CC BY
9
DOI: 10.23868/202209009
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ МЕТАБОЛИТОВ ИЗ РАСТЕНИЙ РОДА PETASITES SP. НА ПОДВИЖНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК IN VITRO
Поступила: 06.06.2022 Принята к печати: 17092022 Опубликована on-line: 20.09.2022
С.Ю. Филиппова1, Т.В. Шамова1, С.В. Тимофеева1,
A.О. Ситковская1, И.В. Межевова1, Н.В. Гненная1, И.А. Новикова1, Я.С. Енин1, О.Н. Буров2, Е.Ю. Златник1, С.С. Мезенцев1, Е.Н. Черникова1, О.В. Пандова1,
B.В. Позднякова1, М.О. Ежова1, С.М. Бакулина1, О.В. Хохлова1
1 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии, Ростов-на-Дону, Россия
2 Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия
INFLUENCE OF SOME METABOLITES FROM PLANTS OF THE GENUS PETASWES SP. ON CANCER CELLS MOTILITY IN VITRO
S.Yu. Filippova1, T.V. Shamova1, S.V. Timofeeva1, A.O. Sitkovskaya1, I.V. Mezhevova1, N.V. Gnennaya1, I.A. Novikova1, Ya.S. Enin1, O.N. Burov2, E.Yu. Zlatnik1, S.S. Mezentsev1, E.N. Chernikova1, O.V. Pandova1, V.V. Pozdnyakova1, M.O. Ezhova1, S.M. Bakulina1, O.V. Khokhlova1
1 National medical research center for oncology, Rostov-on-Don, Russia
2 Southern federal university, Rostov-on-Don, Russia
e-mail: filsv@Yandex.ru
Вторичные растительные метаболиты являются перспективным источником противоопухолевых лекарственных средств. Отдельный интерес представляют вещества, способные снизить миграционную активность раковых клеток, как потенциальные антиметастатические препараты.
Цель работы: оценка потенциала некоторых метаболитов из растений рода Petasites sp. в качестве перспективных противоопухолевых веществ, подавляющих подвижность злокачественных клеток.
В работе исследовали влияние метаболитов: 2,4-дигидрокси-2,5-диметилфуран-3(2Н)-один, 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбальдегида и коринана, полученных из растений рода Petasites sp., на степень зарастания дефекта клеточного монослоя в культурах постоянных клеточных линий: PC3, А431, CaCo2, HeLa и T98G. Клетки выращивали в среде DMEM, содержащей 10% FBS. Для проведения теста на зарастание дефекта клетки высаживали в количестве 1,5х 105 на лунку 24-луночно-го планшета и культивировали до получения монослоя. На него пластиковым наконечником наносили дефект в виде вертикальной царапины и вносили среду с добавлением исследуемых веществ в концентрации 40 |jM. В начале эксперимента и через 48 часов культивирования проводили фотографирование и определяли площадь дефекта. Степень зарастания дефекта рассчитывали как отношение разности площадей дефекта через 48 часов культивирования и начальным моментом к площади дефекта в начальном моменте, выраженное в процентах. В результате эксперимента было показано, что 2,4-дигидрокси-2,5-диметилфуран-3(2Н)-один снижает степень зарастания дефекта в культурах A431, HeLa и T98G. Также была обнаружена высокая чувствительность культуры А431 к действию коринана.
Ключевые слова: вторичные метаболиты растений, культуры опухолевых клеток, антимиграционная активность.
Secondary plant metabolites are a promising source of anticancer drugs. Of particular interest are substances that can reduce the migration activity of cancer cells as potential anti-metastatic drugs. In present work we study the influence of 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, 5-(hydroxymethyl)furan-2-carbaldehyde and corinan obtained from plants of the genus Petasites sp. on scratch healing rate of permanent cancer lines PC3, A431, CaCo2, HeLa, and T98G. Cells were grown in DMEM medium supplemented with 10% FBS. To perform a scratch test, cells were planted in an amount of 1,5x 105 per well of a 24-well plate. After cell adhesion, a vertical scratch was applied to the cell monolayer with a plastic tip, after which the medium containing the test substances at a concentration of 40 pM was added. Then, within 48 hours, photographing and determining the scratch area were carried out. The degree of scratch overgrowth was determined as the ratio of the difference between the scratch areas after 48 hours of cultivation and the scratch area at the initial moment, expressed as a percentage. As a result of the experiment, it was shown that 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one downregu-lates scratch healing rate in cultures A431, HeLa, T98G. The high sensitivity of A431 to corinan was also shown.
