CC BY
105
УДК 544.726+543.432
Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2013. Вып. 1
А. Э. Сташкова, М. А. Пешкова, К. Н. Михельсон
ВЛИЯНИЕ НАТРИЯ НА pH-ФУНКЦИЮ ^/рН-СЕЛЕКТИВНОГО ОПТОДА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ: ЕСТЬ ЛИ НЕОБХОДИМОСТЬ В ОПТИЧЕСКИХ ДАТЧИКАХ АКТИВНОСТЕЙ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ИОНОВ?*
Введение. Трудно представить сегодня какую-либо отрасль науки или промышленности, где не использовались бы химические сенсоры. Обширна практика их применения при контроле технологических процессов, при исследовании самых разнообразных сред, в том числе биологических (кровь, плазма, слюна), в анализе продукции сельского хозяйства, в экологическом мониторинге. Так, только в США ежегодно осуществляется около 1 млрд клинических измерений при помощи ионоселективных электродов (ИСЭ) — одного из самых распространённых классов химических сенсоров [1].
Постоянное усложнение задач, появление новых объектов анализа требуют развития химических сенсоров, возникает необходимость в миниатюризации датчиков, в улучшении их воспроизводимости, в снижении стоимости. В 1975 г. Д. Любберс и Н. Опиц [2] одними из первых описали новый тип химических сенсоров — оптоды (англ. с^с^ев). Эти датчики схожи по составу и механизму функционирования с ИСЭ, но вместо по-тенциометрического отклика изменяют свои оптические свойства вслед за изменением концентрации аналита. В 1980-1990-е гг. наблюдалось бурное развитие новой области ионометрии в работах Чарльтона, Флеминга, Морфа, Симона и др. [3-8]. К 1997 г. были разработаны оптоды, селективные к более чем 30 аналитам [1]. Низкая стоимость, незначительное потребление энергии, сравнительно долгое время жизни, а также низкие пределы обнаружения и широкие возможности миниатюризации делают оптоды перспективной альтернативой электрохимическим сенсорам и более сложному аналитическому оборудованию.
Появление оптического сигнала оптода обусловливается введением в его чувствительный слой активных компонентов. В зависимости от формы существования этих компонентов в сенсорном слое резко изменяются его оптические свойства (показатель преломления, поглощение в видимой, ИК- или УФ-частях спектра, отражение светового потока, интенсивность люминесценции). К таким активным веществам относятся, к примеру, люминофоры, испускающие свет при комплексообразовании с определёнными металлами, или хромоионофоры, меняющие цвет в реакции протонирова-ния/депротонирования. Наиболее распространены оптоды, изменяющие цвет или степень свечения при изменении концентрации аналита. Изменение оптических характеристик фиксируется спектральными анализаторами поглощения либо отражения. Если спектр излучения источника света достаточно широкий и плоский (лампа накаливания,
Анастасия Эдуардовна Сташкова — студентка, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: stashkova_69@mail.ru
Мария Анатольевна Пешкова — кандидат химических наук, ассистент, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: maria.a.peshkova@gmail.com
Константин Николаевич Михельсон — доктор химических наук, профессор, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: konst@km3241.spb.edu
* Работа выполнена при финансовой поддержке Санкт-Петербургского государственного университета (гранты 12.0.16.2010 и 12.38.17.2011).
© А. Э. Сташкова, М.А.Пешкова, К. Н. Михельсон, 2013
Солнце), то обычная фотокамера, фиксируя цвет оптода, регистрирует и спектр отражённого от мембраны света, давая тем самым информацию о спектре поглощённого.
По роду явлений, определяющих отклик, оптоды можно разделить на поверхностные и объёмные (англ. bulk optodes). В случае оптодов с чувствительной поверхностью активные компоненты (хромоионофор, люминофор) ковалентно или каким-либо другим образом иммобилизованы на поверхности подложки так, что чувствительный монослой оказывается в растворе вблизи границы раздела фаз [9-14]. Отклик таких систем сильно зависит от ионной силы раствора, так как она определяет коэффициенты активности ионных форм иммобилизованного компонента, а также от поверхностного потенциала границы раздела фаз, который, в свою очередь, определяет соотношение измеряемой концентрации у поверхности и искомой концентрации в объёме раствора. На потенциал поверхности существенно влияет и плотность иммобилизованных зарядов, которую достаточно трудно контролировать. Этот вид оптодов не получил широкого распространения из-за чувствительности ко многим трудно контролируемым параметрам, плохой воспроизводимости и сложности модельного описания.
Напротив, очень широкое применение находят объёмные оптоды. Такие сенсоры основаны на переносе ионов из образца в чувствительный слой и диффузии в его объёме: меняются оптические свойства во всём объёме сенсорного слоя, что делает эти системы менее чувствительными к поверхностным эффектам, например, при частичной блокировке поверхности биомакромолекулами.
Оптоды могут быть изготовлены на основе гидрофильной матрицы (полиакрила-миды, полиметакрилаты и др. гидрогели), с использованием классических водорастворимых кислотно-основных/люминесцентных индикаторов и их производных [2, 15-18]. Однако недостатком этих систем является необратимое загрязнение пробы таким индикатором. Большее распространение получают оптоды с гидрофобной матрицей (поли-винилхлорид и схожие полимеры), содержащей липофильные активные компоненты, подобно мембранам ионоселективных электродов (ИСЭ) [19-21]. В отличие от классической спектрофотометрии такие оптоды позволяют осуществлять неразрушающий анализ и являются датчиками активности, а не концентрации в растворе.
По сравнению с ИСЭ, конструкция которых достаточно строго определена необходимостью внутреннего электрода сравнения и слоя, обеспечивающего смену носителей заряда (внутренний раствор, твёрдый электронно-ионный проводник), дизайн оптодных устройств может быть исключительно разнообразным. Наиболее широко используются полимерные оптодные плёнки [22-24] как в режиме пропускания, так и отражения света, либо оптодные «бусины» — микрочастицы из ПВХ с импрегнированными в них активными компонентами [25, 26]. Весьма перспективным оказывается использование оптоволокна для передачи оптического сигнала от сенсора к детектору ( англ. fiber optics optodes). Такие устройства представляют широкие возможности для миниатюризации и дистанционной регистрации сигнала, поэтому они часто применяются для анализа биологических объектов (клеток, тканей) [27, 28]. Оптоволокно также используют для усиления оптического сигнала: поток света, запущенный в волновод, отражается от границы волновод — оптодная мембрана, частично абсорбируясь мембраной на этой границе. Многократное отражение светового луча, т. е. многократная абсорбция, приводит к усилению оптического сигнала, что позволяет использовать волноводы для высокочувствительного анализа [29, 30]. Гибкость конструкции оптических сенсоров позволяет успешно применять их в проточных ячейках [31, 32].
