CC BY
31
тттт
Новости клеточных технологий
Влияние неспецифических ингибиторов ДНК-метилтрансферазы и гистоновой деацетилазы на эффективность репрограммирования эмбриональных фибробластов мышей
Стволовые клетки, специфичные для определенного индивидуума (iPS-клетки) могут быть созданы путем репрограммирования соматических клеток. Не так давно передовые исследования японских и американских ученых показали, что эктопическая экспрессия лишь четырех факторов транскрипции Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc репрограм-мирует мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ) в ЭСК-подобные клетки [1, 2]. Аналогичные эксперименты оказались успешными и с человеческими клетками [3, 4], что позволяет предположить универсальность механизмов репрограммирования клеток. Однако, репрограммирование с применением ретровирусов оказалось медленным и малоэффективным процессом. Кроме того, генетическая трансформация с помощью экзогенных генов, в особенности, онкогенов, таких как c-Myc и Klf4 и использование ретровирусной системы доставки значительно осложняют будущее терапевтическое применение этого метода. Поэтому необходима разработка новых протоколов получения индивидуальных линий репрограммированных клеток, достаточно эффективных и потенциально подходящих для использования в клинике.
Предыдущие исследования показали, что ингибитор гистоновой деацетилазы (histone deacetylase, HDAC) и деметилирование ДНК оказывают положительное влияние на эффективность репрограммирования при переносе ядра соматической клетки [5]. Этот факт натолкнул некоторых исследователей на мысль о том, что неспецифические эпигенетические регуляторы могут увеличить эффективность получения iPS-клеток.
Группа под руководством D. Melton опубликовала работу, результаты которой свидетельствуют о том, что ингибиторы ДНК-метилтрансферазы и гистоновой деацетила-зы повышают эффективность репрограммирования в десятки и сотни раз на примере трансгенных Oct4-GFP МЭФ.
Используя трансген Oct4-GFP исследователи проверили как выбранные небольшие молекулы влияют на модификацию хроматина и репрограммирование. Эктопическая экспрессия четырех факторов транскрипции (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) в трансгенных МЭФ Oct4-GFP индуцировала экспрессию GFP у 0,03±0,02% клеток (на 7 сут. после введения векторов). Процент GFP+ клеток оставался одинаковым вплоть до 13 сут. Инкубация трансфецированных МЭФ с 5-азацитидином, ингибитором ДНК-метилтрансферазы, увеличивало количество GFP+ клеток примерно в 10 раз (до 0,50±0,06%). При этом действие этого агента было дозозависимым.
Дексаметазон, синтетический глюкокортикоид, увеличивал воздействие 5-азацитидина в 2,6 раза (при использовании в
сочетании). При этом только дексаметазон не оказывал такого воздействия. Три известных ингибитора HDAC, субе-роиланилид гидроксамовой кислоты (SAHA), трихостатин A (TSA) и вальпроевая кислота (VPA) также значительно увеличивали эффективность репрограммирования. При этом действие VPA было наибольшим. Так воздействие на МЭФ VPA в течение 1 нед. позволило добиться получения 11,8±2,2% GFP+ клеток, что в 4100 раз превышает контрольные показатели. Вещество также проявляет дозозависимый эффект. Возможно, что такая значительная разница в эффективности исследованных препаратов объясняется тем, что все они (кроме VPA) являются токсичными уже в небольших концентрациях.
Ранее было показано, что репрограммирование возможно и при применении всего трех факторов (Oct4, Sox2 и Klf4) без c-Myc [6]. Однако, эффективность такого репрограммирования крайне низка, а колонии iPS клеток появляются поздно. Лишь одна колония iPS клеток формируется из ста тысяч трансфецированных фибробластов кожи человека (эффективность 0,001%) [6]. Поэтому исследователи также проанализировали способность клеток, подвергнутых воздействию 5-азацитидина и VPA, к формированию колоний iPS клеток при трансфекции тремя факторами.
Oct4-GFP мЭф были инфицированы Oct4, Sox2 и Klf4, а затем подвергнуты воздействию 5-азацитидина и VPA в течение одной недели. Через 10 сут. FACS-анализ зафиксировал увеличение количества GFP+ клеток в 3 раза по сравнению с третьими сут. после трансфекции. Воздействие VPA увеличивало эффективность репрограммирования в 50 раз. Это позволило отобрать колонии iPS клеток уже через 2 нед. после трансфекции. Полученные клетки имели типичную для ЭСК морфологию, позитивно окрашивались на щелочную фосфатазу и экспрессировали маркеры плюрипотентности. Исследование паттерна генной экспрессии таких клеток показало, что полученные iPS-клетки значительно отличаются от МЭФ и больше всего напоминают мышиные ЭСК.
Воздействие VPA на нетрансфецированные фибробласты не вызывает увеличения GFP+ клеток, следовательно одно лишь воздействие VPA не способно вызвать репрограммирование или другие генетические изменения. Более детальный анализ генной экспрессии показал, что действие VPA вызывает активацию ЭСК-специфических генов и ингибирование экспрессии генов МЭФ.
Таким образом, в исследовании было показано, что неспецифические химические агенты, вызывающие эпигенетические изменения, положительно влияют на эффективность репрограммирования и могут заменить один или более факторов транскрипции.
flMTEPATyPA:
1. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448: 313-317.
2. Maherali N., Sridharan R., Xie W. et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell 2007; 1: 55-70.
3. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 2007; 131: 861 -872.
4. Park I.H., Zhao R., West J.A. et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451: 141-146.
5. Blelloch R., Wang Z., Meissner A. et al. Reprogramming efficiency following somatic cell nuclear transfer is influenced by the differentiation and
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