Keywords: plant secondary metabolites, tumor cell cultures, anti-migratory activity.
Введение
Актуальной задачей современной фармакологии остаётся поиск веществ, способных подавить метастази-рование опухоли, которое является основной причиной смертности от рака. Образование метастазов зависит, помимо прочего, от подвижности злокачественных клеток. В связи с этим, большое значение имеют исследования многообразия вторичных растительных метаболитов, подавляющих миграционный потенциал опухолевых клеток.
Экстракты из растений рода белокопытник (Petasítes эр.), относящегося к семейству Asteraceae, издавна применяются в традиционной медицине [1]. В настоящее время вторичные метаболиты, получаемые
из белокопытника, активно исследуются в фармакологии, в том числе, в качестве перспективных противоопухолевых средств. Наиболее характерными метаболитами для белокопытника, как и для многих других групп растений, являются терпены. Среди метаболитов растений этого рода на настоящий момент описано более 200 веществ, относящихся к данному классу соединений (петазин, Б-японин, беккенолид А и др.). В значительно меньших количествах в экстрактах исследуемого растения обнаруживают алкалоиды, производные фенолов и фуранов, летучие вещества и другие химические соединения [1 ], поэтому из перечисленных классов химических веществ противоопухолевые свойства лучше всего описаны именно у терпенов. Так, выраженная цитотоксическая
НО о
Me
Л к
Ме/Х0/Ч0Н
О'
,0.
ОН
S1: 2,4-дигидрокси-2,5-диметилфуран-3(2Н)-один
S2: 5-(гидроксиметил) фуран-2-карбальдегид
Рис. 1. Химическая структура исследуемых веществ
Me'
S3: коринан
активность в отношении целого ряда культур клеток разных видов рака была показана для петазина и его производных [2-5], S-японина [6] и беккенолида А [7]. Кроме того, для петазина [3] и беккенолида А [7] противоопухолевые свойства были продемонстрированы также in vivo. В качестве основных механизмов противоопухолевого действия терпенов исследователи рассматривают нарушение работы НАДН-дегидрогеназного комплекса дыхательной цепи переноса электронов [3], инактивацию проонкогенного сигнального пути Akt/ mTOR [4], подавление работы ABC-транспортеров и связанный с этим рост внутриклеточного содержания активных форм кислорода [2], активацию онкосупрес-сора р53 [5], а также подавление синтеза проонкогенной деацетилазы гистонов 3 (HDAC3) [7]. Помимо терпенов, цитотоксическая активность в отношении клеток рака была обнаружена и у получаемых из белокопытника производных бензофурана [8] и петазифенола, относящегося к полифенолам [9].
Более редкие для экстрактов растений рода Petasítes sp. классы органических веществ, являются, тем не менее, ценным источником противоопухолевых средств, обладающих, в том числе, высоким антимиграционным потенциалом [10]. Объектом изучения в нашей работе стали некоторые производные фуранов и алкалоиды, которые были выделены нами из образцов растений Petasites hybridus (L.), собранных в республике Адыгея, очищены и охарактеризованы [11]. Интерес к данным классам веществ был продиктован тем, что для некоторых из них антимиграционная активность уже описана в литературе [10, 12]. Кроме того, способность алкалоидов подавлять подвижность клеток была продемонстрирована и в наших более ранних исследованиях [13].
Цель работы: оценка потенциала некоторых метаболитов из растений рода Petasítes sp. в качестве перспективных противоопухолевых веществ, подавляющих подвижность злокачественных клеток.
из питательной среды DMEM (Gibco, США), содержащей 10% FBS (HyClone, США), без добавления антибиотиков. В экспериментах тестировали следующие метаболиты: вещество 1 (S1) — 2,4-дигидрокси-2,5-диметилфуран-3(2Н)-один; вещество 2 (S2) — 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбальдегид; вещество 3 (S3) — коринан (рис. 1).