Подобно ИСЭ наиболее распространены оптоды на основе полимерной гидрофобной матрицы, чаще всего — ПВХ. Аналогично ИСЭ в состав оптодов входит
ионофор — нейтральный или заряженный переносчик, селективно реагирующий с определяемым ионом. При необходимости в состав мембраны вводят ионную добавку, которая задает обменную ёмкость. Основным компонентом, отличающим такие оптоды от ИСЭ, является хромоионофор — липофильный (имеющий сродство к органической фазе) рН индикатор, который может находиться в мембране в протонированной и де-протонированной формах, причём их соотношение зависит от рН раствора. Протониро-ванная и депротонированная формы резко отличаются по длине волны поглощаемого света, поэтому изменение их соотношения в мембране легко считываемо. Оптоды могут быть селективны к катиону и аниону. Для оптодов, селективных к катиону, возникновение отклика обусловлено процессом ионного обмена между раствором и мембраной. Оптоды, селективные к аниону, функционируют за счёт необменной сорбции [8]. На рис. 1 схематично изображён механизм отклика оптодной мембраны, содержащей нейтральный ионофор и нейтральный хромоионофор.
б
I+
Н+
1Ь+ К- ь
СН+ К- с
X -Н+
> хь- ь
СН+ С
Рис. 1. Механизм отклика оптодной мембраны, содержащей нейтральный хромоионофор С, нейтральный ионофор Ь, селективной к катиону I + (К- — катионообменная добавка) (а), к аниону X- (б): слева — водная фаза, справа — органическая фаза
Системе, изображённой на рис. 1, а, соответствует следующая реакция ионного обмена:
+ пЬ(м) + гСН+ы) & Щ+м) + С) + Ну (1)
где I— определяемый катион; Ь — нейтральный ионофор, селективный к I; С — хромоионофор; (р), (м) — раствор и мембрана соответственно.
Если активности компонентов в мембране равны их концентрациям и все способные к диссоциации компоненты мембраны диссоциируют нацело, выражение для активности определяемого иона в растворе принимает вид
ат = (гКеХсЪ.)
-1
аан
Е— - (1 - а)Ст
1- а) (ьт _ (д-_ (1 _ а)Ст)*у
(2)
где КехСл — константа равновесия (1) (константа ионного обмена); а = [С]/[СТ] — доля депротонированного хромоионофора (которой обусловливается собственно отклик оптода); Ст = [С] + [СН+] — брутто-концентрация хромоионофора в мембране; Ьт, Е— — брутто-концентрации в мембране ионофора и ионной добавки соответственно.
Поскольку мембрана находится в равновесии с раствором и выполняется условие электронейтральности в системе, отклик оптода а определяется соотношением активностей двух (парных) ионов (см. уравнение (2)) — протона и определяемого иона в растворе: а(1 +)/а(Н +). Для анион-селективных оптодов отклик определяется произведением активностей двух ионов а(Х—)а(Н +). Наличие этого перекрёстного влияния одного иона на функцию другого (рН-зависимость оптодного отклика) представляет собой фундаментальную проблему оптодов, решение которой имело бы ключевое значение для этого класса химических сенсоров.
Тем не менее, оптоды по сравнению с ионоселективными электродами имеют ряд преимуществ. Они демонстрируют впечатляюще низкие, по сравнению с ИСЭ, пределы
а
г
обнаружения (порядка 10~10-10~12М против 10~5-10~6М в случае ИСЭ) [1]. В отличие от ИСЭ нет необходимости в непосредственном контакте (к примеру, электрическом) со средством измерения аналитического сигнала, а также в отдельном элементе сравнения, что предоставляет гораздо более широкие, чем в случае ИСЭ, возможности миниатюризации. Поскольку отклик оптодов обусловлен диффузией во всём объёме, они менее чувствительны к поверхностным эффектам, чем ИСЭ, они также нечувствительны ко внешним электрическим наводкам, полям. В отличие от ИСЭ состав оптодной мембраны может быть оптимизирован для интересующего динамического диапазона.
Оптоды нашли широкое применение в клиническом анализе и исследовании биологических объектов (клеток и тканей) и представляют достойную альтернативу давно известным потенцио- и амперометрическим сенсорам. Попытки применения опто-дов для целей клинического анализа предпринимались начиная со второй половины 1980-х гг. [13, 33-37]. При помощи оптодов определяли содержание ионов калия, натрия, кальция, хлорид-ионов в сыворотке и плазме крови [22, 24, 34-36, 38]. По аналогии с известными со времён Кларка ферментными электродами были разработаны ферментные оптоды, селективные к нейтральным биологически значимым аналитам (мочевина, этанол, никотин) [39-41]. В работах [42-44] была продемонстрирована перспективность массивов оптодов для определения набора метаболитов, прежде всего глюкозы, in vivo и in vitro.
Во всех этих работах проблема pH-зависимости отклика оптода и невозможности определения активности отдельного иона решалась закреплением концентрации одного из ионов (обменивающегося либо необменно сорбирующегося) при помощи соответствующего фонового электролита/рН-буфера, либо, в случае биологических жидкостей, постоянство pH или концентрации какого-либо другого иона постулировали, обусловливая это сохранением гомеостаза. Тем не менее, количественных оценок перекрёстного влияния ионов на функцию друг друга не проводилось. Такая оценка тем более необходима, что узкие границы гомеостаза выполняются лишь для здорового организма. К примеру, нормальный рН крови (сыворотки крови, плазмы крови) лежит в диапазоне 7,35-7,45, но в случае серьёзных патологий может варьироваться от 6,9 до 7,85. Если при этом постулировать постоянство pH и определять, к примеру, калий или натрий при помощи оптодов, то ошибка может оказаться недопустимо высокой. Аналогичная ситуация имеет место и при определении самого рН крови. Даже при использовании Na/pH-селективного оптода (уровень натрия в крови очень высок — 135-145 мМ и обычно справедливо считается постоянным), для серьёзно больных пациентов существует вероятность сильного, но возможного на короткие сроки отклонения от нормы (в пределах 110-170 мМ). Тогда ошибка в определении pH при помощи оптодов может значительно превысить допустимую в клиническом анализе.
