CC BY
191УДК 576.7+537.876
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ПРОЦЕССЫ МИТОЗА
А.Ю. Лаврский, И.А. Лебединский, Н.А. Четанов, А.Ф. Кузаев, О.А. Артамонова
INFLUENCE OF SOME PHYSICAL FACTORS ON PROCESSES OF MITOSIS
Рассмотрено влияние температурного фактора и электромагнитного излучения на протекание митоза в корневой меристеме лука. Выявлено митотоксическое и мутагенное влияние изучаемых факторов. Диапазон частот, обладающий наибольшим митотоксическим действием, соответствует таковым стандартов GSM-850/900 сотовой связи.
Ключевые слова: Allium-тест, меристема, митотический индекс,
хромосомные аберрации, мутагенный фактор, ЭМИ.
In this paper, the influence of the temperature factor and electromagnetic radiation on the course of mitosis in onion root meristem. Revealed mitotoxic and mutagenic effects of the studied factors. Frequency range that has the greatest mitotoxic effect to the range of standards GSM-850/900 provider.
Key words: Allium-test, meristem, mitotic index, chromosomal aberrations, mutagenic factor, EMR.
В настоящее время все большее внимание уделяется растительным системам как средствам оценки уровня влияния тех или иных факторов на живые организмы [2; 3]. Одной из наиболее распространенных и простых в освоении тест-систем является Allium test [4]
Целью нашего исследования было выяснение уровня воздействия физических факторов на протекание процессов на клеточном и тканевом уровне, в первую очередь нас интересовал такой физический фактор, как электромагнитное излучение. Фактор электромагнитного смога влияет на различные организмы, но в большей степени, без сомнения, на человека. Вероятно, ни один современный житель города не может представить своё существование без средств мобильной связи, таким образом, добровольно
© Лаврский А.Ю., Лебединский И.А., Четанов Н.А., Кузаев А.Ф., Артамонова О.А., 2013 *Работа выполнена в рамках программы стратегического развития Пермского государственного гуманитарно-педагогического университета ПСР/НИР-15
подвергая себя воздействию электромагнитных излучений. Большинство современных технологий беспроводной связи используют частоты в единицы гигагерц, работают в дециметровом диапазоне (300 МГц -3 ГГц), а последние модели пользовательских точек доступа Wi-fi в сантиметровом (5150-5350 МГц и 5650-6425 МГц), [1, 5]. Однако перед тем как переходить к изучению влияния электромагнитного излучения, необходимо было выявить, при каких температурных условиях в клетках модельного объекта наиболее интенсивно и без каких-либо патологий протекает митоз, а также выяснить, при каких температурах митоз начинает протекать патологично.
Материалы и методы. Для исследования влияния температурного фактора на митотическое деление клеток нами использовались луковицы Allium сера. Для проведения опыта луковицы отбирались по возможности одинаковыми по размеру и помещались в разные емкости так, что донце луковиц соприкасалось в водой. Через 2-3 дня проращивания молодые корни можно использовать для подсчета митотического индекса. После чего методом раздавливания готовились временные препараты и анализировались на малом увеличении под микроскопом.
Для анализа воздействия электромагнитных колебаний на делящиеся клетки меристемы корня лука Allium cepa были предприняты меры по стабилизации других факторов среды, которые потенциально могли бы внести ошибку в результаты измерений.
Для замеров исходного уровня мощности служил телефон E-Ten glofiish -X500 работающий в диапазонах GSM 850, GSM 900, GSM 1800, GSM 1900, с возможностью их ручного переключения. Уровень мощности излучения замерялся с помощью анализатора спектра на расстоянии 1 см от антенны телефона, как в режиме разговора (прием + передача), так и в экранированной камере с минимальным качеством связи и принудительным переключением диапазонов. Показатель SAR (Specific Absorption Rate) для упомянутой модели телефона составляет 0,74 Вт/кг, что соответствует передатчику стандарта GSM среднего уровня мощности.
С помощью устройства-эмулятора имитировался источник излучений равной мощности, но различных частот.
В качестве источника исходного сигнала использовался генератор РГШ-3000, разработанный ООО «Радий-ТН», работающий в диапазоне 1-3000 МГц и имеющий возможности программного аттенюатора и модуляции сигнала. Сигнал с генератора поступал на усилитель на основе микросхемы GSM-передатчика SKY77325 и регулировался с помощью анализатора спектра до нужного уровня, для корректировки неравномерности АЧХ выходного тракта эмулятора.
Жидкая среда, на которой проращивались луковицы во всех опытах и в контроле термостатировалась при температуре 28,0oC. Из-за неоднозначного влияния искусственных составов в качестве среды для проращивания для всей серии опытов применялась разово закупленная природная артезианская вода с известным и сбалансированным ионным составом.
