Авсщя) iз додаванням у рiзниx сeрiяx експерименту ретиноево!' кис-лоти (Sigma, США) у концентраций 1 мкМ, NGF (nerve growth factor) (Sigma, США) — 80 нг/мл, BDNF (brain derived neurotrophic factor) (Sigma, США) — 50 нг/мл та серотоншу креатинш сульфату (Janssen Chemica, Бельпя) — 75 мкМ. На 14-ту добу культуральш зразки фшсували для подальших дослiджeнь.
Вiзyaлiзaцiя cеpотонiнy в клiтинax здшснювалася за допомогою гicтоxiмiчноï реакцй' Фалька — Хшларпа. Пре-парати дослщжували за допомогою флyоpеcцентного мкро-скопа в cиcтемi IBAS 2000, здшснюючи пiдpaxyнок клiтин y 10 поляк зору кожного препарату Стaтиcтичнy о6ро6ку данж проводили з використанням критерш Стьюдента.
Доcлiдження piвня cеpотонiнy проводили методом конкурентного твердофазового iмyнофеpментного ана-лiзy з використанням дiaгноcтичного набору RE 59121 (IBL, Шмеччина). Поперед^ ацилювання зpaзкiв здш-снювали зпдно з iнcтpyкцieю до набору.
Дослщження експресй' генiв — pегyлятоpiв серо-тонiнгенезy — Nkx 2.2, Lmx1b, Pet1, Tph1, Tph2, Sert y культуральному мaтеpiaлi проводилося методом зворот-но-транскриптазно1 полiмеpaзноï ланцюгово!' реакцй'. Геномну ДНК (дезоксирибонуклешову кислоту) видь ляли з використанням нaбоpiв «ДНК-сорб В» (Amplisens, Роciя), РНК (рибонуклешову кислоту) — «РИБО-сорб» (Amplisens, Роciя). Реакцш зворотно!' транскрипцй' здш-снювали з використанням набору RevertAid™ First strand cDNA synthesis kit (Fermentas, Литва). Для визначення експресй' гешв Nkx 2.2, Lmx1b, Pet1, Tph1, Tph2, Sert були викоpиcтaнi cпецифiчнi пари пpaймеpiв [2—4]. Отpимaнi продукти aмплiфiкaцiï складалися з 374, 492, 109, 184, 117, 127 пар нуклеощддв (п.н.) вщповщно. Вiзyaлiзaцiя пpодyктiв амптфшацй' проводилася за допомогою елек-трофорезу в 2% агарозному гель
Результати
Метою першого етапу культивування було досяг-нення максимально!' кштинно!' експансй' за допомогою фaктоpiв-мiтогенiв EGF та FGFb iз зaпобiгaнням при цьому диференцшванню клiтин [7].
Спостереження за нативною культурою показали, що на цш стадй' клiтини збеpiгaють невелик! pозмipи та округлу форму без вщросттв. Вони xapaктеpизyютьcя зниженим piвнем серотоншу (табл. 1) та зникненням експресй' гешв Tph2 та Sert (рис. 1). До того ж значно шдсилкються експрешя гена Pet1 (рис. 1). Також у зраз-rax культурального мaтеpiaлy збеpiгaeтьcя екcпpеciя Nkx 2.2 (рис. 1).
Таблиця 1. Вмст серотон1нерпчних нейрон1в та серотон1ну в популяци клтин,
отриманих ¡з зони ядер шва
Група Bmíct живих кл^ин, % BMÍCT серотоншерпчних нейронiв у полi зору, % Bmíct cepoTOHiHy
нг/мл нг/млн клiтин
Контроль висхщний 82,0 t 2,6 5,08 t 1,12 1877t 154 37,50 t 2,85
Додавання мтогеыв EGF та FGFb 87,0 t 4,1 7,72 t 0,64 444 t 41 12,30 t 1,19
Контроль топя культивування 90,0 t 3,2 6,16 t 0,91 405 t 39 13,40 t 1,23
Додавання ретиноево'| кислоти 85,0 t 2,8 9,17 t 1,14 681t52* 19,30 t 1,71*
Додавання BDNF 89,0 t 3,2 9,88 t 1,06* 691t57* 21,30 t 1,92*
Додавання NGF 88,0 t 2,9 12,50 t 0,80* 385 t 27 12,40 t 0,97
Додавання серотонЫу 87,0 t 3,2 9,44 t 1,55 1333t 145* 40,64 t 4,30*
Прим'пка: * — P < 0,05.