Несмотря на серьёзные ограничения, перечисленные ранее преимущества оптодов делают весьма заманчивым их использование для решения практических задач, поэтому количественные сведения о влиянии парного иона на функцию оптода чрезвычайно важны, особенно в диапазонах концентраций, характерных для биологических жидкостей. Такие сведения смогут дать ответ на вопросы, справедливо ли использование принципа гомеостаза при измерениях с оптодами и какие отклонения от него приводят к недопустимой в анализе ошибке. Если же при допустимых для организма отклонениях от нормальных концентраций ошибка превышает допустимую, то возникает практическая потребность в создании рН-независимых оптодов для определения активности отдельного иона. К сожалению, до сих пор этот вопрос не подвергался масштабному рассмотрению в этой области ионометрии [18].
Нами была поставлена задача оценить количественно перекрёстное влияние парных ионов на функцию оптода, особенно в диапазоне физиологических концентраций этих ионов. Для этого был выбран Na/pH-селективный оптод, перспективность которого для клинического анализа была доказана в [42-45]. Состав оптодной мембраны был оптимизирован для функционирования в физиологическом диапазоне pH при близком к норме уровне натрия. Было изучено влияние натрия на рН-функцию в широком и в узком (физиологическом) диапазонах его содержания, исследовано влияние pH на натриевую функцию для данного оптода. Получены основные характеристики датчика, поскольку ранее опубликованные работы [42-45] в большей степени сконцентрированы на доказательстве клинической примененимости сенсоров, и свойства Na/рН-перенос оптода в физиологическом диапазоне были представлены недостаточно полно. Нами более детально изучены такие характеристики, как динамический диапазон отклика, время отклика, воспрозводимость, гистерезис, количественно оценено разрешение предложенного оптода по рН. Экспериментальные данные обработаны при помощи модели (2), получены значения константы обмена Kexch.
Экспериментальная часть.
Реактивы. Натрий-селективный нейтральный ионофор бис[(12-краун-4)метиловый] эфир (додецилметил)малоновой кислоты (Sodiumionophore VI), нейтральный хромоио-нофор 9-(диэтиламино)-5-[(2-октидецил)имино]бензо[а]феноксазин (Chromoionophore III, ETH5350, pKa в пластифицированном ПВХ 13,4 [46]), тетра[3,5-бис(1,1,1,3,3,3-гек-сафтор-2-метокси-2-пропил)фенил]борат натрия (NaHFPB), пластификатор ди(2-этил-гексиловый)эфир себациновой кислоты (ДОС), поливинилхлорид высокой молекулярной массы (ПВХ), а также тетрагидрофуран (ТГФ) производства Fluka (Швейцария), класса Selectophore Grade. Циклогексанон (ЦГ) ч.д.а. производства «Вектон» (СПб, Россия).
Все водные растворы готовились на дистиллированной воде, используемые реактивы имели степень чистоты не ниже ч.д.а. В качестве кислотно-основной буферной системы использовался раствор 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоты (HEPES, рКа(1) = 3, рКа(2) = 7,55 [47]) класса ч.д.а., производства «Реагент» (Украина), концентрацией 0,01М. HEPES выбрана в качестве буферной системы, поскольку обеспечивает максимальную буферную ёмкость в исследуемом физиологическом диапазоне значений pH. Для измерений в широком диапазоне концентраций натрия (от 10~5М и выше) навеску HEPES растворяли в растворе фонового электролита — Ca(NO3)2 с ионной силой 0,16М, приготовленном из оттитрованного раствора моляльности 0,6897 моль/кг. Для измерений в узком (физиологическом) диапазоне концентраций натрия (0,11-0,18М) навеску HEPES растворяли в 0,1М растворе NaCl, приготовленном по навеске (о.с.ч., «Реахим», Украина). Нужную концентрацию NaCl в исследуемых растворах задавали добавлением аликвоты концентрированного раствора (3, 1, 0,1, 0,01, 10~3М) к приготовленной буферной системе с заданным рН; рН буферных растворов задавали, добавляя малые порции 1M растворов KOH и HCl. Значения рН растворов контролировали параллельно основным измерениям с оптодами. В растворах с недостаточной буферной ёмкостью рН задавали непосредственно перед началом измерения и измеряли сразу после него. Величины pH никогда не достигали значений, при которых начинает выпадать осадок Ca(OH)2 (ПР = = 5,5 • 106 [47]).
Приготовление мембранной композиции. Для приготовления pH/Na-селек-тивных мембран соотношение компонентов мембранной композиции (хромоио-нофор/натриевый ионофор) подобрали таким образом, чтобы динамический диапазон
рН-сенсоров покрывал физиологический диапазон изменений pH при физиологическом же уровне натрия.
Мембранная композиция с массой сухого вещества 100 мг была приготовлена растворением необходимых количеств ПВХ и ДОС (в массовом соотношении 1 : 2) в ТГФ. После этого добавлялись хромоионофор ETH5350 (20 ммоль/кг ДОС), натрий-селективный ионофор NaVI (120 ммоль/кг ДОС), NaHFPB (21 ммоль/кг ДОС) в виде аликвот более концентрированных растворов в ЦГ. Такой способ приготовления позволил избежать очень маленьких навесок и обеспечить высокую точность задания состава оптодной мембраны. Мембранная композиция представляла собой жидкость насыщенного рубинового цвета.
Оборудование. Значения pH растворов измеряли с помощью стеклянного электрода, насыщенного хлорсеребряного электрода сравнения («Измеритель», Белоруссия) и рН-метра — ионометра («Экотест-120», Россия). Калибровка рН-электрода проводилась 1-2 раза в неделю. Среднее значение углового коэффициента калибровочной зависимости составило 54,5±0,7 мВ, среднее стандартное значение ЭДС — 360,7±8 мВ (рассчитаны по результатам 7 месяцев наблюдений).
Регистрация аналитического сигнала (цвета) производилась при помощи фотокамеры Kodak (Easy Share DX 4530, КНР). Использовались линзы для макросъёмки (+1, +2, +4 диоптрии, Marumi, Япония).
Для измерения толщины оптодной мембраны использовался конфокальный микроскоп Olympus FV1000 (Olympus, США) и стереомикроскоп МСП-2 с объектом-микрометром (ЛОМО, Россия).
Аликвоты отбирали при помощи механических дозаторов («Ленпипет», Россия), мембранную композицию для изготовления оптодов отбирали микродозатором (объём дозирования 0,1-2,5 мкл, Biohit, Финляндия). В качестве источников света использовали лампы накаливания (Natural light, 60 Вт, Philips).