Перед началом эксперимента клетки высаживали в стандартной среде в количестве 1,5х105 на лунку 24-луночного планшета (Biofil, Китай). Количество лунок для каждого варианта n=12. По достижении монослоя проводили тест на зарастание дефекта по стандартной методике. Пластиковым наконечником наносили дефект в виде вертикальной царапины на клеточный монослой, после чего среду декантировали и вносили стандартную среду культивирования с добавлением исследуемых веществ в концентрации 40 |jM. Контролем служила среда без добавления метаболитов белокопытника. В начале эксперимента и через 48 ч. культивирования проводили фотографирование и определяли площадь дефекта на имиджере Lionheart Fx (BioTek, США). Степень зарастания дефекта определяли как отношение разности площадей дефекта через 48 ч. культивирования и начальным моментом к площади дефекта в начальном моменте, выраженное в процентах.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2010 при помощи параметрического t-критерия Стьюдента, поскольку, как показала предварительная проверка, данные для всех групп соответствовали закону нормального распределения. Данные представлены, как интервальная оценка для математического ожидания исследуемого параметра в виде: среднее выборочное ± точность интервальной оценки для 95% доверительного интервала. Критическое значение t-критерия определяли для уровня значимости p=0,05 и количества степеней свободы df=n1+n2-2=22, где n1 и n2 — количество повторов в сравниваемых выборках (n1=n2=12).
Материал и методы
Влияние метаболитов из растений рода Рйазйез эр. на подвижность опухолевых клеток изучали на постоянных клеточных линиях рака предстательной железы РС3, эпидермоидной карциномы А431, колоректального рака СаСо2, рака шейки матки Не1_а и глиомы Т98Э. Клетки выращивали в стандартной среде культивирования, состоящей
Результаты и обсуждение
Исследуемые культуры оказались в разной степени чувствительными к тестируемым веществам. Степень зарастания дефекта в клеточных культурах колорек-тального рака СаСо2 и рака предстательной железы РС3 достоверно не отличалась от контроля при использовании всех трёх метаболитов (рис. 2).
120,00
-О i s с
СП
а.
СП J о; s i СП н
0
СП
а.
СП
со
-О
1
CD С CD Н
О
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
контроль
51
52
53
А431
CaCo2
HeLa
PC3
T98G
Рис. 2. Степень зарастания дефекта в виде «царапины» через 48 ч. культивирования в присутствии 40 рМ тестируемых растительных метаболитов. Данные представлены в виде: среднее выборочное ± точность интервальной оценки для 95% доверительного интервала. * — значение статистически достоверно отличается от контроля (р<0,05, ((=22)
Тем не менее, в культуре эпидермоидной карциномы А431 было обнаружено статистически значимое уменьшение степени зарастания дефекта в опытных пробах при действии всех трёх веществ по сравнению с контролем, при этом реакция на Б3 оказалась намного более выраженной, чем реакция на Б1 и Б2. Степень зарастания дефекта составила в контроле 81,52 ± 7,63%, в варианте с добавлением Б1 — 63,77 ± 5,41%, Б2 — 62,42 ± 6,34% и Б3 — 12,05 ± 4,09%. Значения ^критерия Стьюдента превышали критическое значение ^=2,074) и равнялись для Б1 — 4,1, Б2 — 4,5, и Б3 — 10,2. Кроме того, уменьшение степени зарастания дефекта при инкубации с веществом Б1 было выявлено для клеточной культуры рака шейки матки Не1_а (25,92 ± 5,07%, в контроле 39,0 ± 6,32%, t=3,1) и глиомы Т98Э (82,41 ± 9,14%, в контроле 97,35 ± 1,87%, t=2,9).