На другому еташ для стимуляцп нейронального диференцшвання використовувалися нейроiндуктори: ретиноева кислота, БОМБ, КОБ, а також екзогенний серотонш. Темпи росту китинно! популяци при цьому рiзко зменшувалися. Шд впливом нейроiндукторiв клiтини змшювали форму та починали встановлювати контакти за допомогою аксонiв та дендритно'1 мереж (рис. 3).
1, 2 — ДНК, РНК гена Nkx 2.2 пд впливом ретиноевоÏ кислоти
3, 4 — ДНК, РНК гена Nkx 2.2 пд впливом EGF, FGFb
5, 6 — ДНК, РНК гена Nkx 2.2 пд впливом серотонну
7 — РНК гена Lmx 1 пд впливом ретиноевоÏ кислоти
8 — РНК гена Lmx 1 пд впливом EGF, FGFb
9 — РНК гена Lmx 1 пд впливом серотонну
10 — РНК гена Tph 1 пд впливом ретиноевоï кислоти
11 — РНК гена Tph 1 пд впливом EGF, FGFb
12 — РНК гена Tph 1 пд впливом серотонну
На пстолопчних препаратах, забарвлених за методикою Фалька — Хшларпа, спостерталися окремi клггини з флуоресцентними гранулами в цитоплазм^ найчастше в и периферийних зонах (рис. 3). Ми не вщм1чали флуоресценцп в аксонах та встановлення мiжклiтинних зв'язюв.
Анал1з експреси гешв показав, що порiвняно з фазою китинно! експанси в контрольних культурах дещо
13, 14 — ДНК, РНК гена Pet 1 пд впливом ретиноевоï кислоти
15, 16 — ДНК, РНК гена Pet 1 пд впливом EGF, FGFb 17, 18 — ДНК, РНК гена Pet 1 пд впливом серотонну
19 — РНК гена Tph 2 пд впливом ретиноевоï кислоти
20 — РНК гена Tph 2 пд впливом EGF, FGFb
21 — РНК гена Tph 2 п д впливом серотонну
22 — РНК гена Sert п д впливом ретиноевоï кислоти
23 — РНК гена Sert п д впливом EGF, FGFb
24 — РНК гена Sert п д впливом серотонну
М — маркер молекулярной маси (100-1000 п.н.)
13 14 15 16 17 18 19 20 М 21 22 23 24
Рисунок 1. Електрофореграма продукт1в ампл1ф1кацИгенв Nkx2.2 (374 п.н.), Lmxlb (492 п.н.), Pet1 (109 п.н.), Tph1 (184 п.н.), Tph2 (117п.н.), Sert (127п.н.) у суспензйнй культурiклтин
ядер шва щура
Рисунок2. Електрофореграма продукт'в ампл1ф1каци генв Nkx2.2 (374 п.н.), Lmxlb (492 п.н.), Pet1 (109 п.н.), Tph1 (184 п.н.), Tph2 (117п.н.), Sert (127п.н.) у суспензйнй культурi
клтин ядер шва щура
1, 2 — ДНК, РНК гена Pet1 контроль
3, 4 - ДНК, РНК гена Pet1 пД впливом BDNF
5, 6 - ДНК, РНК гена Pet1 пД впливом NGF
7 — РНК гена Tph2 контроль
8 — РНК гена Tph2 пд впливом BDNF
9 — РНК гена Tph2 пД впливом NGF
10 — РНК гена Sert контроль
11 — РНК гена Sert пД впливом BDNF
12 — РНК гена Sert пД впливом NGF
13 — РНК гена Tph1 контроль
14 — РНК гена Tph1 п Д впливом BDNF
15 — РНК гена Tph1 п Д впливом NGF 16, 17 — ДНК, РНК гена Nkx 2.2 контроль
18, 19 - ДНК, РНК гена Ыкх 2.2 пД впливом ВйЫГ 20, 21 - ДНК, РНК гена Ыкх 2.2 пД впливом ЫвГ
22 — РНК гена 1.тх1 контроль
23 — РНК гена 1.тх1 пд впливом ВОЫР
24 — РНК гена 1.тх1 пД впливом ЫОГ 25, 26 — ДНК, РНК гена Ыкх 2.2 контроль
27, 28 — ДНК, РНК гена Ыкх 2.2 п Д впливом ВйЫГ 29, 30 — ДНК, РНК гена Ыкх 2.2 п Д впливом ЫвГ
31 — РНК гена 1.тх1 контроль
32 — РНК гена 1.тх1 пД впливом ВйЫГ
33 — РНК гена 1.тх1 пД впливом ЫОГ
М — маркер молекулярноймаси (100-1000 п.н.)