Технология изготовления и применения массива датчиков.
Изготовление массива датчиков. В качестве подложки использовали стеклянную пластинку с высверленными на заданную глубину отверстиями для нанесения четырёх оптодных мембран (диаметр сверла 1,2 мм). Неровности дна полученных углублений удалось в значительной степени сгладить обработкой HF. Диаметр отверстий составил 1,3 мм, глубина, согласно измерениям при помощи конфокального и стерео-микроскопов, составила в среднем 150-200 мкм. На рис. 2 представлено 3D-изобра-жение углубления для оптодной мембраны, полученное при помощи конфокального микроскопа.
Как известно, время отклика объёмных оптодов пропорционально квадрату их толщины [7] и значительно превышает время отклика ИСЭ, поскольку, в отличие от ИСЭ, обусловливается скоростью достижения равновесия во всём объёме полимерной мембраны. Время, за которое произойдёт 95 % изменения оптических свойств оптодной мембраны, можно рассчитать по уравнению
¿95 % = МЗ^, (3)
Dm
где d — толщина мембраны, см; Dm — коэффициент диффузии частиц в мембране, для пластифицированных ПВХ мембран обычно принимают Dm « 10~8 см2/с [8].
Зная диаметр оптода (диаметр отверстия в стеклянной подложке), задавшись временем отклика, можно рассчитать необходимую толщину сенсора и, соответственно, объём раствора мембранной композиции в ТГФ, необходимый для нанесения одной
y, мкм
Рис. 2. 3Б-изображение поверхности углубления в стеклянной подложке, предназначенного для нанесения оптодной мембраны (получено при помощи конфокального микроскопа
Olympus FV1000)
мембраны. Задавшись временем отклика 1,5 мин, по уравнению (3) получили толщину мембраны 10 мкм и объём раствора мембранной композиции в ТГФ порядка 0,1 мкл. Действительно, измеренные при помощи конфокального и стереомикроскопов значения толщины готовых мембран составили в области центра 10-15 мкм. В то же время за счёт капиллярного эффекта жидкая мембранная композиция распределялась в значительной степени вблизи стенок углубления и при высыхании образовала концентрическое утолщение (порядка 15-18 мкм). Таким образом, экспериментально измеренное время отклика для всего объёма мембраны, включая более толстую область, должно было составить, согласно соотношению (3), порядка 4,5-6 мин.
В качестве стандарта белого использовали дисперсию микрочастиц тефлона (размер ~ 5 мкм, Schaff Piano Supply Company, США) в пластифицированном ПВХ, чтобы обеспечить схожие свойства поверхности эталона с поверхностью оптодной мембраны.
Схема и фотография готового датчика, содержащего четыре оптодные мембраны для четырёх параллельных измерений, изображены на рис. 3.
Рис. 3. Схематическое изображение структуры массива оптических сенсоров (а); фотография готовых оптодных мембран, помещённых на стеклянную подложку (б)
Массив оптодов
. Стеклянная подложка
"^инза для
hv
Измерения и обработка данных. Фотографирование производили в затемнённой от дневного света комнате, при по- Белый фон стоянном освещении. Для этого источники света, штатив с сенсорами и фотокамеру устанавливали в определённом месте, и их расположение не изменяли в течение всего эксперимента. Камера была установлена снизу от массива сенсоров, капля раствора объёмом 0,3-0,5 мл наносилась сверху на четыре оптодные мембраны. За исключением опытов, направленных на исследование времени отклика оптодов, сигнал регистрировали через 10-15 мин после контакта оптода с раствором. Схема измерений представлена на рис. 4. Рис. 4. Схема измерений с массивом оптодов
Полученные изображения анализировали при помощи программного обеспечения ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Программа позволяет разложить цвет датчика на красную, синюю и зелёную составляющие (R, G, B) с оценкой соответствующих интен-сивностей (трёхмерный вектор RGB). Чтобы исключить влияние интенсивности источника света и чувствительности детектора камеры на сигнал, проводили нормализацию полученных значений интенсивности RGB на соответствующую компоненту эталона белого, к примеру, для интенсивности красного:
Rraw
Камера
макросъемки
R
W —
Rwhite
(4)
где Егзж, ЕкЪЛе — необработанные значения интенсивности красной компоненты, полученные для образца и для стандарта белого соответственно.
Затем, чтобы исключить возможные вариации интенсивности цвета от датчика к датчику и неоднородность цвета отдельной оптодной мембраны, проводили т. н. пифагорову нормализацию:
Еw
nR-
\] Щу + G'\V + Вц,г
(5)
где nR — конечное нормализованное значение интенсивности красного; Rw, Gw, Bw — нормализованные на эталон белого значения интенсивностей красной, зелёной и синей компонент цвета.
Обычно проводят нормализацию на сумму интенсивностей красной, синей и зелёной составляющих (к примеру, в ПО цифровых камер). В отличие от такого метода, пифагорова нормализация позволяет выразить цвет каждого сенсора трёхмерным вектором RGB единичной длины. По аналогии со спектрофотометрией такая нормализация вводит поправку на различную «толщину кюветы» в наших измерениях.
Расчёт коэффициентов активности проводили по уравнению 2-го приближения теории Дебая—Хюккеля. Полученные нормализованные данные обрабатывали при помощи программы OriginPro 8.1. Ошибку рассчитывали по параллельным измерениям с че-тырмя оптодами.
Результаты и обсуждение.
Характеристики оптических сенсоров. В ходе работы были созданы Na/pH-селективные оптоды с составом мембраны, оптимизированным для функционирования
в физиологическом диапазоне уровней pH и натрия. В большинстве экспериментов регистрировали изменение цвета оптодов в зависимости от pH при постоянной концентрации натрия. В оговоренном отдельно случае, чтобы подтвердить наличие также и натриевой функции оптодов, регистрировали оптический сигнал в зависимости от активности натрия при постоянном pH. Был проведён фитинг экспериментальных данных с использованием модели (2), удалось оценить значения константы обмена для данного типа оптодов.