Исследуемые вещества относятся к разным классам химических соединений: 2,4-дигидрокси-2,5-диметилфуран-3(2Н)-один и 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбальдегид являются производными фуранов, а коринан — алкалоидом. Известно, что некоторые производные фуранов стабилизируют микротрубочки, чем объясняется их цитостатический эффект [10]. Стабилизация микротрубочек также может объяснять и подавление миграционной активности клеток, так как многие процессы, необходимые для подвижности клеток, зависят от сборки и разборки микротрубочек и их взаимодействия с другими элементами цитоскелета. Первая группа процессов, важных для подвижности клеток, имеет отношение к сборке актинового цитоскелета. Предполагают, что полимеризация микротрубочек активирует сигнальный каскад ЭЕР-Н1/ПЬод/пОСК/М_С, играющий ключевую роль в регуляции перестройки акти-нового цитоскелета и нуклеации актина при выпячивании клеточной мембраны [14]. Вторая группа зависимых от микротрубочек процессов основана на реорганизации фокальных контактов. Фокальные контакты образуются между клеточной мембраной и внеклеточным матриксом на переднем крае мигрирующей клетки и служат в качестве якорей, необходимых для отталкивания или подтягивания клетки во время движения. По мере смещения фокального контакта к заднему краю мигрирующей клетки он должен быть разобран для того, чтобы освободить клеточную мембрану и элементы цитоскелета для продолжения направленного движения клетки. Известно, что микротрубочки растут по направлению к фокальным
контактам и, вступая с ними во взаимодействие, способствуют их разборке. Индуцированная микротрубочками разборка фокальных контактов основана на стимуляции микротрубочками динамина (ГТФазы, участвующей в эндоцитозе) и клатрин-зависимом эндоцитозе компонентов адгезии. Направленный рост микротрубочек в сторону фокальных контактов происходит с помощью белка ACF7, который сшивает микротрубочки и актин между собой, и при подавлении активности которого способность клеток к направленной миграции снижается [15]. Наконец, для эффективной миграции клеток требуется нормальное протекание таких, зависимых от микротрубочек процессов, как рециркуляция эндосом и доставка к переднему краю мигрирующей клетки везикул от аппарата Гольджи, мРНК и других необходимых клеточных компонентов [16]. Таким образом, направленная клеточная миграция в большой мере обусловлена активностью зависимых от микротрубочек молекулярных моторов — белков, использующих энергию АТФ для генерации движущей силы, и доступностью подходящих для их движения путей. Помимо дезорганизации микротрубочек, для производных фуранов описан и другой возможный механизм подавления полимеризации актина на модели оценки влияние курколонола на вертикальную и горизонтальную миграцию клеток рака молочной железы, вызванную действием TGF-P1 [17]. Авторы показали, что подавление полимеризации F-актина связано со способностью курколонола угнетать фосфори-лирование кофилина 1, что, в свою очередь, может быть связано с ингибированием каталитической активности киназы LIMK1 [17].
Таким образом, обнаружена высокая чувствительность клеток культуры А431 к коринану. Известно, что подобно коринану, некоторые другие алкалоиды также подавляют подвижность опухолевых клеток. Было установлено, в частности, что получаемый из корня Stephania tetrandra S. Moor алкалоид тетрандрин подавляет пролиферацию, миграцию и инвазию клеток глиомы линии U87 за счёт снижения синтеза белка ADAM 17 и подавления активности сигнального пути EGFR/PI3K/AKT [18]. В своих более ранних исследованиях мы также показали способность алкалоида берберин, полученного из растений рода Berberís sp., подавлять скорость зарастания дефекта [13], которая, вероятно, связана с его угнетающим действием на энергетический метаболизм клеток опухоли [19].
Заключение
В проведенном исследовании показано, что метаболит 2,4-дигидрокси-2,5-диметилфуран-3(2Н)-один уменьшил степень зарастания дефекта в 3 из 5 тестируемых культур клеток, что делает это вещество перспективным кандидатом для дальнейшего анализа его антимиграционного потенциала. Потребуется дополнительное изучение молекулярных механизмов, лежащих
в основе наблюдаемого эффекта, для более детального описания антимиграционных и антипролиферативных свойств данного соединения и подтверждения его инги-бирующего влияния на подвижность злокачественных клеток. Кроме того, интерес представляет дальнейшее более глубокое исследование механизмов, лежащих в основе высокой чувствительности культуры клеток эпидермоидной карциномы А431 к коринану.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Kulinowski t., Luca S.V., Minceva M. et al. A review on the ethno-botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of butterbur species (Petasites L.). J. Ethnopharmacol. 2022; 293: 115263.
2. Abdelfatah S., Böckers M., Asensio M. et al. Isopetasin and S-isopetasin as novel P-glycoprotein inhibitors against multidrug-resistant cancer cells. Phytomedicine 2021; 86: 153196.
3. Heishima K., Sugito N., Soga T. et al. Petasin potently inhibits mitochondrial complex I-based metabolism that supports tumor growth and metastasis. J. Clin. Invest. 2021; 131(XVII): e139933.
4. Lyu X., Song A.L., Bai Y.L. et al. Inhibitory effects of petasin on human colon carcinoma cells mediated by inactivation of Akt/mTOR pathway. Chin. Med. J. (Engl). 2019; 132(IX): 1071-8.