знижуеться рiвень експреси Ккх 2.2 та зникае експресiя ТрЫ (рис. 2). Чисельнють кпiтин iз флуоресценцiею се-ротонiнергiчних гранул та вмiст самого нейромедiатора в культуральному матерiалi знаходяться на рiвнi, досяг-нутому за перюд клггинно! експанси (табл. 1).
Додавання БОМБ в культуральне середовище призводило до вiрогiдного збiльшення вмюту серото-нiнергiчних нейронiв в 1,6 раза (табл. 1). Збтьшення процентного вмюту серотоншерпчних нейронiв в цих серiях дослiдiв супроводжувались формуванням кль тинних агрегатiв чисельнiстю (5—10) клггин (рис. 3). На препаратах, забарвлених за методикою Фалька — Хт-ларпа, флуоресцентш гранули заповнюють периферичш та центральнi зони цитоплазми, iнодi спостерiгаючись
в аксонах та дендритах, яи в б1льшост1 нейрон1в, зали-шаються в1льними (рис. 3). Внесення BDNF призвело до в1ропдного шдвищення вм1сту серотон1ну в 1,7 раза в культуральному матер1ал1 (табл. 1). Дослщження експреси ген1в продемонструвало, що присутн1сть BDNF в культуральному середовищ1 зб1льшуе експрес1ю ген1в Pet 1 та Nkx 2.2 (рис. 2).
На в1дм1ну в1д впливу BDNF д1я NGF на серотош-нерг1чн1 нейрони в культур! е недостатньо вивченою, але зг1дно з нашими результатами, безперечно, заслуговуе на увагу. Додавання NGF до живильного середовища викликае в культуральн1й популяци зм1ни зовс1м шшого характеру пор1вняно з BDNF та контрольною групою. При значному в1рог1дному зб1льшенн1 вдв1ч1 вм1сту
Рисунок 3. Суспензйна культура ядер шва фетального мозку щура. Контроль. Реакця Фалька — Хлларпа: а) контроль (20 * 10); б) вплив ретиноево/ кислоти (20 * 10); в) вплив БйЫР (20 * 10); г) вплив екзогенного серотонiну (10 * 10)
нейроклггин, що мютять гранули серотоншу в цитоплаз-Mi (табл. 1, рис. 3), його загальний bmîct залишаеться на piBHi контрольних значень (табл. 1).
Генетичний аналiз культурального матерiалу пiд впливом NGF продемонстрував повне зникнення експресй' гена Nkx 2.2 i значне зниження експресй' гена Petl (рис. 2). Проте з'являеться експрешя гена Tphl.