На рис. 5 в чёрно-белом исполнении представлен цветовой переход оптодной мембраны от синего через зелёный в оранжевый при изменении pH от 5 до 9 (C(NaCl) = 0,15M). При рН < 5 ионообменная ёмкость мембраны, заданная ионной добавкой HFPB, практически целиком занята ионами водорода, и хромоионофор преимущественно находится в протонированной форме, которая имеет выраженную синюю окраску и максимум поглощения при 625 нм [44] (по другим данным, 645 нм [46]). Соответственно, натрий-селективный ионофор находится, в основном, в виде свободного лиганда. При рН > 9 хромоионофор в мембране практически полностью депротонирован, имеет выраженную оранжевую окраску с максимумом поглощения 480 нм [44] (или 500 нм [46]). Натриевый ионофор, в пределах ионообменной ёмкости мембраны, находится в форме комплекса с натрием. При промежуточных значениях pH в мембране присутствуют обе формы хромоионофора, а ионообменная ёмкость мембраны занята ионами водорода и ионами натрия в различном соотношении, зависящем от конкретного значения pH.
На рис. 6 представлены калибровочные зависимости для Na/pH-селективных оптодов, полученные в условиях, отвечающих физиологическим: C(NaCl) = 0,15M.
Экспериментальные калибровочные зависимости (обозначены точками) имеют S-об-разный вид в полном соответствии с моделью (2) и легко поддаются фитингу по этой модели (сплошные линии). Серым прямоугольником на графиках выделен диапазон pH, характерный для цельной крови и сыворотки крови человека. Видно, что динамический диапазон сенсоров (pH от 6 до 9) полностью покрывает интересующую область значений pH. Воспроизводимость сигнала от оптода к оптоду в области выполнения функции достаточно хорошая. Существенный гистерезис наблюдается лишь при низких значениях pH, вне границ динамического диапазона сенсоров. В интересующем физиологическом диапазоне pH гистерезис незначителен.
Рис. 6, а демонстрирует изменение интенсивностей индивидуальных компонент цвета: красной, синей, зелёной. Видно, что значительные изменения в зависимости от pH происходят лишь с красной и синей составляющими, интенсивность зелёной компо-
п
Рис. 5. Изменение цвета Na/pH-селективного оптода в чёрно-белой шкале при:
рН = 5 (а); рН = 7,5 (б); рН = 9 (в)
в
ненты практически не меняется. Постоянство зелёной компоненты для данного типа оптодов (с хромоионофором ETH5350) может служить критерием адекватности проведённого с оптодами эксперимента и надёжности соответствующей калибровочной зависимости, поскольку изобестическая точка спектра поглощения ETH5350 расположена в зелёной области видимого света [44-46].
На рис. 6, б представлена та же калибровочная зависимость, но в качестве ординаты выбрано соотношение интенсивностей красной и синей составляющих. Это позволило значительно расширить диапазон изменения оптического сигнала (практически до 1 по сравнению с 0,3-0,4 для индивидуальных интенсивностей) и снизить ошибку оценки pH по такой калибровочной зависимости (от ±0,13 до ±0,11 ед. pH в среднем по динамическому диапазону).
На рис. 7 представлен пример динамического отклика оптодов при переходе от рН= = 8,14 в раствор с pH = 7,46 и от рН = 7,46 в pH = 7,02.
б
0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3
& К
1,4 и 1,2-
cq 1,0-
I с 0,8-1
0,6 0,4
7
8
9 pH
pH
Рис. 6. Калибровочные зависимости для Na/pH оптода:
а) отклик на изменение pH индивидуальных компонент цвета (красной, синей, зелёной); б) отклик на изменение pH соотношения интенсивностей красной и синей компонент цвета; C(NaCl) = 0, 15М; заполненные символы — калибровка от низких значений pH к высоким, незаполненные символы — от высоких pH к низким (n = 4), сплошные линии — фитинг по уравнению (2), lg Kexch = —7,8
a б
& К
0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40
pH = 8,14
pH = 7,53 pH = 7,02
V
красный
1,1 1,0-
cq 0,9Н
I
с 0,8 4
0,7 0,6
pH = 8,14
pH = 7,53
pH = 7,02
I
—5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, мин
0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, мин
Рис. 7. Кривые динамического отклика оптодов:
а) динамический отклик индивидуальных компонент цвета (красной, синей, зелёной); б) динамический отклик соотношения интенсивностей красной и синей компонент цвета (n = 4); C(NaCl) = 0, 15М; символы — экспериментальные данные, линии — фитинг экспонентой (6)
Экспериментальные данные хорошо описываются экспоненциальной зависимостью вида
у = у0 + Ае~^, (6)
где т — постоянная времени.
Время достижения 95 % изменения сигнала рассчитывали по формуле
г = т| 1п(1 - 0,95) |. (7)
В табл. 1 сведены вместе все основные характеристики исследованных оптодов.
Таблица 1
Основные характеристики Na/pH-селективных оптодов на основе ЕТН5350 и ионофора NaVI (в мольном соотношении 1 : 6) в диапазоне физиологических значений рН и натрия
Динамический диапазон, ед. рН 6-9 (3)
Диапазон изменения сигнала 0,4-1,3 (0,9)
Относительная ошибка измерения (внутри динамического диапазона), % 6-7
Ошибка измерения рН (внутри физиологического диапазона), ед. рН 0,11
Время отклика, мин 5-6
(1,6 ±0,6) • 10~й (-7,8 ±0,2)
Компоненты Среднее время отклика, мин, при
цвета рН = 8,14^-7,53 рН = 7,53^-7,02
пК 7 6
пВ 6 5
пК/пВ 6 5
Таблица 2 В табл. 2 представлено рассчи-
Время отклика (95 %), рассчитанное по танное по формуле (7) время откли-формуле (7) из данных о динамическом ка
отклике красной и синей компонент цвета т;г
. ^ г,ч Из значений, приведенных
(пН, пВ) и из их соотношения (пН/пВ) „
в таол. 2, видно, что время отклика не увеличивается при используемом нами способе обработки сигнала: взятии отношения интенсивно-стей красного и синего вместо их индивидуальных значений. Время отклика для объемных оптодов определяется диффузией в полимерной мембране. Значения времени отклика, полученные по уравнению (3), согласуются с ожидаемыми для мембран толщиной 16-18 мкм, в полном соответствии с ранее измеренными значениями толщины. Тот факт, что синяя компонента цвета меняется быстрее красной в случае обоих рН-переходов, не соответствует уравнению (3), но может быть объяснен различием коэффициентов диффузии переносчиков заряда в мембране при изменении синей и красной составляющих, в то время как уравнение (3) предполагает равные для всех частиц коэффициенты диффузии в мембранной фазе.