Для равномерного облучения корней 10-12 луковиц лука сорта Штутгартен-ризен диаметром 15-18 мм проращивались в прямоугольной пластиковой кювете объемом 1270 мл, в узкой канавке из пищевого пластика, образованной стенкой кюветы и прямоугольной вставкой. В верхней части канавка расширялась, позволяя донцам луковиц свободно погружаться в раствор. Образованная полость толщиной 3 мм нижней и боковыми краями сообщалась с объемом кюветы, таким образом корни располагались веерообразно, не контактируя ни с чем в толще раствора концевыми участками, что предотвращает влияния механических контактов на корневой прирост.
Луковицы снизу экранировались от области облучения сеткой из нержавеющей стали с ячейкой 1 мм, расположенной сразу под донцами, через которую корни проходили в кювету, по бокам и сверху - кожухом из фольгированного пенополиэтилена с вентиляционными отверстиями. Эта мера направлена на предотвращения облучения апикальной меристемы луковиц, и возможного изменения уровня фитогормонов, влияющих на рост корней.
Излучатель электромагнитных колебаний, помещенный
в гидроизоляционный чехол, располагался вдоль всей боковой стенки кюветы, и представлял собой антенну, выполненную на полоске стеклотекстолита с подключенным экранированным кабелем.
Такая конструкция дает возможность равномерно облучать исследуемый материал, замеряя амплитуду воздействующих колебаний в разных участках зоны прорастания с помощью анализатора спектра с предварительно откалиброванной шкалой. Размещение образцов в непосредственной близости от излучателя позволяет воздействовать на их большое количество с равномерной мощностью. Вся конструкция помещалась в экранированный заземленный металлический кожух, воздух в который подавался микрокомпрессором со скоростью 2,3 л/мин.
Исходя из того, что клеточный цикл лука Allium cepa составляет, по данным разных авторов, 14-17,8 ч, был определен 18-часовой период облучения.
После облучения срезались концевые участки корней по 3-5 мм, и фиксировались с помощью фиксатора Кларка, после чего окрашивались
2%-ным ацетоорсеином, с последующей обработкой в 45%-ной уксусной кислоте и переносом в 70%-ный этанол для длительного хранения.
Для анализа давленных препаратов меристем использовался микроскоп «Ломо-Микмед-6» при увеличении 400X с CMOS-камерой EVS-5,17 mp. Проводился анализ 1000 клеток на 1 корень с последующим подсчетом митотического индекса и частоты хромосомных аберраций с использованием MS Excel.
Митотический индекс (Mi) рассчитывался по формуле:
( P+M+A+T)
Mi =----------------*100%,
где: P+M+A+T - сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, N - общее число проанализированных клеток.
Результаты и их обсуждение. При изучении влияния температурного фактора на протекание митоза нами была исследована митотическая активность при следующих температурах: 33, 37, 41° и 45°С. В виде контроля выступали образцы, выращиваемые при 25°С
Максимальное значение митотического индекса нами было отмечено при 33°С, однако достоверные отличия выявлены не во всех случаях: при 33°С он был достоверно выше, чем при 25 и 41 градусе, уровень статистической значимости составил 0,1 и 1 % соответственно.
Для удобства оценки изменчивости митотического индекса мы использовали графическую форму отображения материала (рис. 1).
5
0
25 33 37 41 45
Температура, °С ^►Митотический индекс, %
Рис 1. Значение митотического индекса при различных температурах
При рассмотрении графика заметны два положительных пика - при 33 и 45°С. Первый пик имеет вполне логичное объяснение - это, по всей видимости, как раз тот самый температурный оптимум для протекания митоза. Наличие на графике второго пика интерпретировать несколько сложнее. Однако при внимательном изучении микропрепаратов было выявлено своеобразное «зависание» клеточного цикла на стадии профазы, что и объясняет высокое значение митотического индекса. То есть в данном случае высокое значение митотического индекса свидетельствует не об интенсивности митоза, а, наоборот, о нарушение клеточного цикла.
Поэтому для проведения регрессионного анализа значения митотического индекса при 45°С использоваться не будут. Результаты применения полиноминальной регрессии к полученным данным представлены на рис. 2.
33 37
Температура, °С
•Митотический индекс, %
—Полиномиальная (Митотический индекс, %)
Рис 2. Значение митотического индекса при различных температурах с использованием
полиноминальной регрессии
Таким образом, мы можем сделать следующие предварительные выводы:
• оптимальные температурные условия для протекания митоза - диапазон температур 28-30°С;
• температуры выше 41°С приводят к нарушению клеточного цикла.
После определения температурного оптимума для протекания митоза мы
перешли к изучению влияния электромагнитного излучения.
В результате данного исследования были выявлены статистически достоверные отличия между такими показателями, как митотический индекс (Мг) и количество хромосомных аберраций (ХА) для контрольной выборки луковиц, проращиваемых в экранированном кожухе без излучения, и этими показателями для выборок луковиц, в течение 18 часов подвергавшихся воздействию ЭМИ различных частот.