За наявност ретиноево!' кислоти в первиннш куль-турi ядер шва порiвняно з контрольними зразками нами було вiдмiчено зникнення експресй' гена Nkx 2.2, тодi як експресiя гена Petl зберйалася на тому ж р!вш (рис. 1). Загальний вмют серотонiну та чисельнiсть кл1тин 1з флуоресцентними гранулами в цитоплазмi в культу-ральному матерiалi зростають тд впливом ретиноево!' кислоти в 1,7 та 1,5 раза вщповщно (табл. 1).
Застосування екзогенного серотонiну як агента ди-ференцiювання в культур! також сприяе збтьшенню чисельностi вщповщних нейронiв в 1,5 раза (табл. 1). На препаратах, забарвлених за методикою Фалька — Хшлар-па, нейрони з вщповщними флуоресцентними гранулами розташоваш поодинц1, але вiдбуваеться штенсивне фор-мування аксонiв i дендритно!' мереж^ що часто формують розгалужеш i навiть замкненi структури. Спостерйаеться перемiщення флуоресценци' з цитоплазми в зону вщрос-тюв (рис. 3), що свщчить про формування вщповщних синапшв i активний транспорт нейромедiатора.
За даними iмуноферментного аналiзу, додавання се-ротон1ну стимулювало його захоплення та накопичення в клiтинах суспензшно1 культури, внаслщок чого його вмют у культуральному матерiалi зростае майже до р1вня ви-схщного контролю (табл. 1). На електрофореграмах майже зникае експрешя гена Pet1 i повнютю вщсутня експрешя гена Tph1, але наявна експрешя гена Nkx 2.2 (рис. 1).
Обговорення
Згщно з нашими даними, при переходi в умови сус-пензiйноï культури популящя нейроклiтин ядер шва втрачае високодиференцiйованi зр1л1 серотонiнергiчнi нейрони, про що свщчать зниження р1вня серотоншу та зникнення експресй' генiв Tph та Sert. Проте акти-вуеться пул детермшованих попередникiв, що характеризуются експрешею Pet1 та Nkx 2.2, внаслщок чого загальний вмют серотоншерпчних нейронiв у популяцй' залишаеться на тому ж р1вш в процентному вщношенш до 1нших клггин (табл. 1). Цей процес е вщображенням регенеративно!' пластичностi, що властива нервовш системi на раннiх етапах розвитку.
пор1вняння показникiв висх1дного контролю з контрольною групою п1сля двотижневого культивуван-ня показало, що в культуральних умовах в основному пiдтримуеться життедiяльнiсть уже сформованих серотоншерпчних нейрошв, у тому числ1 i тих, генерацiя яких вщбулася на попереднiй фазi клггинно'].' експанси', внаслiдок чого ix процентний вмют лишаеться не-зм1нним в умовах зростання загально'1' чисельностi клггинно'].' популяцй'. Вiдбуваеться гальмування под1лу мгготично-активних прогенiторiв та генераци' нових серотоншерпчних нейрошв. Отже, стандартних культу-ральних умов достатньо для реалiзацiï генетично'1' про-
грами диференцiювання серотонiнергiчних нейрошв з ix детермiнованими попередниками.
Генетичний аналiз показав, що попередня активащя прогенiторниx кпiтин у фазi стимуляци розмноження in vitro створюе сприятливi умови для стимуляцii серо-тоншгенезу, оскiльки зростае пул клiтин, чутливих до ix впливу.
Стимулюючий вплив BDNF на формування серотоншерпчних нейронiв в умовах in vitro був установлений ранiше i описаний у роботах багатьох дослщникгв [5—7]. Нашi данi дозволили деталГзувати цей ефект iз точки зору генетично'1' регуляцii. Отриманi нами данi Гмуно-ферментного та генетичного аналГзу свщчать на користь того, що стимулюючий вплив BDNF здшснюеться за рахунок пщтримки направлено'] активаци прогенiторниx клггин серотоншгенезу.
Також отриманi нами даш дозволяють висловити припущення, що тд впливом NGF гальмуеться процес збгльшення пулу прогенiторiв серотонiнгенезу i вони переходять у наступний етап активного синтезу ней-ромедiатора, про що свщчить поява експресй гена Tph.