Было также замечено, что изменение цвета мембраны происходит быстрее при переходе из раствора с рН = 7,5 в более кислый (7,0), чем в случае перехода из более щелочного с рН = 8,14 в нейтральный (7,53). При этом скачок по рН во втором случае даже более резкий. Такую разницу также можно объяснить кинетическими различиями в диффузии частиц — переносчиков заряда в мембране (катионов мембранных электролитов LNa+ и СН+, анионов НЕРВ-) или нейтральных частиц, образующих сопряженные им потоки (депротонированного хромоионофора, свободного натриевого ионофора).
Влияние содержания парного иона в растворе на отклик оптодов. Влияние концентрации натрия на рН-функцию оптодов и зависимость их натриевой функции от рН были изучены в широком диапазоне концентраций обоих ионов. присутствовал в растворах в виде хлорида. Все растворы содержали 0,16М Са(МО3)2 в качестве фонового (при низких содержаниях натрия) электролита.
На рис. 8, а представлены зависимости интенсивности от рН при различных концентрациях (10~4-1,5М). Видно, что при увеличении содержания натрия в растворе динамический диапазон рН отклика смещается в сторону более кислых растворов: если в случае С^аС1) = 10~4М (нижняя кривая) функция начинает проявляться только при рН = 8 + 8,5 и реализуется полностью за пределами экспериментально доступного щелочного диапазона рН, то при С^аС1) = 1,5М отклик наблюдается при рН от 5,5 до 8,5 (верхняя экспериментальная кривая). После рН = 8,5 функция при данной концентрации МаС1 начинает теряться, и при дальнейшем увеличении концентрации МаС1 можно предположить (в соответствии с уравнением (2)) такое сильное смещение динамического диапазона в сторону низких рН, что в экспериментально доступной области значений рН функции наблюдаться не будет (см. модельные кривые).
Вполне предсказуемо: влияние натрия на поведение оптодов в физиологическом диапазоне рН минимально при его низких (10~3-10~4М) концентрациях, т. е. там, где хромоинофор находится преимущественно в протонированной форме и отклик опто-дов на рН не выражен в полной мере. Чем более выражен отклик и выше содержание натрия, тем его влияние на отклик сильнее (0,01—1,5М). Дополняя рис. 8, а результатами компьютерного моделирования, проведённого согласно уравнению (2) при ^Кехс\1 = —8 и концентрациях МаС1, недоступных экспериментально (10М и выше), можно заметить, что и при повышении содержания натрия оптодная функция в физиологическом диапазоне рН утрачивается и влияние натрия снижается. В этом случае хромоионофор находится преимущественно в депротонированной форме, и изменение содержания натрия более неспособно вызвать изменение цвета мембраны. Таким образом, в полном соответствии с ожидаемыми результатами, согласно используемой модели отклика, влияние натрия на рН-функцию оптода максимально в том диапазоне рН и концентраций натрия, где эта функция наиболее выражена. В области с максимальным влиянием натрия изменение его содержания в 10 раз ведёт к ошибке измерения рН порядка 1 ед.
На рис. 8, б представлены калибровочные зависимости, искусственно переведённые в координаты интенсивность—^ а^а) при закреплённом рН. Очевидно, что оптод действительно обладает натриевой функцией, динамический диапазон которой сильно зависит от рН. Наблюдаемые закономерности этой зависимости аналогичны описанным для рис. 8, а.
Наличие натриевой оптодной функции проверили также экспериментально. Для этого провели эксперимент, эквивалентный по извлекаемой информации, но зеркально симметричный описанному выше: в растворе изменяли содержание натрия, а рН поддерживали постоянным. На рис. 9 изображены соответствующие калибровочные зависимости: интенсивности от ^ а^а) при постоянном рН, а также искусственно построенные по экспериментальным данным зависимости отклика от рН при закреплённом содержании натрия. Видно, что рис. 8, а и 9, б, 8, б и 9, а эквивалентны друг другу, аналогичны и наблюдаемые закономерности влияния рН на натриевую функцию.
Поскольку оптод является датчиком активности электролита, то его отклик однозначно определяется отношением активностей парных ионов (см. уравнение (2)) и, сохраняя термодинамическую строгость, можно утверждать, что вне зависимости от
1,5-
сч 1,0-
I
0,5
0,0
1,8 1,6 1,4 1,2 | 1,0^ ¡| 0,80,6 0,4 0,2 0,0
pн
5
7
pн
-2 lg
Рис. 8. Отклик оптодов в зависимости от содержания парного иона в растворе:
символы — экспериментальные данные, линии — фитинг либо (при отсутствии экспериментальных точек) результаты моделирования по уравнению (2), ^ Кехс^ = —8; а) экспериментально полученные и модельные зависимости интенсивности от рН при концентрациях КаС1 (снизу вверх) 10-4, 10-3, 10-2, 0,15, 1,5, 10, 102, 103, 104М, п = 4; б) искусственно полученные по этим данным зависимости интенсивности от ^ а,(КаС1) при различных рН
б
2,5 2,0 1,5
I
0,5 0,0
pH
6,5 7,5 8 9
с (№а)
-3
6,5 7,0 7,5
pн
8,0
8,5 9,0
Рис. 9. Отклик оптодов в зависимости от содержания парного иона в растворе: символы — экспериментальные данные, линии — фитинг по уравнению (2), ^ Кехс^ = —8; а) экспериментально полученные и модельные зависимости интенсивности от ^ а,(КаС1) при различных рН; б) искусственно полученные по этим данным зависимости интенсивности от рН при различных ^ а(КаС1)
б
а
0
а
0
фонового значения рН или концентрации натрия наборы кривых типа изображённых на рис. 8 или рис. 9, будут составлять единую зависимость в координатах интенсивность—^а(Ма)/а(Н). Действительно, рис. 10 демонстрирует пример такой проверки экспериментальных данных.
Влияние содержания натрия в пределах физиологического диапазона на рН-функцию. Была исследована возможность использования изучаемого Ма/рН-селективного оптода для прямого определения рН (либо косвенного определения глюкозы) в цельной крови и сыворотке крови без применения независимых методов оценки содержания натрия.