Результаты представлены в таблице.
Митотический индекс (Mi) и частота хромосомных аберраций (XA) в меристеме корня лука Allium cepa при воздействии СВЧ излучения различных частот (n = 10, p < 0,05)
Частота, МГ ц Mi, % Частота хромосомных аберраций, % d t
Контроль 2,54 ± 0,130 6,03 ± 2,4375 - -
660 2,23 ± 0,066 19,95 ± 3,9447 13,92 3,00
800 1,93 ± 0,150 31,31 ± 6,2478 25,28 3,77
930 2,01 ± 0,096 36,95 ± 8,8532 30,92 3,37
1000 2,38 ± 0,124 22,91 ± 4,7527 16,88 3,16
1110 2,33 ± 0,071 37,47 ± 7,9152 31,44 3,80
1252 2,46 ± 0,164 30,34 ± 4,9626 24,31 4,40
1853 2,37 ± 0,113 27,03 ± 2,8366 21,00 5,62
Наиболее значительное влияние на митотические процессы оказывают частоты 800 и 930 МГц, частота 800 МГц характеризуется самым низким митотическим индексом 1,93 ± 0, 150. Применение /-теста Стьюдента не показало наличие достоверных отличий между выборками 800 и 930 МГц, таким образом, диапазон 800-930 МГц можно рассматривать как единый диапазон с наибольшим проявлением митотоксического эффекта электромагнитного излучения среди рассмотренных.
При воздействии частот 1110 и 1252 МГц достоверных отличий от контроля не наблюдается.
Таким образом, диапазон частот, обладающий наибольшим митотоксическим действием, соответствует таковому стандартов GSM-850/900 сотовой связи, с повышением частоты излучения наблюдается уменьшение его воздействия на делящиеся клетки, что, вероятно, связано с особенностями поглощения микроволнового излучения живыми клетками.
Вероятно, по степени митотоксического эффекта излучения микроволновый диапазон является неравномерным и имеет определенные, обладающие наибольшей выраженностью эффекта области, это косвенно подтверждается меньшим значением митотического индекса для частоты 1853 МГ ц в приведенных данных. Для установления таких участков микроволнового диапазона необходимы дальнейшие исследования.
При изучении частоты хромосомных аберраций наиболее распространенными оказались патологии типа «мост» - результат объединения
хромосом разных дочерних клеток, а также фрагменты, наблюдаемые, как правило, в анафазе, и потери целых хромосом при расхождении.
На основании полученных данных можно сделать некоторые предварительные выводы:
1. На всех использованных в эксперименте частотах ЭМИ установлено достоверное отличие по частоте возникновения хромосомных аберраций между контрольной и экспериментальной выборками, что говорит о мутагенном воздействии этого фактора.
2. Контроль имеет собственную фоновую частоту возникновения аберраций, несмотря на тщательную изоляцию контрольной выборки от внешних воздействий и стабилизацию факторов среды. Это может быть обусловлено различными причинами как биологического характера, так и несовершенством экспериментальной установки.
3. Наибольшее число аберраций зафиксировано при частотах 930 и 1100 МГц. По всей видимости, наименьшим мутагенным эффектом при одинаковой мощности обладает излучение на частоте 660 МГц.
4. Перечисленные пики мутагенной активности в диапазоне исследованных частот не соответствуют частотам, демонстрирующим наибольший митотоксический эффект, что может быть вызвано разными причинами, например, воздействием колебаний на различные внутриклеточные структуры с разными последствиями.
Список литературы
1. Песня Д.С., Романовский А.В., Прохорова И.М. Разработка методики для оценки влияния УВЧ-излучения сотовых телефонов и других приборов с ЭМИ на организмы in vivo // Ярославский педагогический вестник. - Ярославль: ЯГПУ им. К.Д. Ушинского, 2010. - Т. 3 (Естественные науки). - № 3. - С. 80-84.
2. Прохорова И.М. Растительные тест-системы для оценки мутагенов / Сост. И.М. Прохорова. - Ярославль: ЯрГУ, 1988. - 13 с.
3. Тарасов В.А. Принципы количественной оценки генетической опасности химических загрязнителей биосферы // Мутагены и канцерогены в окружающей среде: новые подходы к оценке риска для здоровья. - СПб, 1998. - С. 92-117.
4. Fiskesjb G. The Allium Test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. - 1985. - Т. 102. - P. 99-112.
5. Pesnya D.S., Romanovsky A. V. Comparison of cytotoxic and genotoxic effects of plutonium-239 alpha particles and mobile phone GSM 900 radiation in the Allium cepa test // Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis-2013. - Vol. 750. - Issues 1-2. - P. 27-33.