Схожим способом виявляеться в даних умовах ней-рошдуктивна дГя ретиноево'] кислоти. Вщбуваються гальмування раннix мiтотично-активниx попередникiв серотоншогенезу та пiдтримка пулу бгльш диференщ-йованих прогенiторiв серотонiнгенезу.
АналГз даних з експресй гешв показав, що наявнють екзогенного серотоншу сприймаеться як гальмГвний сигнал детермшованими попередниками, що перебува-ють на кшцевих етапах диференцшвання. Разом Гз тим екзогенний серотонш здшснюе трофГчну пгдтримку ран-нгх прогенгторГв, про що свщчить експрешя гена Nkx 2.2.
З лггературних джерел вщомо, що 5-гщрокситрип-тофан на раншх етапах розвитку серотоншерпчних нейрошв може функщонувати як регуляцшний сигнал, його автокринна секрецгя стимулюе серотоншерпчне диференцшвння [8]. Агонют серотоншу 8-гщрокш-2-[дь(н-прошл)амшо]тетралш, так само як i сам серото-нш, зв'язуючись Гз рецепторами, шщше та пщсилюе власний синтез [6].
НашГ даш пщтверджують, що серотонш може здш-снювати несинаптичний вплив на клггани на раншх стадГях розвитку нервово' системи, виконуючи не лише нейромедГаторш, але й нейротрофГчш функци. Щ ефекти опосередковаш через паракринну, дифуз-ну даю на вщмшу вщ бшьш направленого швидкого впливу в синапсах. Власне це е еволюцшно раннш тип нейромедГаторно'' передач^ що повторюеться на по-чаткових етапах онтогенезу, який вщомий i для шших нейротрансмптерГв. Разом Гз тим детальний аналГз наших результапв показав, що дГя серотоншу, внесеного екзогенно, залежить вщ фази розвитку клгган — по-передниыв серотоншерпчного типу — вщ стимуляци найбгльш раншх мГтотично-активних прогенгторГв до гальмування бгльш детермшованих.
Таким чином, дослщжеш нами нейрошдуктори впливають на рГзш фази серотоншгенезу, що може бути використано для стимуляци направлено'' регенераци серотоншерпчно'1' системи.
Висновки
1. Активна стимулящя регенеративних процешв се-ротоншерпчно! системи, пщтверджена молекулярно-ге-нетичними методами, спостерiгалася нами за наявност БОМБ, КОБ, БОБ, БОБЬ, ретиноево! кислоти та екзо-генного серотоншу. При цьому пiдтримка життедiяль-ностi та функцюнально! активностi серотоншерпчних нейронiв вiдбувалася рiзними шляхами.
2. Популящя нервових клiтин, отримана у виглядi суспензшно! культури iз зони ядер шва фетального головного мозку щурiв, вiдповiдае на стимулюючий вплив БОМБ та КОБ збiльшенням процентного вмюту серотонiнергiчних нейронiв порiвняно з контролем в 1,6 та 2 рази вщповщно.
3. Загальний вмют серотонiну в цьому культурально-му матер1ал1 за даними iмуноферментного аналiзу зрос-тае в 1,7 раза тд впливом БОМБ та ретиноево! кислоти.
4. Експрешя гена Мкх 2.2, що е маркером мгготич-но-активних попередникiв серотонiнергiчних нейро-шв, пiдтримуеться за наявностi БОМБ та зростае тд впливом факторiв-мiтогенiв БОБ та БОБЬ. Експресiя гена Рей, що свщчить про наявнiсть детермшованих попередникiв серотонiнергiчних нейронiв, за нашими даними, шдтримуеться всiма дослiдженими трофiчними факторами, за виключенням екзогенного серотоншу. Експрешя гена ТрЫ, що свщчить про формування мо-лодих серотоншерпчних нейрошв i е початковим етапом синтезу нейромедiатора, спостерiгаеться пiд впливом БОБЬ, БОБ та КОБ.