Поскольку диапазон концентраций натрия в названных жидкостях в норме достаточно узок (135-145 мМ), то кажется справедливым пренебрегать колебаниями уровня натрия при определении рН в крови и сыворотке сравнительно здорового человека. Тем не менее, в случае серьёзных патологий условие гомеостаза может нарушаться, и краткосрочные нелетальные колебания содержания натрия могут происходить в диапазоне 110-170 мМ. На рис. 11 представлены калибровочные зависимости оптода для определения физиологического рН (6,9-7,8) при различных уровнях натрия внутри краткосрочного нелетального диапазона. Видно, насколько высока неточность определения рН при постулировании постоянного значения концентрации натрия на уровне 140 мМ. Было подтверждено количественно, что если ошибка измерения рН внутри нормы (135-145 мМ), хотя и присутствует, не превышает 0,07 ед. рН, то при изменении уровня натрия в более широком диапазоне, характерном для многих патологий, пренебрежение этим изменением ведет к ошибке в 0,15 ед. рН, что не соответствует принятым клиническим стандартам.
«I
Рис. 10. Зависимость отклика Na/pH-селек-тивного оптода в растворах с переменным pH и различной концентрацией натрия от ^ а^/ян: символы — экспериментальные данные, линии — фитинг по уравнению
(2), ^ КехД = -8
1,2-, РН
• 10
1,0- ■ 9,5
о 8,3
0,8 □ 7,8
А 7,4
0,6- А 5,9
0,4
0,2 0,0 Л А
4 5 6
«МаЧ
1,2
1,0
0,8
|0,6 с
0,4 0,2 0,0
С(ШС1) . 170 тМ ° 145 тМ д 140 тМ ▼ 110 тМ
6,0 6,5
7,0 7,5 РН
8,0 8,5
0,9 0,8
ср 0,7 й 0,6
0,5 0,4
6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 РН
8,0 8,2
Рис. 11. Зависимость отклика pH-селективного оптода в растворах с различным содержанием натрия в пределах допустимого физиологического интервала:
символы — экспериментальные данные, линии — фитинг по уравнению (2), ^ Кехс^ = -8; а) зависимости интенсивности от pH при различных уровнях натрия, пустые символы — норма, заполненные символы — границы краткосрочного нелетального диапазона содержаний натрия; б) ошибка измерения pH, вызванная пренебрежением непостоянства уровня натрия внутри краткосрочного нелетального диапазона концентраций
б
а
Таким образом, область применения традиционных полимерных оптодных мембран в реальных образцах ограничена заведомо узкими диапазонами измеряемых концентраций, в других же случаях необходим независимый метод оценки концентрации одного из парных ионов. Другим, более перспективным путём, может стать создание принципиально нового класса оптодов, которые будут ориентированы на получение информации об активности отдельного иона, подобно ИСЭ в ячейках с жидкостным соединением.
Выводы. Динамический диапазон изготовленных и исследованных Na/рН-селек-тивных оптодов находится в интервале рН от 6 до 9 при постоянном физиологическом уровне натрия, что перекрывает физиологический диапазон pH. Экспериментально полученное время отклика оптода составило 5-6 мин при толщине мембраны 16-18 мкм, что соответствует значению, рассчитанному по уравнению (3). Сенсоры продемонстрировали хорошую, в пределах допустимой погрешности, воспроизводимость показаний от оптода к оптоду, при этом гистерезис отклика внутри динамического диапазона оказался незначительным. Было показано, что влияние натрия на рН-функцию в узком (физиологическом) диапазоне его концентраций можно не учитывать лишь в пределах нормы, при изменении же содержания натрия внутри более широкого диапазона соответствующая ошибка по рН становится больше допустимой. Таким образом, для клинического анализа представляет значительный интерес создание оптода, отклик которого будет определяться индивидуальной активностью отдельного иона.
Авторы благодарят лабораторию биомедицинских технологий университета Case Western Reserve (Кливленд, США) и лично профессора М. Грацля за любезно предоставленные реактивы и доступ к конфокальному микроскопу, а также канд. физ.-мат. наук А. И. Коробейникова за помощь в обработке экспериментальных данных.
Литература
1. BakkerE., Buhlmann P., PretschE. Carrier-based ion-selective electrodes and bulk optodes. 1. General characteristics // Chem. Rev. 1997. Vol. 97. P. 3083-3132.
2. Lubbers D., OpitzN. The pCO2-/pO2-optode: a new probe for measurement of pCO2 or pO2 in fluids and gases // Naturforsch. Biosci. 1975. Vol. 30. P. 532.
3. SeitzW. Chemical sensors based on fiber optics // Anal. Chem. 1975. Vol. 56. P. 16.
4. Charlton S., Fleming R., ZippA. Solid-phase colorimetric determination of potassium // Clin. Chem. 1982. Vol. 28. P. 1857.
5. MorfW., SeilerK., Lehmann B. et al. Mechanism, possibilities and limitations of carrier-based ion sensors // Ion-selective electrodes / ed. by E. Pungor. [W. p.]: Akademiai Kiado, 1989. Vol. 5. P. 115.
6. MorfW., SeilerK., S0rensenP., Simon W. New sensors based on carrier membrane systems: theory and practice // Ion-selective electrodes / ed. by E. Pungor. [W. p.]: Akademiai Kiado, 1989. Vol. 5. P. 141-152.
7. MorfW., SeilerK., Lehmann B. et al. Carriers for chemical sensors: design features of optical sensors (optodes) based on selective chromoionophores // Pure Appl. Chem. 1989. Vol. 61. P. 1613.
8. SeilerK., Simon W. Theoretical aspects of bulk optode membranes // Anal. Chim. Acta. 1992. Vol. 266. P. 73-87.
9. Weaver M., Harris J. In-situ fluorescence studies on aluminum ion complexation by 8-hyd-roxyquinoline covalently bound to silica // Anal. Chem. 1989. Vol. 61, N 9. P. 100-110.
10. Kawabata Y., Kamichika T., Imasaka T., Ishibashi N. Ion-selective optode using hexadecyl-acridine orange attached on poly(vinyl chloride) membrane // Anal. Chem. 1990. Vol. 62. P. 2054-2055.
11. Schaffar B., WolfbeisO. A calcium-selective optode based on fluorimetric measurement of membrane potential // Anal. Chim. Acta. 1989. Vol. 217. P. 1-9.
12. Janata J. Do optical sensors really measure pH? // Anal. Chem. 1987. Vol. 59. P. 1351-1356.
13. Marsoner H., Kroneis H., Offenbacher H., KarpfH. Optical sensors for pH and blood gas analysis // Physiology and Methodology of Blood Gases and pH / eds A. Maas et al. [W. p.]: IFCC Workshop, 1986. Vol. 6. P. 79-94.
14. WolfbeisO., OffenbacherH. Fluorescence sensor for monitoring ionic strength and physiological pH values // Sensors and Actuators. 1986. Vol. 9. P. 85-91.