5. Guo L., Kang J.S., Kang N.J. et al. S-petasin induces apoptosis and inhibits cell migration through activation of p53 pathway signaling in melanoma B16F10 cells and A375 cells. Arch. Biochem. Biophys. 2020; 692: 108519.
6. Matsumoto T., Imahori D., Saito Y. et al. Cytotoxic activities of ses-quiterpenoids from the aerial parts of Petasites japonicus against cancer stem cells. J. Nat. Med. 2020; 74(IV): 689-701.
7. Zhang L., Hong Z., Zhang R.R. et al. Bakkenolide A inhibits leukemia by regulation of HDAC3 and PI3K/Akt-related signaling pathways. Biomed. Pharmacother. 2016; 83: 958-66.
8. Soleimani A., Asadi J., Rostami-Charati F. et al. High Cytotoxicity and Apoptotic Effects of Natural Bioactive Benzofuran Derivative on the MCF-7 Breast Cancer Cell Line. Comb. Chem. High Throughput Screen 2015; 18(V): 505-13.
9. Mizushina Y., Kamisuki S., Kasai N. et al. Petasiphenol: a DNA polymerase lambda inhibitor. Biochemistry 2002; 41(XLIX): 14463-71.
10. Shin S.A., Moon S.Y., Kim W.Y. et al. Structure-Based Classification and Anti-Cancer Effects of Plant Metabolites. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(IX): 2651.
11. Буров О.Н., Енин Я.С., Васильченко Н.Г. Выделение и определение перспективных вторичных метаболитов белокопытника гибридного Petasites hibridus (L.), обладающих противоорухолевой активностью. В: Тимошкина Н.Н., редактор. Молекулярно-генетические маркеры
в диагностике и лечении онкологических заболеваний. Материалы Всеросс. научно-практ. конф.; 23 ноября 2018; Ростов-на-Дону, РФ. Таганрог: изд. ЮФУ; 2018. с. 28-30. [Burov O.N., Enin Y.S., Vasilchenko N.G. Isolation and determination of promising secondary metabolites of hybrid butterbur Petasites hibridus (L.) with antitumor activity. In: Timoshkina N.N., editor. Molecular genetic markers in the diagnosis and treatment of oncological diseases. Proceedings of all-Russian scientific and practical conference; 2018 Nov 23; Rostov-on-Don, Russian Federation. Taganrog: ed. SFedU; 2018. p. 28-30].
12. Bukhari S.N.A., Ejaz H., Elsherif M.A. et al. Design and Synthesis of Some New Furan-Based Derivatives and Evaluation of In Vitro Cytotoxic Activity. Molecules 2022; 27(VIII): 2606.
13. Mezhevova I.V., Filippova S.Yu., Timofeeva S.V. et al. Antimigratory effect of berberine in T98G, U87MG and primary glioma cell culture. J. Clin. Oncol. 2021; 39 Suppl 15: e15045.
14. Chang Y.C., Nalbant P., Birkenfeld J. et al. GEF-H1 couples nocodazole-induced microtubule disassembly to cell contractility via RhoA. Mol. Biol. Cell 2008; 19(V): 2147-53.
15. Wu X., Shen Q.T., Oristian D.S. et al. Skin stem cells orchestrate directional migration by regulating microtubule-ACF7 connections through GSK3ß. Cell 2011; 144(III): 341-52.
16. Kaverina I., Straube A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin. Cell Dev. Biol. 2011; 22(IX): 968-74.
17. Lu H., Chen J., Luo Y. et al. Curcolonol suppresses the motility of breast cancer cells by inhibiting LIM kinase 1 to downregulate cofilin 1 phosphorylation. Int. J. Oncol. 2018; 53(VI): 2695-704.
18. Wu Z., Wang G., Xu S. et al. Effects of tetrandrine on glioma cell malignant phenotype via inhibition of ADAM17. Tumor Biol. 2014; 35(III): 2205-10.
19. Филиппова С.Ю., Тимофеева С.В., Ситковская А.О. и др. Влияние берберина на энергетический фенотип клеток линий рака молочной железы. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований 2021; 10: 42-6. [Filippova S.Yu., Timofeeva S.V., Sitkovskaya A.O. et al. Effect of berberine on the energy phenotype of breast cancer cell lines. International Journal of Applied and Basic Research 2021; 10: 42-6].