5. Результати роботи дозволять у перспективi ство-рити протокол отримання популяци серотонiнергiчних клiтин потрiбного ступеня сформованосп — вiд про-генiторiв до зрших нейронiв — для застосування як дослщницько! моделi, а також вдосконалення методiв клиинно! терапи для регенерацп неврологiчних по-шкоджень.
Конфлiкт iHTepeciB. Автори заявляють про вщ-сутшсть конфлiкту iнтересiв при пiдготовцi дано! статп.
Список лператури
1. James A. Noggin on heaven's door: a factor that promotes the selective production of serotonergic neurons from murine embryonic stem cells and induces pluropotentstem cells/A. James, A. Wascek// Journal of neurochemistry. — 2012. — Vol. 122, № 1. — Р. 1-3.
2. Daws L.C. Ontogeny and regulation of serotonin transporter: providing insights into human disorders / L.C. Daws, G.G. Gould// Pharmacol. Ther. — 2010. — V. 131. — С. 61-79.
3. Abnormal expression of dopamine and serotonin transporters associated with the pathophysiologic mechanism of Tourette syndrome /L. Jijun, L. Zaiwang, L. Anyuan [et al.]//Neuro India. — 2010. — Vol. 58(4). — P. 523-529.
4. Serotonin availability in rat colon is reduced during a Western diet model of obesity/ R.L. Bertrand, S. Senadheera, A. Tanoto [et al.]//American Journal of Physiology. — 2012. — Vol. 303. — Р. 424-434.
5. Stem cells expanded from human embryonic hindbrain stably retain regional specification and high neurogenic potency / J. Tailor, R.. Kittappa, K. Leto [et al.]//J. Neurosci. — 2013. — Vol. 33(30). — P. 12407-22.
6. Daubert E.A. Serotonin: a regulator of neuronal morphology and circuitry / E.A. Daubert, B.G. Condron // Trends Neurosci. — 2010. — Vol. 33. — Р. 424-434.
7. Association of functional polymorphism from BDNF andsero-tonin-related genes with depressive symptoms after a medical stressor in older adults/K.S. Rawson, D. Dixon, P. Nowotny [et al.]// PLoS One. — 2015. — Vol. 10(3). — e0120685. — doi 10.1371.
8. A simplified method to generate serotoninergic neurons from mouse embryonic stem and inducedpluripotent stem cells / T. Shi-mada, Y. Takai, K. Shinohara [et al.]// J. Neurochem. — 2012. — Vol. 122(1). — Р. 81-93.
Отримано 01.10.2016 ■
Васильева И.Г., Олексенко Н.П., Чопик Н.Г., Цюбко О.И., Галанта Е.С., Сницар Н.Д., Шуба И.Н. ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины», г. Киев, Украина
ВЛИЯНИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ПОПУЛЯЦИЮ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ N.RAPHE
В УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Резюме. Актуальность. Молекулярные механизмы специализации серотонинергических нейронов из стволовых и прогениторных нервных клеток изучены далеко не полностью. Цель исследования — определение наиболее эффективных нейроиндукторов, поддерживающих жизнеспособность и функциональную активность серотонинергических нейронов и их детерминированных предшественников. В качестве критериев оценки были выбраны: экспрессия соответствующих генов, общее содержание серотонина и количество серотонинергических нейронов, визуализированных с помощью гистохимической реакции. Материалы и методы. Работа была проведена на суспензионной культуре клеток зоны п.гарИе с использованием гистохимических методов, иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции. Результаты. Установлено, что БОКБ и КОБ стимулируют увеличение количества серотонинергических нейронов в диссоциированной культуре в 1,6 и 2 раза по сравнению с контрольными образцами.