15. Kosch U., Klimantl., Wolbeis O. Long-lifetime based pH micro-optodes without oxygen interference // Anal. Chem. 1999. Vol. 364. P. 48-53.
16. HuberH., Werner T., Krause C., WolfbeisO. Novel chloride-selective optode based on polymer — stabilized emulsion doped with a lipophilic fluorescent polarity-sensitive dye // Analyst. 1999. Vol. 124. P. 1617-1622.
17. Peterson J., Goldstein R., Fitzgerald R., Buckhold D. Fiber optic pH probe for physiological use // Anal. Chem. 1980. Vol. 52. P. 864.
18. Huber C., Werner T., Krause C., Wolfbeis O. Overcoming the pH dependency of optical sensors: a pH-independent chloride sensor based on co-extraction // Anal. Chim. Acta. 1999. Vol. 398. P. 137-143.
19. Charlton S., Fleming R., Zipp A. Solid-phase colorimetric determination of potassium // Clin. Chem. 1982. Vol. 28. P. 1857.
20. Gantzer M., Hemmes P., Wong D. Ion test means having a porous carrier matrix // Eur. Pat. Appl. 1985. Vol. 153. P. 641.
21. MorfW., Seiler K., Rusterholz B., Simon W. Design of a calcium-selective optode membrane based on neutral ionophores // Anal. Chem. 1990. Vol. 62. P. 738.
22. Hisamoto H., MiyashitaN., Watanabe K. et al. Ion sensing film optodes — disposable ion sensing probes for the determination of Na+, K+, Ca2+ and Cl_ concentrations in serum // Sensors Actuators (B). 1995. Vol. 29. P. 378.
23. KimS., ChoH., ChaG., Nam N. Microtiter plate-format optode // Anal. Chem. 1998. Vol. 70. P. 4860-4863.
24. Seiler K., Wang K., BakkerE. et al. Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma // Clin. Chem. 1991. Vol. 37. P. 1350.
25. Bychkova V., Shvarev A. Fabrication of micrometer and submicrometer-sized ion-selective optodes via a solvent displacement process // Anal. Chem. 2009. Vol. 10. P. 1021.
26. Bychkova V., Shvarev A., Zhou J. et al. Enzyme logic gate associated with a single responsive microparticle: scaling biocomputing to microsize systems // Chem. Commun. 2010. Vol. 46. P. 94-96.
27. Suzuki K., TohdaK., Tanda Y. et al. Fiber-optic magnesium and calcium ion sensor based on a natural carboxylic polyether antibiotic // Anal. Chem. 1989. Vol. 61. P. 382-384.
28. Seitz W. Sensors based on fiber optics // Anal. Chem. 1984. Vol. 56. P. 16-34.
29. Burke C., Polerecki L., MacCraithB. Design and fabrication of enhanced polymer waveguide platforms for absorption-based optical chemical sensors // Meas. Sci. Technol. 2004. Vol. 15. P. 1140-1145.
30. PuyolM., Salinas I., Garcesl. et al. Improved integrated waveguide absorbance optodes for ion-selective sensing // Anal. Chem. 2002. Vol. 74, N 14. P. 3354.
31. BualomC., Ngeontae W., Nitiyanontakit S. et al. Bulk optode sensors for batch and flow-through determinations of lead ion in water samples // Talanta. 2010. Vol. 82. P. 660-667.
32. Hisamoto H., Satoh S., Satoh K. et al. Theory and practice of rapid flow-through analysis based on ion-selective optode detection and its application to sodium ion determination // Anal. Chim. Acta. 1999. Vol. 396. P. 131-141.
33. Alder J., Ashworth D., Narayanaswamy R. et al. An optical potassium ion sensor // Analyst. London. 1987. Vol. 112. P. 1191.
34. Berry M., Mazzachi R., Pejakovic M., PeakeM. Enzymatic determination of potassium in serum // Clin. Chem. 1989. Vol. 35. P. 817.
35. Kumar A., Chapoteau E., Czech B. et al. Chromogenic ionophore-based methods for spec-trophotometric assay of sodium and potassium in serum and plasma // Clin. Chem. 1988. Vol. 34. P. 1709.
36. WangK., SeilerK., MorfW. et al. Characterization of potassium-selective optode membranes based on neutral ionophores and application in human blood plasma // Anal. Sci. 1990. Vol. 6. P. 715-720.
37. Lubbers D., OpitzN. Optical fluorescence sensors for continuous measurement of chemical concentrations in biological systems // Sensors and Actuators. 1983. Vol. 4. P. 641-654.
38. TanS., Hauser P., WangK. et al. Reversible optical sensing membrane for the determination of chloride in serum // Anal. Chim. Acta. 1991. Vol. 244. P. 151.
39. Koncki R., MohrG. J., Wolfbeis O. S. Enzyme biosensor for urea based on a novel pH bulk optode membrane // Biosensors & Bioelectronics. 1995. Vol. 10, N 8. P. 653-659.
40. ChoiM., Chung K., WuX. Nicotine derivate optode membrane with nonactin as ionopho-re // Talanta. 2002. Vol. 56. P. 1027-1038.
41. VolklK, Lubbers D., OpitzN. Continuous measurement of concentrations of alcohol using a fluorescence-photometric enzymatic method // Fresenius Z. Anal. Chem. 1980. Vol. 30. P. 162-163.
42. TohdaK., GratzlM. Micro-miniature autonomous optical sensor array for monitoring ions and metabolites 1: design, fabrication and data analysis // Anal. Sci. 2006. Vol. 22. P. 383-388.
43. Tohda K., Gratzl M. Micro-miniature autonomous optical sensor array for monitoring ions and metabolites 2: color responses to pH, K+ and glucose // Anal. Sci. 2006. Vol. 22. P. 937-941.
44. TohdaK., GratzlM. A Microscopic, continous, optical monitor for interstitial electrolytes and glucose // Chemphyschem. 2003. Vol. 4. P. 155-160.
45. Peshkova M., Krikorian A., Nair S. et al. In vitro point-of-care sensor and method of use // Intl. patent № WO/2012/021239, 2012.
46. BakkerE., LerchiM., RosatzinT. et al. Synthesis and characterization of neutral hydrogen ion-selective chromoionophores for use in bulk optodes // Anal. Chim. Acta. 1993. Vol. 278. P. 211-225.
47. DeanA. Lange's Handbook of Chemistry: 15th edition. [W. p.]: McGraw-Hill, Inc., 1999.
Статья поступила в редакцию 18 октября 2012 г.