Добавление в культуральную среду БОМБ и ретиноевой кислоты приводит к возрастанию содержания серотонина в культуральном материале. Экспрессия гена Мкх 2.2, который является маркером митотически-активных предшественников серотонинергических нейронов, поддерживается при наличии ББМБ и увеличивается под влиянием БОБ и БОБЬ. Экспрессия гена РеП, свидетельствующая о наличии детерминированных прогениторов серотонинергических нейронов, поддерживается всеми исследуемыми факторами, за исключением экзогенного серотонина. Экспрессия гена ТрЫ, маркера начала синтеза серотонина, наблюдается под воздействием БОБЬ, БОБ и МОБ. Выводы. Таким образом, наши данные показали, что перечисленные нейроиндукторы влияют на различные фазы серотонингенеза и могут быть использованы для его регуляции. Ключевые слова: серотонин; серотонинергический нейрон; культура нервных клеток; МОБ; ББМБ; БОБ; БОБЬ; ретиноевая кислота
I.G. Vasileva, N.P. Oleksenko, N.G. Chopic, O.I. Tsybko, O.S. Galanta, N.D. Snitsar, I.N. Shuba
State Institution «Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine», Kyiv, Ukraine
THE NEUROTROPHIC FACTORS EFFECTS ON CULTURING N.RAPHE SEROTONINERGIC NEURONS POPULATION
Abstract. Background. Serotonergic neurons of n.raphe play a key role in the modulation of behavior, and their dysfunction is associated with severe neurological and psychiatric disorders. However, the molecular mechanisms underlying the differentiation of the nerve stem and progenitor cells and the specification of the serotonergic phenotype are not fully understood. The aim of our study was to determine the most effective neuroinductors to support the survivability and functional activity of serotonergic neurons and their determined precursors. Materials and methods. The research was carried out on the suspension culture of nerve cells, obtained from the n.raphe zone of fetal rat brain E16 gestation. Neuroinductors epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGFb), nerve growth factor (NGF), brain derived neurotrophic factor (BDNF), retinoic acid and exogenic serotonin were tested in our study to determine their role in the serotonergic neurons differentiation. Such criteria were taking into account: the relevant genes expression (Nkx 2.2, Lmx 1b, Pet 1, Tph 1, Tph 2 and Sert), total serotonin content, and serotonergic neurons amount. Methods of reverse transcription polymerase chain reaction, enzyme-linked immunosorbent assay and hystochemi-cal Falck-Hillarp reaction were used in our work. Results. Our data demonstrated that cell population, received from the n.raphe zone of fetal rat brain E16 gestation, consists of all types of cells, taking part in the serotoninogenesis: from early mitotically-active progenitors to mature serotonergic neurons. So, it can be used as an experimental model of the neuroinductor activity testing in vitro. It is confirmed that standard culture condition supported already formed serotonergic
neurons, but their generation from determined progenitors doesn't take place. We have observed that in phase of cell expansion the presence of EGF and FGFb in n.raphe suspension culture stimulated the pool of early progenitors of serotoninogenesis. Another neuroinductors realized their effects in different ways. It has been established, that BDNF and NGF stimulated the serotonergic neurons amount increasing in the dissociated culture by 1.6 and 2 times compared with the control slices. Adding BDNF and retinoic acid leads to increased total serotonin content in the culture material. The Nkx2.2 genes expression, which is the marker of the mitosis-active serotonergic progenitors, is supported by BDNF and increased in the presence of EGF and FGFb. The gene Pet1 expression indicating the presence of serotonergic determined precursors is supported by all using factors, except exogenous serotonin. The gene Tph1 expression, marker of serotonin synthesis start, was observed in the presence of FGFb, EGF and NGF. Adding exogenic serotonin stimulated the earliest progenitors of serotogenesis, marked by the gene Nkx 2.2 expression. At the same time, it suppressed determined progenitors marked by Pet 1 and can be accumulated in the nerve cells of culture population by the reuptake way. Conclusions. So, our data show that neuroinductors, listed here, influence different phases of serotoninogenesis from the progenitor cell expansion to the serotonin synthesis in mature neurons and can be used for its regulation.
Keywords: serotonin; serotonergic neuron; nerve cell culture; nerve growth factor; brain derived neurotrophic factor; epidermal growth factor; fibroblast growth factor; retinoic acid
